1.3拷貝c基因型hbv轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法。所述方法是通過囊胚注射ES細(xì)胞制備定點(diǎn)整合1.3拷貝C基因型乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）轉(zhuǎn)基因小鼠。首先構(gòu)建定點(diǎn)整合1.3拷貝C型HBV的表達(dá)載體，然后采用電轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到ES細(xì)胞中，經(jīng)過篩選和培養(yǎng)后獲得定點(diǎn)整合重組的ES細(xì)胞，再把定點(diǎn)整合重組的ES細(xì)胞經(jīng)消化成單個(gè)細(xì)胞后注射到囊胚中，然后把囊胚移植到假孕母鼠子宮中。該方法在國內(nèi)外率先建立了1.3拷貝C型HBV的轉(zhuǎn)基因小鼠，針對(duì)性的應(yīng)用于乙肝相關(guān)研究領(lǐng)域中，為我國乙型肝炎預(yù)防和治療研究更加理想的動(dòng)物模型。
【專利說明】1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物模型構(gòu)建領(lǐng)域。更具體地，涉及一種1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是全球范圍內(nèi)影響人類健康的重大問題。由HBV感染導(dǎo)致的慢性進(jìn)行性肝臟炎癥病變，常常發(fā)展為肝硬化、肝癌并最終導(dǎo)致死亡。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性HBV感染者，每年因此死亡的人數(shù)約為100萬~200萬。我國一直是HBV感染的高發(fā)區(qū)，最新的資料表明:我國現(xiàn)有的慢性HBV感染者約為9300萬例，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例，占慢性HBV感染者的1/5強(qiáng)。慢性HBV感染者和慢性乙型肝炎患者由于攜帶有大量HBV，是HBV的最主要傳染源。我國每年都投入大量的經(jīng)費(fèi)和人力物質(zhì)資源用于該類人群的治療和阻止HBV在人群中的進(jìn)一步 傳播，給我國帶來了非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)，使本已十分有限的醫(yī)療資源更加緊張。為此，開展深入和多層次的HBV感染尤其是慢性HBV感染和慢性乙型肝炎的相關(guān)研究，對(duì)于攻克這一影響我國近I億人口身體健康的疾病，維護(hù)我國人口的身體健康具有重要意義。
[0003]在乙型肝炎的相關(guān)研究中，乙型肝炎動(dòng)物模型具有舉足輕重的地位，乙型肝炎動(dòng)物模型應(yīng)用于從HBV感染機(jī)制、被感染機(jī)體的免疫狀態(tài)改變、HBV在被感染機(jī)體內(nèi)的免疫逃逸機(jī)制、HBV的基因治療以及HBV治療藥物的療效評(píng)價(jià)等的各個(gè)層次和各個(gè)方面。因而合適的動(dòng)物模型的建立與選擇往往成為HBV研究工作的關(guān)鍵，對(duì)研究工作起到事半功倍的作用。為此，許多學(xué)者都曾致力于建立各種類型的乙型肝炎動(dòng)物模型。然而由于人類HBV屬于嗜肝DNA病毒科，有較強(qiáng)的種屬特異性，自然條件下只感染人和非人靈長類(如黑猩猩等)，建立起能廣泛應(yīng)用的動(dòng)物模型并非易事。黑猩猩模型因其體積較大、成本高以及受倫理道德約束等限制了其應(yīng)用；而樹駒模型則由于其感染效率低，僅能導(dǎo)致短暫的輕度感染，病毒滴度很低，而難以推廣應(yīng)用；鴨乙型肝炎的動(dòng)物模型，則存在其藥代動(dòng)力學(xué)和免疫學(xué)遺傳背景與人類有很大的不同的缺陷、土撥鼠僅產(chǎn)于北美，運(yùn)輸困難且價(jià)格昂貴，從而限制了這些動(dòng)物模型的廣泛應(yīng)用，進(jìn)而限制了對(duì)乙型肝炎發(fā)病機(jī)制、免疫病理、治療藥物以及免疫治療的相關(guān)研究。
