一種木質(zhì)纖維素類物質(zhì)聯(lián)產(chǎn)生物乙醇和普魯蘭糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用木質(zhì)纖維素類物質(zhì)聯(lián)產(chǎn)生物乙醇和普魯蘭糖的方法。纖維素類物質(zhì)經(jīng)堿法預(yù)處理、木聚糖酶酶解，固液分離后分別得到半纖維素水解液（木糖液）和固相殘?jiān)９滔鄽堅(jiān)俳?jīng)木質(zhì)素提取后得纖維素殘?jiān)?。木糖液直接用于普魯蘭糖發(fā)酵生產(chǎn)（得率≥0.29g普魯蘭糖/g木糖），纖維素殘?jiān)M(jìn)行同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。含普魯蘭糖發(fā)酵液使用纖維殘?jiān)l(fā)酵蒸餾所得乙醇進(jìn)行醇沉，提取精制得普魯蘭糖產(chǎn)品，純化過程中產(chǎn)生的含乙醇廢液與纖維素殘?jiān)掖及l(fā)酵液合并，經(jīng)蒸餾實(shí)現(xiàn)乙醇的回收利用。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)半纖維素和纖維素的充分利用和高值轉(zhuǎn)化，并且能夠節(jié)約利用資源，達(dá)到保護(hù)環(huán)境和提升經(jīng)濟(jì)效益的目的。
【專利說明】一種木質(zhì)纖維素類物質(zhì)聯(lián)產(chǎn)生物乙醇和普魯蘭糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于纖維物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用木質(zhì)纖維素類物質(zhì)聯(lián)產(chǎn)生物乙醇和普魯蘭糖的方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]木質(zhì)纖維素類物質(zhì)由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等三部分構(gòu)成，它是地球上儲(chǔ)存量最大、分布最為廣泛的可再生資源。近年來，隨著礦物質(zhì)燃料的日益枯竭，木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的利用受到人們的普遍重視。我國(guó)是一個(gè)傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)大國(guó)，纖維素類物質(zhì)的含量相當(dāng)豐富。但是長(zhǎng)久以來，這些資源未被合理利用，秸桿、甘蔗渣、玉米芯、稻草等富含纖維素類物質(zhì)的農(nóng)業(yè)廢料一般直接焚燒或丟棄處理，這種原始的處理方式不僅造成了巨大的資源浪費(fèi)，而且會(huì)給環(huán)境帶來極大的污染。采用微生物轉(zhuǎn)化的方式能夠提高木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的利用率。
[0003]生物乙醇生產(chǎn)是國(guó)際上最普遍的木質(zhì)纖維素生物煉制方式。傳統(tǒng)的生物乙醇生產(chǎn)技術(shù)不能將木質(zhì)纖維素類物質(zhì)中的半纖維素和纖維素有效分離，得到的水解液是五碳糖和六碳糖的混合液，受葡萄糖阻遏效應(yīng)，木糖乙醇發(fā)酵效率低等因素的影響，水解液中的木糖部分通常不能被有效利用。將木質(zhì)纖維素類物質(zhì)中的半纖維素和纖維素先分離，然后分別進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)已經(jīng)成為一個(gè)發(fā)展方向。已有分別利用木質(zhì)纖維素組分中的纖維素和半纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇和2，3-丁二醇的報(bào)道。但是，這兩種產(chǎn)物的附加值均不高，且2，3-丁二醇的分離純化工藝較為復(fù)雜，純化過程需要消耗大量能量。
