一種通過檢測edn3基因拷貝數(shù)差異來鑒定烏雞膚色基因型的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鑒定烏雞膚色基因型的試劑盒，包括（1）內(nèi)參基因GAPDH擴增引物；（2）目的基因EDN3擴增引物；（3）校樣品DNA；（4）熒光定量PCR反應液；（5）雙蒸水。采用本發(fā)明的試劑盒以待檢樣品DNA為模板，對目的基因EDN3和內(nèi)參基因GAPDH進行實時熒光定量PCR反應，并以校樣品DNA為對照，分別記錄Ct值，計算得到待檢樣品的EDN3基因拷貝數(shù)，進而根據(jù)拷貝數(shù)差異判斷烏雞膚色的Fm基因型。本試劑盒操作無需構(gòu)建標準曲線，簡便快速，可重復性好，檢測效率高；經(jīng)雞種測交驗證，本發(fā)明方法能準確反映烏雞個體的膚色Fm純合與雜合。應用本檢測方法有助于加快篩查烏雞膚色純合度，指導優(yōu)質(zhì)烏雞新品系的目標選育，并為后續(xù)商業(yè)化配套雜交提供可靠種質(zhì)保障。
【專利說明】—種通過檢測EDN3基因拷貝數(shù)差異來鑒定烏雞膚色基因型的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測烏雞EDN3基因拷貝數(shù)差異的分子生物學試劑盒，屬于農(nóng)業(yè)生物診斷【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]拷貝數(shù)變異(CNVs)是新發(fā)現(xiàn)的一種與單核苷酸多態(tài)(SNPs)同等重要的基因組結(jié)構(gòu)變異，人類研究中表明，CNVs可導致呈孟德爾遺傳的單基因病與罕見病，同時也與許多多因子疾病及身高等表型相關(guān)。烏膚、烏骨、烏肉等黑色性狀是烏雞的最特征性表觀之一，這種體內(nèi)黑色素的沉積現(xiàn)象也稱真皮黑色素過度沉著(Dermal hyperpigmentation)或纖維化黑色變(Fibr0melan0SiS，F(xiàn)m)。在生產(chǎn)中，有效區(qū)分膚色黑色性狀的純雜度有助于加快烏雞新品系的選育進程，并為后續(xù)商業(yè)化配套雜交提供可靠種質(zhì)保障。膚色遺傳觀察研究已表明，烏雞的膚色性狀主要是由常染色體Fm顯性基因和性連鎖ID色素抑制基因共同作用的結(jié)果。Dorhorst等通過全基因組SNP-性狀關(guān)聯(lián)分析，明確了雞Fm基因位于20號染色體的10.3-13.1Mb、ID基因位于Z染色體的72.3Mb處。進一步地研究更發(fā)現(xiàn)，與白皮膚雞不同的是，在烏雞的Fm區(qū)域內(nèi)存在著復雜基因重組，造成約130kb的重復區(qū)間(CNVs)，包含有EDN3、SLM02、TUBBl等5個基因，其中EDN3基因是與黑色素的形成和沉積密切相關(guān)的。因此，通過檢測Fm區(qū)域內(nèi)EDN3基因的拷貝數(shù)差異應能準確地反映雞種膚色的黑與白，并能通過拷貝數(shù)的差異對群體的純雜度進行遺傳評價。
[0003]實時突光定量PCR (real-time f luorogenetic quantitative PCR, FQ-PCR)是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。它是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高、無污染性、具實時性和準確性等特點，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫(yī)學研究等領(lǐng)域。SYBR Green I是一種非飽和菁類熒光素，可以嵌合于DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的小溝中。其處于游離狀態(tài)時，檢測不到熒光信號，當結(jié)合dsDNA后熒光強度明顯增強，即被熒光探測系統(tǒng)檢測到，熒光強度的增加與初始模板量相關(guān)，可以進行定量DNA分析，其優(yōu)勢在于檢測方法簡便，同時降低了檢測成本。但是，由于該染料能夠結(jié)合任何dsDNA分子，因此不能保證PCR的特異性。當然，通過優(yōu)化PCR的反應條件，可以減少或去除非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的產(chǎn)生；另外，也可以借助熔解曲線分析法來區(qū)分非特異性產(chǎn)物和引物二聚體而進行定性診斷。在定量方法上，實時熒光定量PCR分為絕對定量與相對定量兩種。絕對定量法需構(gòu)建標準品及標準曲線，通過已知的標準曲線來推算樣品模板的絕對量。