[0004]近年來，由于遺傳和免疫背景清楚、易于飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，小鼠逐漸受到研究人員的關(guān)注，成為構(gòu)建HBV動(dòng)物模型的最佳選擇。研究人員建立了人-鼠肝嵌合體HBV小鼠模型、基因轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型和HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
[0005]但是，盡管人-鼠肝嵌合體HBV小鼠模型可以說是目前最好的HBV感染復(fù)制模型，但是由于該模型沒有免疫機(jī)能，因而不能進(jìn)行免疫介導(dǎo)的病毒清除和肝炎免疫致病機(jī)制的研究。基因轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型由于是一過性的HBV復(fù)制模型，因而只能用于急性HBV感染的研究，不適用于慢性HBV感染和慢性乙型肝炎研究。此外，由于注射劑量太大(相當(dāng)于小鼠全身體液的總量)，對(duì)小鼠肝臟和其他器官造成的損傷也不能忽視。目前已有的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠也存在著明顯的缺陷。首先，目前已有的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠由于并非通過被HBV感染的途徑建立，因此無法用來進(jìn)行HBV進(jìn)入被感染機(jī)體和HBV在機(jī)體內(nèi)的散布研究；其次，目前已有的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)HBV病毒抗原處于免疫耐受狀態(tài)，機(jī)體不能產(chǎn)生對(duì)HBV的免疫反應(yīng)，也不產(chǎn)生乙型肝炎病變。以上原因?qū)е铝丝捎糜诼訦BV感染和慢性乙型肝炎非免疫耐受的動(dòng)物模型的缺失，客觀上影響了相關(guān)研究的深入開展。因此建立可控、支持HBV體內(nèi)感染并能導(dǎo)致類似于臨床乙肝病變的，非免疫耐受的HBV小鼠模型成為深入了解乙肝發(fā)病機(jī)制，肝臟病變的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸機(jī)制，抗乙肝藥物的研發(fā)及評(píng)價(jià)新的乙肝免疫療法的重要關(guān)鍵因素。
[0006]另外，由于目前臨床治療乙型肝炎廣泛使用的的HBV抗病毒療法存在很多不足，如干擾素會(huì)引起患者白細(xì)胞和血小板下降、可能會(huì)加重肝損害、有可能致畸或阻礙兒童發(fā)育、不能耐受藥 物的不良反應(yīng)等等；核苷類似物則由于導(dǎo)致宿主體內(nèi)的HBV基因發(fā)生突變而產(chǎn)生耐藥。這些因素導(dǎo)致臨床上HBV感染治療尤其是慢性HBV感染和慢性乙型肝炎的治療效果不甚理想，臨床上期待新的治療方法問世，以達(dá)到控制或逆轉(zhuǎn)乙型肝炎尤其是慢性HBV感染和慢性乙型肝炎致病的過程和進(jìn)展，直至達(dá)到徹底治愈乙肝的目的。免疫調(diào)節(jié)治療有望成為治療慢性乙型肝炎的重要手段。研究表明，HBV慢性感染者體內(nèi)的T細(xì)胞被HBV觸發(fā)而自殺，這也許是決定HBV慢性感染者體內(nèi)HBV無法清除的關(guān)鍵。
[0007]另外，乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一種嗜肝DNA病毒,可引起各種急慢性肝炎、肝硬化等疾病，并與肝細(xì)胞癌的發(fā)生有非常密切的關(guān)系。根據(jù)HBV基因序列的差異，可將HBV毒株分為不同的基因型，目前已確定有A~H8個(gè)基因型。HBV基因型與其流行特征、致病性、疾病治療及預(yù)后等方面存在十分緊密的關(guān)系。不同基因型呈一定的地理區(qū)域性分布，我國的主要流行株有B型和C型。而基因型C在全國各地均有流行，尤其以北方地區(qū)流行為主，有的城市甚至高達(dá)69%。