[0004]出芽短梗霉，一種類酵母菌，能夠利用木糖生產(chǎn)價(jià)值很高的普魯蘭糖。普魯蘭糖是一種呈白色粉末狀的胞外同聚多糖。普魯蘭糖是由α- (1，4)和α- (1，6)糖苷鍵構(gòu)成的麥芽三糖不斷聚合而成的。規(guī)整的化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予普魯蘭糖特殊的性質(zhì)，它在化工、食品、醫(yī)藥等行業(yè)都有著廣泛的應(yīng)用。出芽短梗霉可利用碳源較廣，除了木糖以外，葡萄糖、乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等都能被它利用。因而，將出芽短梗霉用于半纖維素水解液的生物轉(zhuǎn)化具有天然的優(yōu)勢(shì)，能夠最大限度的將半纖維素水解液中的糖類物質(zhì)加以轉(zhuǎn)化。普魯蘭糖的純化工藝也相對(duì)簡(jiǎn)便，但是在純化過程中需要消耗大量的乙醇，這就使得普魯蘭糖的生產(chǎn)成本過于聞昂。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0005]本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)行纖維素類物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化過程中木糖無法有效利用，普魯蘭糖生產(chǎn)成本過高等問題，提供了一種木質(zhì)纖維素類物質(zhì)聯(lián)產(chǎn)生物乙醇和普魯蘭糖的方法。
[0006]本發(fā)明技術(shù)方 案包括如下步驟:纖維素類物質(zhì)經(jīng)堿法預(yù)處理、木聚糖酶酶解，固液分離后分別得到低毒的半纖維素水解液(木糖液)和纖維素殘?jiān)?。半纖維素水解液直接用于普魯蘭糖發(fā)酵生產(chǎn)，纖維素殘?jiān)M(jìn)行同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇。含普魯蘭糖發(fā)酵液使用纖維殘?jiān)l(fā)酵蒸餾所得乙醇進(jìn)行醇沉，提取精制得普魯蘭糖產(chǎn)品，純化過程中產(chǎn)生的含乙醇廢液與纖維素殘?jiān)掖及l(fā)酵液合并，經(jīng)蒸餾實(shí)現(xiàn)乙醇的回收利用。
[0007]具體步驟如下:
[0008]第一、半纖維素水解液制備:
[0009]纖維物質(zhì)原料除雜、粉碎至20-30目后，按固液比為1:12-1:15 (g/mL)的量加入0.5-0.8%的NaOH溶液，40 °C條件下預(yù)處理l_3h。將預(yù)處理后的纖維素類物質(zhì)洗至中性，按固液比1:15-1:18 (g/mL)將原料投入pH4.5-5.5的酶解緩沖水溶液中，按100-200IU/g原料加入市售木聚糖酶，同時(shí)添加表面活性劑RH (鼠李糖脂)0.005-0.01%、Tween-800.15-0.35%、PEG60000.2-0.35%、Triton X-100 (曲拉通 X-100) 0.1-0.30%、并于38-40°C條件下酶解36-72h，將酶解體系進(jìn)行固液分離，得半纖維素水解液和固相殘?jiān)?[0010]纖維物質(zhì)為甘蔗渣、玉米芯、玉米秸桿、稻草、麥桿中至少一種。
[0011]第二、木質(zhì)素的提取與纖維素殘?jiān)苽?
[0012]將第一步所得固相殘?jiān)凑展桃罕葹?:12-1:18 (g/mL)的比例加入木質(zhì)素提取混合液，混合液的組分為甲酸:乙醇為9:l(v/v)，溫度為80-90°C，反應(yīng)時(shí)間為2-4h。木質(zhì)素提取之后的殘?jiān)礊槔w維素殘?jiān)?br> [0013]第三、半纖維素水解液普魯蘭糖發(fā)酵:
[0014]將第一步得到的半纖維素水解液蒸發(fā)濃縮，調(diào)整初始糖濃度，補(bǔ)充硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、酵母浸粉后，將出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) CGMCCN0.7154種子液體按5-10%接種量接入到發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度26-28°C，轉(zhuǎn)速200-400r/min，通氣量1.0-2.5vvm，pH控制在5.0-5.5，罐壓0.02-0.03Mpa，培養(yǎng)24h后加入二硫蘇糖醇至濃度為1.0-2.0mM。發(fā)酵過程通過流加混合氮源控制溶氧，所述流加混合氮源中酵母粉和硫酸銨的濃度均為10g/L，當(dāng)溶氧水平上升到60-70%以上時(shí)，向發(fā)酵罐中添加適量的混合氮源，使得溶氧水平降至40-45%以下，在整個(gè)補(bǔ)料過程中，酵母粉和硫酸銨按1:1的比例流加，培養(yǎng)7d結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心后，固液分離。上清液加入2倍體積的無水乙醇將普魯蘭糖粗品沉淀出來，再通過5000r/min離心后，固液分離。
