電化學(xué)活性細菌及其篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物電化學(xué)系統(tǒng)中應(yīng)用的細菌品種，旨在提供電化學(xué)活性細菌新種及其電化學(xué)活性新種的篩選方法。該該電化學(xué)活性細菌的16S?rRNA序列如SEQ?ID?NO：1所示；該種電化學(xué)活性細菌的篩選方法，是選擇富集了電化學(xué)活性微生物的陽極生物膜作為分離菌源，利用微型生物電化學(xué)反應(yīng)器作為分離裝置，并以生物電化學(xué)反應(yīng)器的產(chǎn)電能力為篩選指標(biāo)。本發(fā)明獲得的電化學(xué)活性細菌是泥土桿菌屬的一個新種，為研究生物電化學(xué)系統(tǒng)陽極微生物的胞外電子傳遞機理提供了寶貴的微生物資源；且電化學(xué)活性細菌具有高電化學(xué)活性的和耐鹽特征，能提高生物電化學(xué)系統(tǒng)的性能，并能在高鹽體系的生物電化學(xué)系統(tǒng)中應(yīng)用。
【專利說明】電化學(xué)活性細菌及其篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物電化學(xué)系統(tǒng)中應(yīng)用的細菌品種，特別涉及電化學(xué)活性細菌新種及其電化學(xué)活性新種(Geobacter anodereducens SD-1)的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物電化學(xué)系統(tǒng)(BES) —類利用微生物陽極催化氧化反應(yīng)，將電子傳遞到陰極進行還原反應(yīng)，從而將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能的裝置，主要包括微生物燃料電池(MFC)和微生物電解池(MEC)。當(dāng)以廢水為陽極基質(zhì)時，這類系統(tǒng)能在處理廢水的同時以不同的能源形式(例如電能、氫能等)回收廢棄生物質(zhì)中的能量。因此，生物電化學(xué)系統(tǒng)在近10年中被廣泛研究，成為一個新的研究熱點。其中系統(tǒng)所依賴的生物催化劑(陽極微生物)，叫做電化學(xué)活性細菌。硫還原泥土桿菌(Geobacter sulfurreducens)是電化學(xué)活性微生物的模式菌株，它的電化學(xué)活性和混合培養(yǎng)菌群的相當(dāng)，并且往往是混菌陽極生物膜中的優(yōu)勢種群。但是，該細菌最初是以它的鐵還原能力從底泥中分離獲得，隨后被用于生物電化學(xué)系統(tǒng)中。最近的研究發(fā)現(xiàn)微生物還原金屬氧化物的過程和細胞將電子導(dǎo)到電極的行為是不一樣的。有的微生物不能還原金屬氧化物但卻能在BESs中單獨產(chǎn)電，反之亦然。這表明相比于礦物質(zhì)的電子受體，細菌在電極上生長需要不同的特性。因此，我們推測以細菌的電化學(xué)活性(接種該細菌的生物電化學(xué)反應(yīng)器的產(chǎn)電能力)而不是金屬還原能力為指標(biāo)，以高度富集電化學(xué)活性細菌的混菌陽極生物膜為分離菌源，能獲得電化學(xué)活性更高，更能適應(yīng)生物電化學(xué)系統(tǒng)的電化學(xué)活性細菌。
[0003]新的電化學(xué)活性細 菌一方面能優(yōu)化生物電化學(xué)系統(tǒng)的陽極工作性能，另一方面能為生物電化學(xué)系統(tǒng)陽極電子傳遞機理的研究提供新的微生物資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種電化學(xué)活性細菌及其篩選方法。
[0005]為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是:
[0006]提供一種電化學(xué)活性細菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏名稱為陽極還原泥土桿菌SD-1 (Geobacter anodereducens SD-1),保藏號為CGMCCNo:8662，保藏日期為:2013.12.30，保藏單位地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。