[0008]由于HBV具有高度的宿主特異性，僅感染人和少數(shù)靈長類動(dòng)物，不感染小鼠等常見實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，有關(guān)HBV及乙型肝炎的研究受到很大限制。轉(zhuǎn)基因小鼠的建立，為乙型肝炎的基礎(chǔ)研究和抗乙肝病毒藥物的開發(fā)帶來了希望。但是HBV全基因組單拷貝或二拷貝轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示HBV的復(fù)制和表達(dá)效率很低，嚴(yán)重影響了其廣泛應(yīng)用。目前國內(nèi)研究多為D型轉(zhuǎn)基因小鼠。而針對(duì)國流行株C型轉(zhuǎn)基因小鼠研究較少。因此十分有必要建立一種C型HBV基因高效復(fù)制和表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，為我國乙型肝炎預(yù)防和治療研究更加理想的動(dòng)物模型。然而，本實(shí)驗(yàn)室通過顯微原核注射的方法制備出的C型轉(zhuǎn)基因小鼠，在免疫組化結(jié)果中顯示H)代到F3代陽性小鼠的肝組織和腎組織均有HBsAg表達(dá)，且均為胞質(zhì)型，表明該基因可以表達(dá)且可以傳代。但是小鼠血清和尿液HBsAg和HBeAg很難檢測(cè)到，血清熒光定量PCR也顯示HBV DNA為低復(fù)制表達(dá)水平，拷貝數(shù)為IO2~IO3拷貝/mL。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有乙型肝炎研究轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型存在的技術(shù)不足，提供一種能穩(wěn)定傳代和表達(dá)的C型乙肝疾病研究動(dòng)物模型，即高效復(fù)制和表達(dá)C型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法。
[0010]本發(fā)明目的是提供一種1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法。
[0011]本發(fā)明還提供上述1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用。[0012]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明提供了一種1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，步驟如下:
51.胚胎干細(xì)胞系的建立；
52.將1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)到胚胎干細(xì)胞，經(jīng)過培育和嘌呤霉素篩選得到陽性的胚胎干細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；
53.把陽性胚胎干細(xì)胞注射到囊胚期小鼠卵細(xì)胞中，將注射好的囊胚移植到假孕母鼠的子宮，培育得到1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0013]其中，步驟SI所述胚胎干細(xì)胞系的建立方法如下:
511.取懷孕3.5天的C57BL/6J雌性孕鼠，斷頸處死；
512.用酒精將Sll處死的孕鼠消毒；
513.打開孕鼠腹腔，修除去脂肪和系膜，從輸卵管根部及子宮下端分叉處剪下雙側(cè)子宮，將雙角子宮于陰道處剪斷；
514.注射器吸入M2(購自美國Sigma公司)作為沖胚液，注射器的針頭在使用之前把針尖剪掉磨平滅菌； 將注射器從子宮的一端插入子宮腔內(nèi)，夾緊，吹入沖胚液，再從子宮的另一端插入注射器，吹入沖胚液；
515.將上述沖胚液取出置于平皿中，平皿置于解剖鏡下，用口叼管吸取少量沖胚液，將囊胚吸出；
516.然后將囊胚放入KSOMaa胚胎培養(yǎng)基(購自美國ZenithBiotech公司)中，觀察，選擇比較好的囊胚；
517.將選擇的囊胚吹入預(yù)先接種了飼養(yǎng)層細(xì)胞(北京思賽因公司提供)的細(xì)胞板，換用小鼠胚胎干細(xì)胞建系培養(yǎng)基(購自北京思賽因公司)，每孔中放I個(gè)囊胚；
518.放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，囊胚逐漸長大，最后貼壁，滋胚層展開，囊胚的內(nèi)細(xì)胞不斷增
殖；
519.培養(yǎng)4~6天后，囊胚的內(nèi)細(xì)胞成為一團(tuán)圓柱形或凸起細(xì)胞團(tuán)，此時(shí)可離散囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，得到胚胎干細(xì)胞系。
[0014]步驟S2所述1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒由中國人民解放軍第302醫(yī)院贈(zèng)與，序列全長如SEQ ID N0.1所示。