[0015]第四、纖維素殘?jiān)教腔l(fā)酵生產(chǎn)乙醇:向纖維素殘?jiān)醒a(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)KH2P04、硫酸銨、酵母浸粉添加市售纖維素酶,2-5%釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2.0119種子液和0.5_1%CGMCC N0.7377種子液，于30_35°C發(fā)酵15-20-小時(shí)，隨后提高溫度到38-41°C，繼續(xù)發(fā)酵30-40小時(shí)結(jié)束發(fā)酵。所得發(fā)酵液經(jīng)蒸餾后得到乙醇。
[0016]第五、將第三步所得的含有乙醇的廢液和第四步所得的含有乙醇的發(fā)酵液混合，通過蒸餾的方法實(shí)現(xiàn)乙醇的回收利用。
[0017]有益效果:
[0018]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果是:第一，通過將木質(zhì)纖維素類物質(zhì)中的半纖維素和纖維素分離，并分別轉(zhuǎn)化為普魯蘭糖和乙醇，實(shí)現(xiàn)了纖維素類物質(zhì)的的高值轉(zhuǎn)化。第二，普魯蘭糖的純化過程需要大量乙醇，將普魯蘭糖的生產(chǎn)同乙醇的生產(chǎn)過程偶聯(lián)起來，能夠有效降低普魯蘭糖生產(chǎn)成本，并且乙醇也可以重復(fù)利用，這樣就能夠節(jié)約資源，實(shí)現(xiàn)纖維素類物質(zhì)清潔、高效的生物轉(zhuǎn)化。
[0019]普魯蘭糖發(fā)酵過程添加二硫蘇糖醇可有效促進(jìn)普魯蘭糖合成。添加二硫蘇糖醇后，出芽短梗霉的菌體形態(tài)更多的呈現(xiàn)酵母樣細(xì)胞，酵母樣細(xì)胞的增加對(duì)普魯蘭糖的合成起到促進(jìn)作用，另外二硫蘇糖醇還可能通過刺激脂載體合成和保護(hù)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性而促進(jìn)普魯蘭糖的生物合成。
[0020]普魯蘭糖發(fā)酵過程通過流加混合氮源，有效控制了溶氧水平反彈，使得普魯蘭糖合成主要發(fā)生在發(fā)酵前期及中期，從而大幅度提高了普魯蘭糖發(fā)酵水平，普魯蘭糖產(chǎn)量較未流加混合氮源時(shí)提高了 20%以上。
[0021]纖維素殘?jiān)捎脙呻A段變溫混合酵母發(fā)酵，低溫階段有利于常規(guī)酵母乙醇發(fā)酵，同時(shí)利于耐高溫酵母菌體增殖、積累生物量，為高溫發(fā)酵做準(zhǔn)備，高溫階段可充分發(fā)揮耐高溫酵母的優(yōu)勢(shì)，同常規(guī)酵母發(fā)酵相比，乙醇含量提高約10%，發(fā)酵時(shí)間縮短了 60h。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0022]圖1為本發(fā)明工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】:
[0023]下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024]本發(fā)明提供的釀酒酵母菌株是具有耐高溫性能的釀酒酵母菌株，具體為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SY-5-lIL0該菌已于2013年3月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為:中國(guó)北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編100101)， 保藏編號(hào)為CGMCC N0.7377。
[0025]所述釀酒酵母菌株在其它發(fā)酵性能不受影響的情況下，在高溫40°C發(fā)酵條件下乙醇產(chǎn)量為12.2% (v/v)，較出發(fā)菌株乙醇產(chǎn)量相比提高了 34.1%。
[0026]所述釀酒酵母菌株的選育方法，具體可以通過人工誘變出發(fā)菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC2.0119 (中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，公眾可以通過該保藏管理委員會(huì)獲得出發(fā)菌株2.0119)，篩選出若干耐高溫釀酒酵母突變株作為正向突變株文庫，將該文庫通過三輪高效生孢雜交實(shí)現(xiàn)三輪基因組重排來獲得。