[0007]本發(fā)明中，所述該電化學(xué)活性細菌的16S rRNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本發(fā)明還提供了電化學(xué)活性細菌的篩選方法，是采用稀釋-絕跡法進行電化學(xué)活性細菌的分離、純化和篩選；其特征在于，是選擇富集了電化學(xué)活性微生物的陽極生物膜作為分離菌源，利用微型生物電化學(xué)反應(yīng)器作為分離裝置，并以生物電化學(xué)反應(yīng)器的產(chǎn)電能力為篩選指標(biāo)；具體包括:
[0009](I)所述富集了電化學(xué)活性微生物的陽極生物膜取自生物電化學(xué)反應(yīng)器，該生物電化學(xué)反應(yīng)器最初由城市生活廢水處理廠初沉池的出水接種，以甲酸為基質(zhì)，穩(wěn)定運行至少半年，以便在其陽極材料上沉積形成陽極生物膜；經(jīng)克隆文庫的群落分析表明，陽極生物膜中的優(yōu)勢種群為數(shù)量>50%的硫還原泥土桿菌和數(shù)量>20%的乙酸桿菌；在該生物電化學(xué)反應(yīng)器中，通過乙酸桿菌將甲酸轉(zhuǎn)化成濃度<50ppm的乙酸，然后硫還原泥土桿菌利用該乙酸作為基質(zhì)進行產(chǎn)電；
[0010](2)篩選過程所使用的分離裝置是微型生物電化學(xué)反應(yīng)器:由5mL血清瓶構(gòu)建，陽極材料為1.5cmX Icm的石墨板，陰極材料為1.5cmX Icm不銹鋼網(wǎng)；經(jīng)砂紙清理后的不銹鋼絲或者鈦絲與陰陽兩個電極連接，作為引出線導(dǎo)出電流；電極的引出線分別穿過一個直徑20_ 丁基橡膠塞；反應(yīng)器由鋁箔蓋密封后，用高壓蒸氣滅菌；取生物電化學(xué)反應(yīng)器的陽極生物膜樣品，用磷酸緩沖溶液(PBS)倍比稀釋后接種于滅過菌的微型生物電化學(xué)反應(yīng)器；
[0011](3)以微型生物電化學(xué)反應(yīng)器的產(chǎn)電能力為指標(biāo)，選擇能產(chǎn)生電流的最大稀釋倍數(shù)下的微型反應(yīng)器進行下一個分離周期，直至獲得純培養(yǎng)微生物——陽極還原泥土桿菌；所述分離周期是指:稀釋——接種新的微型反應(yīng)器——運行微型反應(yīng)器——監(jiān)測電流產(chǎn)生的整個過程。
[0012]本發(fā)明中，運行所述微型生物電化學(xué)反應(yīng)器時，使用的培養(yǎng)基的成分為:
[0013]每升水中，包含乙酸鈉Ig ；NH4Cl0.31g ；KC10.13g ;50mM磷酸緩沖溶液；Wolfe微量元素液12.5mL ；ffolfe維生素液5mL ；
[0014]所述磷酸緩沖溶液的成分為:
[0015]每升水中，包含NaH2PO4.2H205.618g ；Na2HP04.12Η206.155g ； [0016]所述Wolfe微量元素液的成分為:
[0017]每升水中，包含氨三乙酸1.5g ；MgS04.7Η203.0g ； MnSO4.H2O0.5g ；NaCll.0g ；FeSO4.7H200.1g ；CoCl2.6H200.1g ；CaCl20.1g ；ZnS04.7H200.1g ；CuS04.5H200.01g ；AlK(SO4)2.12H200.01g ；H3B030.01g ；Na2Mo04.2H200.01g ；
[0018]所述Wolfe維生素液的成分為:
[0019]每升水中，包含生物素2.0mg ;葉酸2.0mg ;維生素B610.0mg ;維生素B15.0mg ;核黃素5.0mg ;煙酸5.0mg ；D-泛酸鈣5.0mg ;維生素B120.1mg ;對氨基苯甲酸5.0mg ;硫辛酸
5.0mg0
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0021]1、本發(fā)明獲得的電化學(xué)活性細菌是泥土桿菌屬的一個新種，為研究生物電化學(xué)系統(tǒng)陽極微生物的胞外電子傳遞機理提供了寶貴的微生物資源。
[0022]2、本發(fā)明提供的電化學(xué)活性細菌具有高電化學(xué)活性的和耐鹽特征，能提高生物電化學(xué)系統(tǒng)的性能，并能在高鹽體系的生物電化學(xué)系統(tǒng)中應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明電化學(xué)活性細菌在乙酸-檸檬酸鐵培養(yǎng)基中的透射電鏡圖。