[0015]所述1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒的構(gòu)建方法為:通過Spe I和如a I兩個(gè)酶切位點(diǎn)將1.3倍加長片段C型HBV的DNA片段連接入pcDNA3.1質(zhì)粒中，得到1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒的示意圖如附圖1所示。
[0016]步驟S2所述電轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法如下:
521.將培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞系用胰酶消化為單個(gè)細(xì)胞，加入終止培養(yǎng)基(廣州科學(xué)院與健康研究院提供)終止消化，離心，去除上清，然后用減血清培養(yǎng)基opt1-MEM (購自美國Gbico公司)懸??；
522.懸浮液中加入電轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的C型HBV質(zhì)粒，混勻，轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯中，用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)導(dǎo)，電轉(zhuǎn)導(dǎo)后迅速加入細(xì)胞培養(yǎng)基(廣州科學(xué)院與健康研究院提供)，然后鋪到細(xì)胞板中；
523.第二天，更換培養(yǎng)基為嘌呤霉素抗性的培養(yǎng)基，每天進(jìn)行換液；
524.培養(yǎng)5~7天后，只有轉(zhuǎn)入了質(zhì)粒的細(xì)胞才能生長成集落克隆，分別挑取篩選出來的克隆到細(xì)胞板中，每個(gè)孔I個(gè)細(xì)胞克?。?br> 525.第二天，將細(xì)胞傳代到新的細(xì)胞板中，再次長滿后，細(xì)胞用于提取DNA進(jìn)行PCR鑒定，得到陽性克??；
526.將得到的陽性克隆的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到陽性胚胎干細(xì)胞系。
[0017]步驟S3所述注射的方法如下:
531.將電轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得的陽性胚胎干細(xì)胞系消化重懸成單個(gè)細(xì)胞；
532.用激光破膜儀在囊胚的透明帶上打孔，用注射針將10~20枚陽性胚胎干細(xì)胞打到囊胚腔里面，然后用胚胎培養(yǎng)基KSOMaa (購自美國Zenith Biotech公司)培養(yǎng)2~3小時(shí)后，顯微鏡下觀察囊胚形態(tài)恢復(fù)。
[0018]步驟S3所述的假孕母鼠通過如下方法獲得:將KM母鼠和KM結(jié)扎公鼠按照雌雄比例2:1進(jìn)行合籠飼養(yǎng)，次晨挑選有陰栓且陰門腫脹、紅潤的母鼠，即為假孕母鼠，記作0.5天假孕母鼠，而囊胚注射移植于2.5天假孕母鼠。
[0019]本發(fā)明還提供了上述1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在乙肝相關(guān)研究領(lǐng)域方面的應(yīng)用。
[0020]更具體地，所述應(yīng)用是指1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在研究機(jī)體免疫系統(tǒng)抗乙肝病毒感染、免疫致病過程中和抗乙肝病毒藥物開發(fā)方面的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明所用C57BL/6J鼠由本實(shí)驗(yàn)室保存。C57BL/6J鼠的主要特性為:(摘自《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》，主編:郝光榮，第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，見該書105頁)
(O免疫學(xué)特性=IgG在20月齡前緩慢增加，IgG2b為高值，IgG為低值。無菌飼養(yǎng)較普通飼養(yǎng)者IgG絕對(duì)量低。IgG為高值，有的個(gè)體12個(gè)月齡后可超過800 μ g/mL。無菌飼養(yǎng)的IgM較高。細(xì)胞免疫力隨增齡較少降低,可能與自發(fā)腫瘤較少有關(guān)。較易誘發(fā)免疫耐受性。干擾素產(chǎn)量較高。對(duì)百日咳易感因子(Pertussis HSF)敏感；
