一種木瓜蛋白酶制劑及固定化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種木瓜蛋白酶制劑及固定化方法，包括如下步驟：（1）將纖維素納米晶基材分散在pH為5-9的緩沖溶液中，配置成基材溶液；（2）將（1）中所得的基材溶液與木瓜蛋白酶溶液或木瓜蛋白酶漿狀物混合，在0-35℃振蕩混合1-60min，得到混合懸濁液；（3）將（2）所得的混合懸濁液與聚丙烯酰胺溶液混合，震蕩1-60min；（4）將（3）中所得的固定化木瓜蛋白酶洗滌后冷凍干燥即得。本發(fā)明具有固定化木瓜蛋白酶固定化效率高、酶活回收率高，操作簡便，條件溫和等優(yōu)點。
【專利說明】一種木瓜蛋白酶制劑及固定化方法
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種木瓜蛋白酶固定化方法及酶制劑。
【背景技術】
[0002]纖維素是世界上最豐富的天然高分子聚合物之一，對纖維素的高附加值利用是國內外的研究熱點。纖維素納米晶體具有聞結晶度，聞機械強度，大比表面積等性能，在食品、醫(yī)藥、生物(酶的固定化)、新能源等領域有較好的應用前景。
[0003]目前酶固定化方法常用的用雙功能團試劑對酶和載體進行交聯(lián)，如戊二醛、甲醛、以及二亞胺類試劑，其中二醛類交聯(lián)劑成本較低，但反應激烈，酶與載體質量比低(18.Smg(酶)/g (載體)Gulay Bayramoglu, B.Filiz Senkal, Meltem Yilmaz, M.Yakup Arica.1mmobilization and stabilization of papain on poly (hydroxyethyl methacrylate -ethylenglycol dimethacrylate)beads grafted with epoxy functional polymerchains via surface-1nitiated-atom transfer radical polymerization (S1-ATRP).Bioresource Technology.Volumel02, Issue21, 2011, 9833 - 9837),酶固定化效率不高，增加了制備成本，另一方面，二亞胺類試劑價格較高，交聯(lián)時間較長(12_24h活化，2h交聯(lián))，步驟繁復(Khaled A.Mahmoud, Edmond Lam, Sabahudin Hrapovic, and John H.T.Luong.Preparation of Well-Dispersed Gold/Magnetite Nanoparticles Embedded onCellulose Nanocrystals for Efficient Immobilization of Papain Enzyme.ACS App1.Mater.1nterfaces2013, 5,4978-4985)。因此，有必要發(fā)明一種操作簡單，酶固定化效率高，反應條件溫和的反應。

【發(fā)明內容】

`[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種簡單的基于靜電自組裝技術的固定化方法，形成了纖維素基材-酶-丙烯酰胺三層結構的固定化酶。
[0005]一種木瓜蛋白酶固定化方法，包括如下步驟:
[0006]( I)將纖維素納米晶基材分散在pH為5-9的緩沖溶液中，配置成基材溶液；
[0007](2)將(I)中所得的基材溶液與木瓜蛋白酶溶液或木瓜蛋白酶漿狀物混合，在0-35°C振蕩混合l_60min,得到混合懸池液；
[0008](3)將(2)所得的混合懸濁液與聚丙烯酰胺溶液混合，震蕩l_60min ；
[0009](4)將(3)中所得的固定化木瓜蛋白酶洗滌后冷凍干燥即得。
[0010]所述步驟(1)中的纖維素納米晶基材為將纖維素材料通過硫酸水解所得到纖維素納米晶體。
[0011]所述聚丙烯酰胺與木瓜蛋白酶的質量比為0.11~2。
[0012]所述木瓜蛋白酶與基材的質量比為1: (10-100)。
[0013]所述步驟(2)、(3)中震蕩速率為100_500rpm。
[0014]所述步驟(2)中木瓜蛋白酶包括木瓜蛋白酶酶粉、胞外產木瓜蛋白酶或細胞破壁后含木瓜蛋白酶的發(fā)酵液。
[0015]所述纖維素材料為微晶纖維素、纖維素纖維和棉花中的一種或兩種以上。
[0016]本發(fā)明原理:纖維素材料經過硫酸水解生成纖維素納米晶后，其表面糖鏈上的活性羥基部分被酸(優(yōu)選硫酸)酯化，因酸根帶有負電荷，因此，酸水解纖維素納米晶表面帶有負電荷。木瓜蛋白酶在ph〈7時，酶蛋白表面帶有部分正電荷，在水溶液中，能與帶負電荷的纖維素納米晶發(fā)生靜電自組裝，形成表面帶部分正電荷的酶-纖維素納米晶復合物。聚丙烯酰胺在PH5-9范圍內帶有負電荷，能與上述帶部分正電荷的酶-纖維素納米晶復合物再一次發(fā)生靜電自組裝，從而實現(xiàn)酶的固定化。
[0017]本發(fā)明相對于具有以下優(yōu)點:
[0018](I)發(fā)明使用簡單的靜電自組裝技術，在固定化酶過程中不使用戊二醛、甲醛等雙功能試劑，成本較低，反應溫和，能夠較大程度保持酶活(60%~99%)，提高酶活回收率，固定化效果好，操作簡便。