[0024]圖2是本發(fā)明電化學(xué)活性細菌在生物電化學(xué)反應(yīng)器中形成陽極生物膜的掃描電鏡圖。
【具體實施方式】[0025]本發(fā)明中，保藏名稱為陽極還原泥土桿菌(Geobacter anodereducens SD-1)的電化學(xué)活性細菌的生理生化和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果證實為一個新種，它的生物學(xué)特征:
[0026]1、形態(tài)特征:陽極還原泥土桿菌SD-1為單細胞生長的規(guī)則短桿菌(長
0.8-1.3 μ m,寬0.3 μ m);革蘭氏陰性菌；無鞭毛；無芽孢。
[0027]2、生理生化特征:陽極還原泥土桿菌SD-1為耐氧厭氧細菌，可以在15-42 °C，PH6-8.5,0-3% NaCl條件下生長，最適生長溫度為30_35°C，最佳生長pH值為7左右；能以乙酸為電子供體，鐵氧化物為電子受體生長，但是不能以硫單質(zhì)和延胡索酸鹽為電子受體生長。當(dāng)以乙酸鹽為電子供體，以檸檬酸鐵為電子受體，在最優(yōu)生長條件30°C和pH7下，代時為18h。細菌在生物電化學(xué)系統(tǒng)中的產(chǎn)電能力與混合培養(yǎng)物(廢水)相當(dāng)(在50mM磷酸緩沖溶液中)或者1.5倍于(在200mM磷酸緩沖溶液或者鹽水中)混菌,產(chǎn)電能力居于已獲得純培養(yǎng)電化學(xué)活性微生物的前列。
[0028]3、分子生物學(xué)鑒定結(jié)果:與其最相近種屬硫還原泥土桿菌(Geobactersulfurreducens)的相似性為98%,但是陽極還原泥土桿菌SD-1和硫還原泥土桿菌PCA的DNA-DNA雜交率為61.6%。因此，該陽極還原泥土桿菌為一個新種。
[0029]具體實施例:
[0030]陽極還原泥土桿菌SD-1 (Geobacter anodereducens SD-1)按照下述步驟進行選育:
[0031]一、菌株的 分離、純化和篩選:
[0032]采用傳統(tǒng)稀釋-絕跡法，選擇富集了電化學(xué)活性微生物的陽極生物膜作為分離菌源，使用微型生物電化學(xué)反應(yīng)器(min1-MEC)為分離裝置進行電化學(xué)活性細菌的分離，其具體步驟如下:
[0033]從富集了電化學(xué)活性微生物的生物電化學(xué)反應(yīng)器的陽極碳刷上剪下一些石墨纖維，轉(zhuǎn)移到一個5mL血清瓶中(裝有5mL50mM磷酸緩沖溶液和玻璃珠)，震蕩瓶子得到細胞懸浮液。然后將細胞懸浮液在厭氧管中用50mM磷酸緩沖溶液從KT1-KT9連續(xù)倍比稀釋。每個稀釋倍數(shù)下的樣品以10%接種量接種至微型生物電化學(xué)反應(yīng)器，然后在30°C運行反應(yīng)器。陽極微生物的生長通過產(chǎn)生的電流監(jiān)控。檢測到電流生成的反應(yīng)器運行到這個產(chǎn)電周期結(jié)束(20%峰值電流)。震蕩能檢測到電流生成的最大稀釋倍數(shù)下的反應(yīng)器，得到陽極微生物的細胞懸浮液，然后重復(fù)上訴的分離步驟(稀釋、接種和運行)，直至獲得純培養(yǎng)細菌。細菌的純度通過顯微觀察和16S rRNA克隆測序監(jiān)測。
[0034]所述富集了電化學(xué)活性微生物的陽極碳刷的生物電化學(xué)反應(yīng)器最初由生活廢水(本實施例選擇了美國賓夕法尼亞州立大學(xué)廢水處理廠初沉池的出水)接種，以甲酸為基質(zhì)，穩(wěn)定運行至少半年，在陽極材料上沉積形成了陽極生物膜；經(jīng)克隆文庫的群落分析表明，該微型生物電化學(xué)反應(yīng)器的陽極生物膜中的優(yōu)勢種群為數(shù)量>50 %的硫還原泥土桿菌和〉數(shù)量20%的乙酸桿菌；在該生物電化學(xué)反應(yīng)器中，通過乙酸桿菌將甲酸轉(zhuǎn)化成濃度<50ppm的乙酸(該濃度遠小于反應(yīng)器常用的lg/L乙酸的基質(zhì)濃度)，然后硫還原泥土桿菌利用極低濃度乙酸為基質(zhì)高效產(chǎn)電(和采用lg/L乙酸基質(zhì)的反應(yīng)器的產(chǎn)電能力相當(dāng))。