(2)形態(tài)學(xué)特性:新生仔中雌性的16.8%、雄性的3%為小眼或無眼癥；新生仔的0.6%出現(xiàn)后肢多趾癥；
(3)生理學(xué)特性:嗜酒精性高，腎上腺貯存脂質(zhì)少；將雄鼠皮膚移植至同系雌鼠，20天后出現(xiàn)排拆；這是因?yàn)榻M織相容性原中存在雄性抗原，C57BL/6J小鼠較其它系小鼠更為顯著；注射酪蛋白后易引起淀粉樣變癥；用可的松可誘發(fā)出現(xiàn)腭裂的概率為20%，對(duì)結(jié)核桿菌敏感，對(duì)鼠痘病毒有一定抗力；
(4)癌發(fā)生率:乳腺癌少發(fā)(乳腺癌率為O~1%);用致癌劑難以致癌。老齡鼠淋巴瘤自發(fā)率為20~25% ;雌鼠白血病為7~16% ;經(jīng)X線照射后肝癌發(fā)生率高；
(5)壽命:最長達(dá)1200天；平均雌鼠692天，雄鼠676天。
[0022]本發(fā)明選用C57BL/6J鼠主要是因?yàn)槠涿珵楹谏遗咦⑸鋾r(shí)胚胎來源為白毛的KM鼠，這樣就無需通過另外的檢測(cè)方法來檢測(cè)嵌合鼠的嵌合率，直接通過毛色就可以判斷嵌合率。
[0023]目前針對(duì)國內(nèi)流行株C型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠研究較少。本發(fā)明利用囊胚注射法在國內(nèi)率先建立一種能穩(wěn)定傳代和高效復(fù)制表達(dá)C型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，為我國乙型肝炎預(yù)防和治療研究提供更加理想的動(dòng)物模型。本發(fā)明通過囊胚注射ES細(xì)胞法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠，C型HBV基因能夠定點(diǎn)重 組ES細(xì)胞(定點(diǎn)重組的結(jié)構(gòu)示意圖如附圖2所示?；蚨c(diǎn)整合技術(shù)又稱為基因打靶，是指構(gòu)建含有同源序列的DNA片段的整合載體，通過各種轉(zhuǎn)化方法，使外源DNA序列與靶序列之間發(fā)生同源重組，從而將靶DNA序列定點(diǎn)破壞，通過一系列篩選手段，最終得到定向轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。基因定點(diǎn)整合技術(shù)的其中一個(gè)方法就是引入重組酶Flp+Cre系統(tǒng)，在胚胎干細(xì)胞(ES cell)中通過置換型載體進(jìn)行同源重組，向基因組靶位點(diǎn)引入選擇標(biāo)記基因，并在其兩側(cè)分別引入同向排列的FRT和Loxp位點(diǎn)。兩條同源染色體都帶有FRT和Loxp位點(diǎn)且引入的FRT和Loxp位點(diǎn)不能干擾祀基因的轉(zhuǎn)錄。
[0024]通過大量的實(shí)驗(yàn)表明，根據(jù)本發(fā)明所述構(gòu)建方法獲得的陽性C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的效率非常高，且能夠穩(wěn)定傳代。經(jīng)過反復(fù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明通過囊胚注射ES細(xì)胞得到的小鼠嵌合率有40%~60%，大大提高了小鼠的轉(zhuǎn)基因效率。另外，本發(fā)明使用囊胚注射ES細(xì)胞的方法，HBV-C基因能夠定點(diǎn)重組ES細(xì)胞，得到的C型HBV嵌合體小鼠陽性率更高，陽性率為50%，明顯高于現(xiàn)有技術(shù)獲得的C型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0025]另外，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因小鼠具有與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)1.3拷貝的C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠不同的特點(diǎn)，該模型的H BV的復(fù)制和表達(dá)效率較高，為進(jìn)一步研究乙肝發(fā)病機(jī)制，肝臟病變的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸機(jī)制研究，為C型HBV感染后機(jī)體的病理改變以及機(jī)體免疫系統(tǒng)在抗病毒感染和免疫致病過程中的作用機(jī)制提供理想的動(dòng)物模型。