[0027]上述誘變和基因組重排方法可以用常規(guī)的方法獲得，這些方法已有許多文獻(xiàn)報(bào)道，如 Lihua Hou, Novel methods of genome shuffling in Saccharomyces cerevisiae [J].Biotechnology Letters, 2009, 31 (5): 671-677。與改造耐受性相關(guān)基因的分子育種方法相t匕，這種通過傳統(tǒng)誘變育種和新型基因組重排集合相結(jié)合的方法，效率和效果均有明顯優(yōu)勢(shì)；且菌株比基因組定向改造得到的突變株穩(wěn)定性更高，更有利于工業(yè)化應(yīng)用。
[0028]本發(fā)明所提供的構(gòu)建上述釀酒酵母菌株的方法是，先將出發(fā)菌株經(jīng)傳統(tǒng)紫外誘變，獲得基因型多樣的突變株群體；以38°C高溫培養(yǎng)為初篩條件，篩得的菌株以TTC (氯化三苯基四氮唑)法進(jìn)行復(fù)篩，經(jīng)復(fù)篩后得到的突變株再進(jìn)行高溫發(fā)酵實(shí)驗(yàn)測(cè)試產(chǎn)乙醇能力，最終從中篩選出一定數(shù)量的相對(duì)于親本高溫發(fā)酵性能有所提升的突變株，建立用于基因組重排的原始正向突變株文庫。對(duì)釀酒酵母的高效生孢、雜交等基因組重排條件進(jìn)行優(yōu)化。在該條件下，對(duì)原始正向突變株文庫進(jìn)行三輪基因組重排，每輪重排后，選出高溫下產(chǎn)乙醇能力有提高的重排株作為下一輪基因組重排的正向突變株文庫。每輪重排之后在高溫發(fā)酵條件下篩選獲得乙醇產(chǎn)量最高的基因組重排最優(yōu)菌，最終三輪基因組重排后獲得高溫發(fā)酵條件下乙醇產(chǎn)量最高的釀酒酵母菌株。
[0029]耐高溫釀酒酵母菌株的選育
[0030]( I)傳統(tǒng)誘變育種建立突變株文庫
[0031]挑取一環(huán)酵母菌斜面培養(yǎng)物接種于5mL的YPD液體培養(yǎng)基中，30°C、IOOrpm培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，離心收集菌體并用無菌生理鹽水洗滌兩次，重懸細(xì)胞將濃度調(diào)至IO6個(gè)/mL。取4mL菌懸液于Φ70πιπι培養(yǎng)皿中，用15W紫外燈，距培養(yǎng)皿內(nèi)菌液高度30cm進(jìn)行照射，紫外照射后的菌液置于YPD液體中于30°C、IOOrpm培養(yǎng)4h后，取適當(dāng)稀釋后涂于YPD培養(yǎng)基平板上。對(duì)菌液照射不同的時(shí)間(Os，5s，10s, 20s, 30s, 40s, 50s, 60s, 70s, 80s),分別稀釋涂板培養(yǎng)兩天，待菌落長(zhǎng)出來，對(duì)平板上的菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算致死率，繪制基于不同照射時(shí)間的致死率曲線(如圖1所示)。故選定40s作為最終誘變時(shí)間。按照以上誘變方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行人工紫外誘變，將誘變之后的菌液經(jīng)30°C、IOOrpm培養(yǎng)4h后涂布到Y(jié)PD平板進(jìn)行初篩。
[0032]將誘變后得到的菌液稀釋后涂布YPD平板，于高溫培養(yǎng)條件進(jìn)行初篩后，挑出其中較大的菌落于TTC平板進(jìn)行復(fù)篩，將篩得的突變株接種于玉米粉水解液中于40°C溫度下靜置發(fā)酵三天，檢測(cè)發(fā)酵液酒精度。選取23株產(chǎn)酒度高于出發(fā)菌株的突變株，建立突變株文庫。
[0033]所述玉米粉水解液的制備 方法如下:將1500g玉米粉加入4500mL65~70V的自來水，放置20min，使玉米粉顆粒充分吸水膨脹。加入液化酶(a-淀粉酶)0.9mL，在85~90°C下液化1.5h。液化完成后，降溫至60°C，加入糖化酶3mL。在55_60°C下糖化20h。將糖化液用濾布過濾，得到澄清濾液，即為玉米水解液，煮沸10分鐘冷卻待用。
[0034](2)基因組重排