[0035]篩選過程所使用的分離裝置微型生物電化學(xué)反應(yīng)器為:由5mL血清瓶構(gòu)建；陽極材料為1.5cmX Icm的石墨板；陰極材料為1.5cmX Icm不銹鋼網(wǎng)；經(jīng)砂紙清理后的不銹鋼絲或者鈦絲和陰陽兩電極連接，作為引出線導(dǎo)出電流；電極的引出線分別穿過一個厚的丁基橡膠塞(20mm直徑)；反應(yīng)器由鋁箔蓋密封后，反應(yīng)器用高壓蒸氣滅菌；反應(yīng)器在0.7V外加電壓下運行
[0036]以微型生物電化學(xué)反應(yīng)器的產(chǎn)電能力為指標(biāo)，選擇能產(chǎn)生電流的最大稀釋倍數(shù)下的微型反應(yīng)器進行下一個分離周期，直至獲得純培養(yǎng)微生物——陽極還原泥土桿菌；所述分離周期是指:稀釋——接種新的微型反應(yīng)器——運行微型反應(yīng)器——監(jiān)測電流產(chǎn)生的整個過程。
[0037]運行微型生物電化學(xué)反應(yīng)器所使用的培養(yǎng)基為:乙酸鈉Ig ;NH4C10.31g ;KC10.13g ;50mM磷酸緩沖溶液(PBS) ；Wolfe微量元素液12.5mL ；ffolfe維生素液5mL。上述50mM磷酸緩沖溶液(每升水)為=NaH2PO4.2Η205.618g和 Na2HPO4.12Η206.155g。上述Wolfe微量元素液(每升水)為:氨三乙酸 1.5g ；MgS04.7Η203.0g ；MnSO4.H2O0.5g ；NaCll.0g ；FeSO4.7H200.1g ；CoCl2.6H200.1g ；CaCl20.1g ；ZnS04.7H200.1g ； CuSO4.5H200.01g ；AlK(SO4)2 *12H200.01g ；H3B030.01g ；Na2Mo04 *2H200.01g。上述Wolfe維生素液(每升水)為:生物素2.0mg ;葉酸2.0mg ;維生素B610.0mg ;維生素B15.0mg ;核黃素5.0mg ;煙酸5.0mg ；D-泛酸?丐5.0mg ;維生素B120.1mg ;對氨基苯甲酸5.0mg ;硫辛酸5.0mg0
[0038]二、細菌的生理生化和形態(tài)學(xué)分析:
[0039]細菌在檸檬酸鐵-乙酸培養(yǎng)基中的生長用吖啶橙細胞計數(shù)法檢測；Fe(III)還原能力用HCl萃取Fe(II)檢測法檢測Fe(II)離子的生成獲得；透射電鏡用于觀察檸檬酸鐵-乙酸培養(yǎng)基中處于穩(wěn)定期的細菌形態(tài)；掃描電鏡用于觀察生物電化學(xué)反應(yīng)器中陽極生物膜上的細菌形態(tài)；細菌在生物電化學(xué)反應(yīng)器中的電化學(xué)活性用系統(tǒng)的產(chǎn)電能力評價?？谘距Τ燃毎嫈?shù)法:在抽濾裝置上放上背襯濾膜(MF-Millipore Membrane, 5.0 μ m孔徑，25mm直徑)，加入2_3mL去離子水沖洗抽濾漏斗和濕潤背襯濾膜，真空抽濾。然后，在背襯濾膜放上黑色的聚碳酸酯 濾膜(Millipore, Isopore Membrane, 0.2 μ m孔徑，25mm直徑)，避免兩濾膜間有氣泡，在抽濾漏斗中加入2mL檢測樣品，加入200 μ I吖啶橙溶液(IOOmg/L)，用移液器反復(fù)吹吸混勻樣品和吖啶橙溶液，等待2min，真空抽濾。將黑色濾膜放置在載玻片上，加一滴浸油蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡(Olympus BX61)下計數(shù)。注意事項:樣品需事先稀釋，使得熒光顯微鏡中一個視野的細胞個數(shù)在15-30之間。HCl萃取Fe(II)檢測法為:0.1mL的培養(yǎng)液樣品加入到5mL0.5N HC1，在室溫下萃取15min。然后，0.1mL萃取液加入到 5mL 菲咯嗪(lg/L)的 SOmmoI /T, HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N，_2_ethanesulfonic acid, N-(2-羥乙基)哌嗪-N’ -2-乙烷磺酸)緩沖液中(pH7)。混合15秒后，測量562nm下的吸光度A562。形態(tài)學(xué)鑒定參照文獻方法(東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊.北點:科學(xué)出版社，2001.)