這一模型的建立將填補(bǔ)國內(nèi)外缺乏此類動(dòng)物模型的空白，使相關(guān)的研究手段更加豐富，也為抗乙肝藥物的研發(fā)提供更加先進(jìn)的評(píng)價(jià)體系和技術(shù)平臺(tái)，為建立乙肝的免疫治療方法并作出評(píng)價(jià)提供一種全新的思路和研究平臺(tái)，可以利用此轉(zhuǎn)基因小鼠模型進(jìn)行乙肝免疫致病機(jī)制的研究及乙肝免疫治療新方法的探索性研究，并為后續(xù)實(shí)現(xiàn)這種新的乙肝疾病模型的產(chǎn)業(yè)化和批量供應(yīng)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，促進(jìn)我國乙肝治療、研究水平的提高。
[0026]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明克服了乙型肝炎研究的傳統(tǒng)轉(zhuǎn)1.3拷貝的C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠HBV復(fù)制和表達(dá)效率較低等技術(shù)問題，提供了一種利用囊胚注射法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)C型HBV定點(diǎn)整合轉(zhuǎn)基因小鼠，獲得能穩(wěn)定傳代和高效的C型乙肝疾病模型，即高效復(fù)制和表達(dá)C型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，填補(bǔ)了國內(nèi)外缺乏此類動(dòng)物模型的空白。
[0027]另外，本發(fā)明構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠使用的ES細(xì)胞來源是C57BL/6小鼠，毛色為黑色，而囊胚來源是KM小鼠，毛色為白色，將ES細(xì)胞注射到囊胚后，生出的小鼠的毛色是部分是灰的或黑的，而且可以遺傳到下一代，這樣就可以通過毛色簡(jiǎn)單地鑒定嵌合率。而且選擇繁殖能力強(qiáng)的KM鼠做假孕鼠，產(chǎn)仔率高，母性好。
[0028]本發(fā)明構(gòu)建方法構(gòu)建得到的轉(zhuǎn)基因小鼠能夠全面、真實(shí)地反映臨床乙肝發(fā)生、發(fā)展過程，為乙肝發(fā)病機(jī)制、肝臟病變的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸機(jī)制研究、機(jī)體免疫系統(tǒng)在抗病毒感染和免疫致病過程中的作用機(jī)制研究及抗乙肝藥物的研發(fā)和評(píng)價(jià)提供理想動(dòng)物模型，為建立乙肝的免疫治療方法并作出評(píng)價(jià)提供了一種全新的思路和研究平臺(tái)，促進(jìn)我國乙肝治療研究水平的提高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒示意圖。
[0030]圖2為C型HBV基因定點(diǎn)重組ES細(xì)胞的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0031]圖3為本發(fā)明構(gòu)建方法構(gòu)建得到的陽性嵌合鼠?！揪唧w實(shí)施方式】
[0032]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備和方法為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑、設(shè)備和方法。
[0033]除非特別說明，本發(fā)明實(shí)施例所用C57BL/6J小鼠和KM小鼠均為市購。
[0034]實(shí)驗(yàn)例I構(gòu)建1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠 1、胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)系的建立
(I)取懷孕3.5天的C57BL/6J雌性孕鼠，斷頸處死。
[0035](2)用75%酒精將Sll處死的孕鼠消毒，盡量噴濕全身。
[0036](3)打開孕鼠腹腔，修除去脂肪和系膜，從輸卵管根部及子宮下端分叉處剪下雙側(cè)子宮，將雙角子宮于陰道處剪斷。