[0035]將突變株文庫的細(xì)胞群體都接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，在30°C，180rpm下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心收集細(xì)胞。用無菌水將菌體洗凈，隨后將菌泥接入到預(yù)產(chǎn)孢培養(yǎng)基(10g/LKAc,10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨)中，28°C，200rpm培養(yǎng)12h，離心收集菌體。用無菌水將菌體洗三次后將所得菌泥接種到高效液體生孢培養(yǎng)基(lOg/LKAc，lg/L酵母提取物，0.5g/L葡萄糖,50mg/L腺嘌呤，100mg/L組氨酸,50mg/L尿嘧唳，100mg/L色氨酸，100mg/L亮氨酸)中，28°C，200rpm下培養(yǎng)5d。將完成高效生孢過程的菌液離心收集細(xì)胞，用2%的蝸牛酶液(加入2.5%的β -巰基乙醇)將細(xì)胞重懸，于30°C，180rpm處理12h，離心收集菌體，用等量的
0.5% (V/V)的Triton X-100重懸，用超聲波震蕩該體系，使子囊壁充分破裂并釋放出孢子，期間不斷觀察破壁效率，待視野中無二倍體細(xì)胞時(shí)，終止超聲破碎，用無菌水將菌體洗三次，重懸于0.5% (V/V)的Triton X-100。將一定的孢子菌懸液涂布到Y(jié)B)培養(yǎng)基中，置于30°C、100rpm培養(yǎng)24h以上，使細(xì)胞充分雜交，由此完成第一輪基因組重排。收集細(xì)胞，并將其涂布在YI3D平板上，40°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，從平板上挑取較大的菌落，繼續(xù)用TTC法進(jìn)行復(fù)篩，將復(fù)篩之后得到的突變株接種于玉米粉水解液中于40°C溫度下靜置發(fā)酵三天，檢測(cè)發(fā)酵液酒精度，選取若干株產(chǎn)酒度進(jìn)一步提高的菌株，用于構(gòu)建第二輪基因組重排的突變株文庫。
[0036]按照上述步驟，將新一輪構(gòu)建的突變株文庫的細(xì)胞群體進(jìn)行產(chǎn)孢、孢子純化、雜交，進(jìn)行第二、三輪基因組重排，并在第三輪基因組重排后，篩選出在高溫發(fā)酵條件下產(chǎn)酒度最聞的基因組重排株。
[0037]出芽短梗霉AY82，能以木糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭糖，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到
16.61g/L，5L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到16.23g/L。
[0038]出芽短梗霉AY82利用木糖生產(chǎn)普魯蘭糖的方法，包括如下步驟:
[0039]種子液的制備:
[0040]斜面菌種經(jīng)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)獲得種子液；
[0041]發(fā)酵培養(yǎng):將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)在搖瓶或發(fā)酵罐中進(jìn)行；所述發(fā)酵培養(yǎng)基以木糖為主要碳源，添加其他氮源和微量元素組成。
[0042]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:木糖40-80g/L、(NH4) 2S040.8-1.2g/L、K2HP044_6g/L、MgSO4.7H200.2-0.4g/L、NaC12-4g/L、酵母浸粉 0.6-1.0g/L, 121 °C 高壓蒸汽滅菌 20min。
[0043]所述搖瓶發(fā)酵還可以用木糖母液培養(yǎng)基，組成為:以木糖母液替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的木糖，所述木糖母液組成成份如下:木糖35-40%，阿拉伯糖8-16%，半乳糖9-15%，葡萄糖8-11%，其余為水；稀釋至木糖母液培養(yǎng)基中的總糖含量為50g/L。
[0044]所述搖瓶發(fā)酵還可以用半纖維素水解液培養(yǎng)基，組成為:以半纖維素水解液替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的木糖，所述半纖維素水解液組成成份如下:木糖70%，葡萄糖12%，阿拉伯糖7%,其余為水;濃縮至半纖維素水解液培養(yǎng)基中的總糖含量為50g/L。
[0045]搖瓶發(fā)酵條件為:發(fā)酵培養(yǎng)基裝量20%，接種量6-10%，搖床轉(zhuǎn)速180-240r/min，溫度 26-30°C，初始 ρΗ6.0-6.5，發(fā)酵時(shí)間為 144_168h。