相對定量法是指同時擴增待測目的基因片段和一個作為內(nèi)參照的管家基因片段(反應在2管中分別進行，也可在同一管中進行)，測得兩者的Ct值之差，即ACt。比較不同待測樣本DNA的Λ Ct值與正常樣本DNA的Λ Ct值，即可通過2_Λ 計算公式對未知樣本目的基因的原始拷貝數(shù)作出判斷，從而對病理狀態(tài)作出判斷或診斷。該方法的特點在于使用了對照樣品，使得不同來源、不同實驗處理、不同時間點檢測的樣品基因變化具有了可比性；并且無需構(gòu)建標準曲線，比較簡便。該方法一是需要目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率相近；二是需要擴增效率盡量接近于100%最佳，這兩點都可以通過一系列反應條件優(yōu)化來實現(xiàn)。
[0004]傳統(tǒng)的基因拷貝數(shù)檢測技術(shù)有免疫印跡、熒光探針雜交、多重可擴增探針雜交、多重連接探針雜交技術(shù)等，但大多存在檢測過程復雜、繁瑣耗時、成本高、放射性危害、假陽性、敏感度不高等缺點。本發(fā)明利用實時熒光定量PCR技術(shù)，對雞基因組的EDN3基因拷貝數(shù)差異進行檢測，僅需熒光PCR儀器和少量基因組DNA即可準確檢測，實現(xiàn)了快速、簡便、準確檢測CNVs。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種檢測烏雞EDN3基因拷貝數(shù)差異的試劑盒。該試劑盒能簡便快速、準確可靠地檢測烏雞個體的EDN3基因拷貝數(shù)，有效區(qū)分烏雞膚色的Fm純合與雜合。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0007]一種通過檢測EDN3基因拷貝數(shù)差異來鑒定烏雞膚色基因型的試劑盒，其特征在于包括以下組成:
[0008](I)內(nèi)參基因GAPDH擴增引物；
[0009]Forward:5’ -CAG CTC CCT CAG CTG ATG C_3’ ；
[0010]Reverse:5，-TCC ACA ATG CCA AAG TTG TC-3，；
[0011](2)目的基因EDN3擴增引物;
[0012]Forward:5，-CAC GTA ACA TCC TTC TGA CAG C_3’ ；
[0013]Reverse:5，-ATC ATA AAC AAA CAG CCA AAT C_3，；
[0014](3)校樣品 DNA;
[0015](4)熒光定量PCR反應液；
[0016](5)雙蒸水。
[0017]進一步地，所述校樣品DNA為確定包含單拷貝EDN3基因序列和GAPDH基因序列的雞基因組DNA。
[0018]所述熒光定量PCR反應液成分包含:PCR緩沖液；SYBR Green I染料；MyCl2、TaqDNA 聚合酶；dNTPs。
[0019]本發(fā)明還提供了一種利用上述試劑盒檢測烏雞EDN3基因拷貝數(shù)的方法，步驟包括:
[0020](I)以校樣品DNA為模板，分別利用目的基因EDN3和內(nèi)參基因GAPDH引物，進行實時熒光定量PCR擴增，每個反應三個重復，分別記錄循環(huán)數(shù)(Ctl和Ct2)；
[0021 ] (2)以待測烏雞的血液基因組DNA為模板，分別利用目的基因EDN3和內(nèi)參基因GAPDH引物，進行實時熒光定量PCR擴增，每個反應三個重復，分別記錄循環(huán)數(shù)(Ct3和Ct4)；
[0022](3)利用2_""^法計算得到待測烏雞的EDN3基因拷貝數(shù)，計算公式為:基因拷貝
數(shù)_2"-((樣品的目的基因平均Ct3-內(nèi)參基因平均Ct4)-(校樣品的目的基因平均CU-內(nèi)參基因平均Ct2))[0023]采用本發(fā)明的試劑盒以待檢樣品DNA為模板，對目的基因EDN3和內(nèi)參基因GAPDH進行實時熒光定量PCR反應，并以校樣品DNA為對照，分別記錄Ct值，計算得到待檢樣品的EDN3基因拷貝數(shù)，進而根據(jù)拷貝數(shù)差異判斷烏雞膚色的Fm基因型。本試劑盒操作無需構(gòu)建標準曲線，簡便快速，可重復性好，檢測效率高；經(jīng)雞種測交驗證，本發(fā)明方法能準確反映烏雞個體的膚色Fm純合與雜合。應用本檢測方法有助于加快篩查烏雞膚色純合度，指導優(yōu)質(zhì)烏雞新品系的目標選育，并為后續(xù)商業(yè)化配套雜交提供可靠種質(zhì)保障。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是目的基因EDN3熔解曲線。 [0025]圖2是目的基因EDN3擴增曲線。
[0026]圖3是內(nèi)參基因GAPDH熔解曲線。
[0027]圖4是內(nèi)參基因GAPDH擴增曲線。
[0028]圖5是目的基因和內(nèi)參基因PCR擴增片段瓊脂糖電泳圖
【具體實施方式】