[0037](4)注射器吸入M2 (購自美國Sigma公司)作為沖胚液，注射器的針頭在使用之前把針尖剪掉磨平滅菌；將注射器從子宮的一端插入子宮腔內(nèi)2~3mm，夾緊，吹入沖胚液，再從子宮的另一端插入注射器，吹入沖胚液。
[0038](5)將上述沖胚液取出置于平皿中，平皿置于解剖鏡下，用口叼管吸取少量沖胚液，將囊胚吸出。
[0039](6)然后將囊胚放入KSOMaaa胚胎培養(yǎng)基(購自美國Zenith Biotech公司)中，觀察，選擇比較好的囊胚。
[0040](7)將選擇的囊胚吹入預(yù)先接種了飼養(yǎng)層細(xì)胞(北京思賽因公司提供)的4孔板或24孔板，換用小鼠胚胎干細(xì)胞建系培養(yǎng)基(購自北京思賽因公司)，每孔中放I個(gè)囊胚。
[0041](8)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，囊胚逐漸長大，最后貼壁，滋胚層展開，囊胚的內(nèi)細(xì)胞不斷增殖。
[0042](9)培養(yǎng)4~6天后，囊胚的內(nèi)細(xì)胞成為一團(tuán)圓柱形或凸起細(xì)胞團(tuán)，此時(shí)可離散囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，得到胚胎干細(xì)胞系。
[0043]2、本實(shí)施例所用的1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒由中國人民解放軍第302醫(yī)院贈(zèng)與，序列全長如SEQ ID N0.1所示。
[0044]所述1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒的構(gòu)建方法為:通過Spe I和Apa I兩個(gè)酶切位點(diǎn)將1.3倍加長片段C型HBV的DNA片段連接入pcDNA3.1質(zhì)粒中，得到1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒的示意圖如附圖1所示。
[0045]3、1.3拷貝C基因型HBV電轉(zhuǎn)導(dǎo)到胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)
(1)將培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞系(12孔板一個(gè)孔長滿)用胰酶消化為單個(gè)細(xì)胞，加入終止培養(yǎng)基(廣州科學(xué)院與健康研究院提供)終止消化，轉(zhuǎn)移到15mL離心管中1000rpm離心5分鐘，去除上清(盡量完全去除干凈)，然后用100μL的opt1-MEM (購自美國Gbico公司)懸浮，轉(zhuǎn)移到 1.5mL的離 心管(EP)管中；
(2)加入電轉(zhuǎn)所需的1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒5Pg，用移液槍輕輕混勻，再轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯中，用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)后迅速加入細(xì)胞培養(yǎng)基(廣州科學(xué)院與健康研究院提供)，然后鋪到細(xì)胞板(6孔板I個(gè)孔)中。
[0046](3)第二天，更換培養(yǎng)基為有抗性的培養(yǎng)基(使用Wg/mL的puix)進(jìn)行篩選)，每天進(jìn)行換液(抗性的)。[0047](4) 5~7天后，只有轉(zhuǎn)入了質(zhì)粒的細(xì)胞才能生長成集落克隆，分別挑取篩選出來的克隆到96孔板中，每個(gè)孔I個(gè)細(xì)胞克隆。
[0048](5)第二天，將細(xì)胞傳代到48孔板中，再次長滿后，大部分細(xì)胞可以用于提取DNA進(jìn)行PCR鑒定，剩下的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)直至鑒定結(jié)果出來。
[0049](6)將得到的陽性克隆的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到陽性胚胎干細(xì)胞系。
[0050]經(jīng)電轉(zhuǎn)導(dǎo)后，1.3拷貝C型HBV基因能夠定點(diǎn)重組ES細(xì)胞，定點(diǎn)重組ES細(xì)胞的示意圖如附圖2所示。