[0046]發(fā)酵罐發(fā)酵條件為:接種量6-8%，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量60-70%，培養(yǎng)溫度26_28°C，轉(zhuǎn)速 200-300r/min，通氣量 1.0-1.5vvm, pH 控制在 5.5±0.1，罐壓 0.03Mpa，培養(yǎng) 7d 結(jié)束發(fā)酵。
[0047]本發(fā)明所述利用木糖生產(chǎn)普魯蘭糖的出芽短梗霉AY82 (AureobasidiumPullulanAY82),已于2013年I月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7154，保藏地址:中國(guó)北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編:100101o
[0048]以出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)CGMCC3.00837為出發(fā)菌株，選擇致死率為82.4%的紫外誘變劑量(照射5min)對(duì)出芽短梗霉進(jìn)行誘變，將誘變后的菌液稀釋后均勻涂布于高濃度木糖平板(木糖濃度100g/L)上，30°C避光培養(yǎng)4-5d后挑取突變株。將突變株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)復(fù)篩，發(fā)酵168h后測(cè)定普魯蘭糖生成量，與出發(fā)株做對(duì)照，得到一株利用木糖高產(chǎn)普魯蘭糖的突變菌株AY82，普魯蘭糖產(chǎn)量較出發(fā)菌株有大幅提升，發(fā)酵結(jié)果見表1。 [0049]表1突變菌株AY82與出發(fā)菌株普魯蘭糖生成量比較
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種木質(zhì)纖維素類物質(zhì)聯(lián)產(chǎn)生物乙醇和普魯蘭糖的方法，包括如下步驟: 第一、半纖維素水解液制備:纖維類物質(zhì)原料除雜、粉碎至20~30目后，按固液比為1:12~1:15的量加入0.5~0.8%的NaOH溶液，40°C條件下預(yù)處理I~3h ;將預(yù)處理后的纖維素類物質(zhì)洗至中性，按固液比1:15~1:18將原料投入pH4.5~5.5的酶解緩沖水溶液中，按100~200IU/g原料加入市售木聚糖酶，同時(shí)添加表面活性劑RH0.005~0.01%、Tween-800.15 ~0.35%、PEG60000.2 ~0.35%、Triton X-100 (曲拉通 Χ_100)0.I ~0.30%、并于38~40°C條件下酶解36~72h，將酶解體系進(jìn)行固液分離，得半纖維素水解液和固相殘?jiān)? 第二、木質(zhì)素的提取與纖維素殘?jiān)苽?將第一步所得固相殘?jiān)凑展桃罕葹?:12~1:18的比例加入木質(zhì)素提取混合液,溫度為80~90°C,反應(yīng)時(shí)間為2~4h ;木質(zhì)素提取之后的殘?jiān)礊槔w維素殘?jiān)? 第三、半纖維素水解液普魯蘭糖發(fā)酵:將第一步得到的半纖維素水解液蒸發(fā)濃縮，調(diào)整初始糖濃度，補(bǔ)充硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、酵母浸粉后，將出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) CGMCC N0.7154種子液體按5-10%接種量接入到發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度26~28°C，轉(zhuǎn)速200~400r/min，通氣量1.0~2.5vvm, pH控制在5.0~5.5，罐壓0.02~0.03Mpa,培養(yǎng)24h后加入二硫蘇糖醇至濃度為1.0~2.0mM ;發(fā)酵過程通過流加混合氮源控制溶氧，當(dāng)溶氧水平上升到60~70%以上時(shí)，向發(fā)酵罐中添加適量的混合氮源，使得溶氧水平降至40~45%以下，培養(yǎng)7d結(jié)束發(fā)酵；發(fā)酵液分離醇沉再分離獲得普魯蘭糖粗品； 第四、纖維素殘?jiān)?