[0019](2)本發(fā)明的固定化木瓜蛋白酶方法，能夠用于木瓜蛋白酶、過氧化物酶等一系列在pH2_10下zeta電位為正的酶,并具有作為蛋白質藥物載體的潛質。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為實施例2中所得到的酶制劑在不同pH之下的相對酶活。
[0021]圖2為實施例2中所得到的酶制劑在不同溫度下的相對酶活。
【具體實施方式】
[0022]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
`[0023]實施例1
[0024]將80mg纖維素納米晶分散在4ml pH5的磷酸緩沖溶液中，加入4ml含有3.298mg木瓜蛋白酶溶液，在30°C、速率200rpm下震蕩60min，加入0.5ml0.5%聚丙烯酰胺水溶液，在30°C、速率200rpm下震蕩30min，洗滌后冷凍干燥得到固定化酶產品。固定化酶效率為98.40%，產品中木瓜蛋白酶與纖維素納米晶基材比例為41.22mg/g。
[0025]實施例2
[0026]將563.2mg纖維素納米晶分散在25ml pH5.5緩沖溶液中，加入20ml含有57.994mg木瓜蛋白酶溶液，在30°C、速率200rpm下震蕩30min，加入6ml0.5%聚丙烯酰胺水溶液，在30°C、速率200rpm下震蕩30min，洗滌后冷凍干燥得到固定化酶產品，酶活回收率65.3%。
[0027]實施例3
[0028]將80mg纖維素納米晶分散在4ml pH6.0緩沖溶液中，加入4ml含有3.297mg木瓜蛋白酶溶液，在30°C、速率200rpm下震蕩30min，加入0.3ml0.5%聚丙烯酰胺水溶液，在35°C、速率200rpm下震蕩30min，洗滌后冷凍干燥得到固定化酶產品。固定化酶效率為
97.60%，酶與纖維素納米晶基材比例為40.23mg/g。
[0029]實施例4
[0030]將80mg纖維素納米晶分散在4ml pH5的磷酸緩沖溶液中，加入4ml含有2.268mg木瓜蛋白酶溶液，在30°C、速率IOOrpm下震蕩lOmin，加入0.1ml0.5%聚丙烯酰胺水溶液，在30°C、速率IOOrpm下震蕩50min，洗滌后冷凍干燥得到固定化酶產品。固定化酶效率為75.21%，產品中木瓜蛋白酶與纖維素納米晶基材比例為21.32mg/g。
[0031]實施例5
[0032]將80mg纖維素納米晶分散在4ml pH5.5緩沖溶液中，加入4ml含有2.268mg木瓜蛋白酶溶液，在30°C、速率200rpm下震蕩20min，加入0.1ml0.5%聚丙烯酰胺水溶液，在20°C、速率200rpm下震蕩40min，洗滌后冷凍干燥得到固定化酶產品。固定化酶效率為67.22%，酶與纖維素納米晶基材比例為19.06mg/g。
[0033]實施例6
[0034]將80mg纖維素納米晶分散在4ml pH6.5緩沖溶液中，加入4ml含有3.297mg木瓜蛋白酶溶液，在30°C、速率200rpm下震蕩60min，加入0.3ml0.5%聚丙烯酰胺水溶液，在35°C、速率200rpm下震蕩30min，洗滌后冷凍干燥得到固定化酶產品。固定化酶效率為
98.47%，酶與纖維素納米晶基`材比例為40.59mg/g。
【權利要求】
1.一種木瓜蛋白酶固定化方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將纖維素納米晶基材分散在PH為5-9的緩沖溶液中，配置成基材溶液； (2)將(I)中所得的基材溶液與木瓜蛋白酶溶液或木瓜蛋白酶漿狀物混合，在0-35°C振蕩混合l_60min,得到混合懸池液； (3)將(2)所得的混合懸濁液與聚丙烯酰胺溶液混合，震蕩l-60min； (4)將(3)中所得的固定化木瓜蛋白酶洗滌后冷凍干燥即可。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的纖維素納米晶基材為將纖維素材料通過硫酸水解所得到纖維素納米晶體。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺與木瓜蛋白酶的質量比為0.11~2。
4.根據(jù)權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶與基材的質量比為 1: (10-100)。
5.根據(jù)權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)、(3)中震蕩速率為100_500rpm。
6.根據(jù)權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中木瓜蛋白酶包括木瓜蛋白酶酶粉、胞外產木瓜蛋白酶或細胞破壁后含木瓜蛋白酶的發(fā)酵液。
7.根據(jù)權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述纖維素材料為微晶纖維素、纖維素纖維和棉花中的一種或兩種以上。
8.根據(jù)權利要求1~7任意一項`方法制備的木瓜蛋白酶制劑。
【文檔編號】C12N11/08GK103756990SQ201410009414
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月8日 優(yōu)先權日:2014年1月8日
【發(fā)明者】婁文勇, 宗敏華, 曹詩林, 黃宇美 申請人:華南理工大學