[0029]以下結(jié)合附圖和實施例進一步說明本發(fā)明。
[0030]實施例1EDN3基因拷貝數(shù)檢測
[0031]I實驗儀器與材料
[0032]實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad 0PTIC0N2，美國)；超低溫冰箱(Thermo，美國)；高速冷凍離心機(Eppendorf5417R，德國)；梯度PCR儀(ABI PCR system9700，美國)；可調(diào)式微量移液器(Eppendorf，德國)；GEL EQ電泳凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)；紫外可見分光光度計(BioSpec-nano，日本)。
[0033]2雞血液基因組DNA提取
[0034]采集伊莎蛋雞B系(棕色羽、白膚、紅冠、白脛)、興安麻雞(麻羽、白膚、紅冠、青脛)、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞(黑羽為主、烏膚、烏冠、黑或青脛)等雞種個體的血液，于75%乙醇中保存。采用AxyPr印總血基因組DNA小量試劑盒(Axygen，美國)提取雞血液全基因組DNA。提取后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量；紫外可見分光光度計(BioSpec-nano,日本)測定DNA濃度。將DNA濃度統(tǒng)一稀釋到5ng/ μ L。
[0035]3引物設(shè)計
[0036]本發(fā)明針對NCBI數(shù)據(jù)庫中Gallus gallus基因組目的基因EDN3 (NC_006107.3)和內(nèi)參基因GAPDH (NC_006088.3)的序列設(shè)計出PCR引物，引物交由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。由于引物的特異性，可以獲得純凈單一的擴增產(chǎn)物；同時兩對引物擴增效率一致，可顯著提高EDN3基因檢測的穩(wěn)定性。
[0037]表1引物序列
[0038]TablelThe primer sequences
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種通過檢測EDN3基因拷貝數(shù)差異來鑒定烏雞膚色基因型的試劑盒，其特征在于試劑盒包括: (1)內(nèi)參基因GAPDH擴增引物；
Forward:5’ -CAGCTCCCTCAGCTGATGC-3’ ；
Reverse: 5，-TCCACAATGCCAAAGTTGTC-3，； (2)目的基因EDN3擴增引物；
Forward:5’ -CACGTAACATCCTTCTGACAGC-3’ ；
Reverse: 5，-ATCATAAACAAACAGCCAAATC—3，； (3)校樣品DNA; (4)熒光定量PCR反應液； (5)雙蒸水。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒中，其特征在于:所述校樣品DNA為確定包含單拷貝EDN3基因序列和GAPDH基因序列的雞基因組DNA。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒中，其特征在于，所述熒光定量PCR反應液成分包含:PCR 緩沖液、SYBR Green I 染料、MyCl2, Taq DNA 聚合酶、dNTPs。
4.利用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測EDN3基因拷貝數(shù)的方法，其特征在于包括步驟: Cl)以校樣品DNA為模板，分別利用目的基因EDN3和內(nèi)參基因GAPDH引物，進行實時熒光定量PCR擴增，每個反應三個重復，分別記錄循環(huán)數(shù)(Ctl和Ct2);(2)以待測烏雞的血液基因組DNA為模板，分別利用目的基因EDN3和內(nèi)參基因GAPDH引物，進行實時熒光定量PCR擴增，每個反應三個重復，分別記錄循環(huán)數(shù)(Ct3和Ct4)； (3)利用2_“^法計算得到待測烏雞的EDN3基因拷貝數(shù)，計算公式為:基因拷貝數(shù)_2~-((樣品的目的基因平均ct3-內(nèi)參基因平均Ct4)_ (校樣品的目的基因平均Ctl-內(nèi)參基因平均Ct2))
【文檔編號】C12Q1/68GK103773857SQ201410009465
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月8日
【發(fā)明者】章學東, 王歡歡, 張成先, 李慶海, 陳賢惠, 張國軍, 樓立峰, 張雷 申請人:杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院