同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇:向纖維素殘?jiān)醒a(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)KH2P04、硫酸銨、酵母浸粉添加市售纖維素酶，2~5%釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2.0119種子液和0.5_1%CGMCC N0.7377種子液，于30_35°C發(fā)酵15-20-小時(shí)，隨后提高溫度到38-41°C，繼續(xù)發(fā)酵30-40小時(shí)結(jié)束發(fā)酵；所得發(fā)酵液經(jīng)蒸餾后得到乙醇； 第五、將第三步所得的含有乙醇的廢液和第四步所得的含有乙醇的發(fā)酵液混合，蒸餾法回收利用乙醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述木質(zhì)纖維素類物質(zhì)聯(lián)產(chǎn)生物乙醇和普魯蘭糖的方法，其特征在于，所述半纖維素水解液制備中添加表面活性劑RH0.005%,Tween-800.25%、PEG60000.25%、Triton X-100 (曲拉通 X-100) 0.15%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述木質(zhì)纖維素類物質(zhì)聯(lián)產(chǎn)生物乙醇和普魯蘭糖的方法，所述木質(zhì)素提取混合液組成比例為甲酸:乙醇為9:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述木質(zhì)纖維素類物質(zhì)聯(lián)產(chǎn)生物乙醇和普魯蘭糖的方法，所述發(fā)酵罐水平甘蔗渣半纖維素水解液普魯蘭糖發(fā)酵中，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:半纖維素水解液濃縮至木糖濃度為 50g/L、(NH4) 2S041.2g/L、K2HP046g/L、MgSO4.7H200.4g/L、NaC12g/L、酵母浸粉1.0g/L。121°C高壓蒸汽滅菌20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述木質(zhì)纖維素類物質(zhì)聯(lián)產(chǎn)生物乙醇和普魯蘭糖的方法，半纖維素水解液普魯蘭糖發(fā)酵:培養(yǎng)24h后加入二硫蘇糖醇至濃度為1.0mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述木質(zhì)纖維素類物質(zhì)聯(lián)產(chǎn)生物乙醇和普魯蘭糖的方法，半纖維素水解液普魯蘭糖發(fā)酵:流加的氮源為混合氮源，酵母粉和硫酸銨的含量按照1:1的比例配制，濃度均為10g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述木質(zhì)纖維素類物質(zhì)聯(lián)產(chǎn)生物乙醇和普魯蘭糖的方法，在纖維素殘?jiān)教腔l(fā)酵生產(chǎn)乙醇步驟中:采用雙階段控制溫度、混菌發(fā)酵，接入5%的常規(guī)酵母CGMCC2.0119和1%的耐高溫酵母CGMCC N0.7377，發(fā)酵前16h溫度控制在30°C，隨后提高至40°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述的纖維物質(zhì)為甘蔗渣、玉米芯、玉米稻桿、稻草、麥桿中至少一種。
9.一種利用纖維素殘?jiān)教腔l(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法:向纖維素殘?jiān)醒a(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)KH2P04、硫酸銨、酵母浸粉添加市售纖維素酶,2~5%釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) CGMCC2.0119 種子液和 0.5_1%CGMCC N0.7377 種子液，于 30-35 °C 發(fā)酵15-20-小時(shí)，提高溫度到38-41°C，繼續(xù)發(fā)酵30-40小時(shí)結(jié)束發(fā)酵；所得發(fā)酵液經(jīng)蒸餾后得到乙醇。
【文檔編號(hào)】C12P7/08GK103993042SQ201410008525
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月7日
【發(fā)明者】陳葉福, 肖冬光, 郭建, 董健, 李月強(qiáng), 郭學(xué)武 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)