[0040]三、細菌的分類鑒定:
[0041]提取細菌基因組DNA，用于16S rDNA擴增的PCR反應(yīng)引物為細菌通用引物:正向引物 27F，5’ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 和反向引物 1541R，5’ -AAGGAGGTGATCCAGCC-3’。所述 PCR 擴增體系(50 μ L)是:2XTaq PCR MasterMix (天根)25 μ L，引物各 2 μ L，水 20 μ L，模板 luL。所述 PCR 擴增方法是:95°C 5min ；94°C Imin ；55°C Imin ；72°C 1.5min ;從第二步起共30個循環(huán)，最后延伸72°C lOmin，進行測序。
【權(quán)利要求】
1.一種電化學(xué)活性細菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏名稱為陽極還原泥土桿菌SD-1 (Geobacter anodereducens SD-1),保藏號為CGMCCNo:.8662，保藏日期為:2013.12.30。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)活性細菌，其特征在于，該電化學(xué)活性細菌的16SrRNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.權(quán)利要求1所述電化學(xué)活性細菌的篩選方法，是采用稀釋-絕跡法進行電化學(xué)活性細菌的分離、純化和篩選；其特征在于，是選擇富集了所述電化學(xué)活性微生物的陽極生物膜作為分離菌源，利用微型生物電化學(xué)反應(yīng)器作為分離裝置，并以生物電化學(xué)反應(yīng)器的產(chǎn)電能力為篩選指標(biāo)；具體包括: (1)所述富集了電化學(xué)活性微生物的陽極生物膜取自生物電化學(xué)反應(yīng)器，該生物電化學(xué)反應(yīng)器最初由城市生活廢水處理廠初沉池的出水接種，以甲酸為基質(zhì)，穩(wěn)定運行至少半年，以便在其陽極材料上沉積形成陽極生物膜；經(jīng)克隆文庫的群落分析表明，陽極生物膜中的優(yōu)勢種群為數(shù)量>50%的硫還原泥土桿菌和數(shù)量>20%的乙酸桿菌；在該生物電化學(xué)反應(yīng)器中，通過乙酸桿菌將甲酸轉(zhuǎn)化成濃度<50ppm的乙酸，然后硫還原泥土桿菌利用該乙酸作為基質(zhì)進行廣電； (2)篩選過程所使用的分離裝置是微型生物電化學(xué)反應(yīng)器:由5mL血清瓶構(gòu)建，陽極材料為1.5cmX 1cm的石墨板，陰極材料為1.5cmX Icm不銹鋼網(wǎng)；經(jīng)砂紙清理后的不銹鋼絲或者鈦絲與陰陽兩個電極連接，作為引出線導(dǎo)出電流；電極的引出線分別穿過一個直徑20mm丁基橡膠塞；反應(yīng)器由鋁箔蓋密封后，用高壓蒸氣滅菌；取生物電化學(xué)反應(yīng)器的陽極生物膜樣品，用磷酸緩 沖溶液(PBS)倍比稀釋后接種于滅過菌的微型生物電化學(xué)反應(yīng)器； (3)以微型生物電化學(xué)反應(yīng)器的產(chǎn)電能力為指標(biāo)，選擇能產(chǎn)生電流的最大稀釋倍數(shù)下的微型反應(yīng)器進行下一個分離周期，直至獲得純培養(yǎng)微生物——陽極還原泥土桿菌；所述分離周期是指:稀釋——接種新的微型反應(yīng)器——運行微型反應(yīng)器——監(jiān)測電流產(chǎn)生的整個過程。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，運行所述微型生物電化學(xué)反應(yīng)器時，使用的培養(yǎng)基的成分為: 每升水中，包含乙酸鈉Ig ；NH4C10.31g ；KC10.13g ;50mM磷酸緩沖溶液；Wolfe微量元素液12.5mL ；ffolfe維生素液5mL ； 所述磷酸緩沖溶液的成分為:
每升水中，包含 NaH2PO4.2H205.618g ；Na2HPO4.12H206.155g ； 所述Wolfe微量元素液的成分為: 每升水中，包含氨三乙酸 1.5g ；MgS04.7Η203.0g ； MnSO4.H2O0.5g ；NaCll.0g ；FeSO4.7H200.1g ；CoCl2.6H200.1g ；CaCl20.1g ；ZnS04.7H200.1g ；CuS04.5H200.01g ；AlK(SO4)2.12H200.01g ；H3B030.01g ；Na2Mo04.2H200.01g ； 所述Wolfe維生素液的成分為: 每升水中，包含生物素2.0mg ;葉酸2.0mg ;維生素B610.0mg ;維生素B15.0mg ;核黃素5.0mg ;煙酸5.0mg ；D-泛酸鈣5.0mg ;維生素B120.1mg ;對氨基苯甲酸5.0mg ;硫辛酸.5.0mg0
【文檔編號】C12R1/01GK103898005SQ201410010746
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】孫丹, 王愛杰, 成少安, 布魯斯·洛根 申請人:浙江大學(xué)