[0051 ] 4、陽性胚 胎干細(xì)胞囊胚注射
(I) 3.5天KM母鼠通過沖雙側(cè)子宮取得囊胚。
[0052](2)將電轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得的陽性胚胎干細(xì)胞系消化重懸成單個(gè)細(xì)胞。
[0053](3)用激光破膜儀在囊胚的透明帶上打孔，用注射針將15~20枚的陽性胚胎干細(xì)胞打到囊胚腔里面，然后用KSOMaa胚胎培養(yǎng)基(購自美國Zenith Biotech公司)培養(yǎng)2~3小時(shí)后，顯微鏡下觀察囊胚形態(tài)恢復(fù)。
[0054]5、囊胚移植 (I)假孕母鼠的制備
KM鼠繁殖能力強(qiáng)，產(chǎn)仔率高，母性好，因此選用KM鼠來制備假孕鼠。
[0055]假孕母鼠的制備方法如下:將KM母鼠和KM結(jié)扎公鼠按照雌雄比例2:1進(jìn)行合籠飼養(yǎng)，次晨挑選有陰栓且陰門腫脹、紅潤的母鼠，即為假孕母鼠，記作0.5天假孕母鼠，而囊胚注射移植于2.5天假孕母鼠。
[0056]將注射好的囊胚移植到2.5天的假孕母鼠的子宮，培育得到1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0057]6、結(jié)果統(tǒng)計(jì)
結(jié)果共注射囊胚221枚，成活180枚，注射成活率81.45%。共移植假孕雌鼠14只，10只懷孕，假孕雌鼠妊娠率71.4% ;產(chǎn)仔10只，其中2只產(chǎn)后第二天被吃，存活的8只H)代小鼠。
[0058]實(shí)驗(yàn)例2實(shí)施例1制備1.3拷貝C型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定 1、小鼠嵌合率的統(tǒng)計(jì)
(I)根據(jù)小鼠毛色判斷小鼠的嵌合率:由于ES細(xì)胞來源于黑色毛的C57BL/6J鼠，而囊胚來源于白毛的KM鼠，因而根據(jù)出生小鼠黑毛的百分率來判斷小鼠的嵌合率。
[0059](2)將得到的嵌合鼠(H)代)和正常的KM鼠合籠。如果得到的Fl代小鼠是嵌合鼠，證明了該H)代嵌合鼠有生殖嵌合，可以遺傳到下一代。
[0060]2、ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠血清和尿液中的乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝e抗原(HBeAg )，檢測(cè)方法如下:
(I)乙肝表面抗原(HBsAg)的檢測(cè)(ELISA法)
利用乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒(購自上?？迫A生物技術(shù)有限公司)生產(chǎn)許可證號(hào):滬20110148，批準(zhǔn)文號(hào):國藥準(zhǔn)字S10910113，生產(chǎn)批號(hào):20130105進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法參照說明書進(jìn)行。
[0061]檢測(cè)具體操作如下:
S1.配置工作濃度洗滌液，用純水進(jìn)行25倍稀釋；52.根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求(9個(gè)孔，一個(gè)空白對(duì)照孔，兩個(gè)陰性對(duì)照孔，兩個(gè)陽性對(duì)照孔，4個(gè)嵌合鼠樣品)，選擇9個(gè)孔的反應(yīng)板條；
53.分別加入75PL的4個(gè)嵌合鼠樣品和陰性對(duì)照、陽性對(duì)照(陰性對(duì)照何陽性對(duì)照為試劑盒自帶)于反應(yīng)孔中(預(yù)留陽性對(duì)照2孔，陰性對(duì)照2孔，空白對(duì)照I孔)。然后用封片紙覆蓋反應(yīng)板，將反應(yīng)板置于37°C孵育60min ；
54.取出反應(yīng)板，撕去封片，在已加入待測(cè)樣本和陰、陽性對(duì)照的孔中加入50μL酶結(jié)合物(試劑盒自帶)，空白對(duì)照孔不加，輕輕震蕩10s，用封片紙覆蓋反應(yīng)條，將反應(yīng)板置于37°C孵育30min ；
55.洗板:取出反應(yīng)板，撕去封片，棄去孔內(nèi)液體，用步驟SI配置的工作濃度洗滌液注滿各孔，靜置30~60s，甩干，重復(fù)5次后，在干凈的吸水紙上拍干；
56.在所有孔內(nèi)加入顯色劑A、顯色劑B各50μL，混勻；輕輕震蕩10s，用封片紙覆蓋反應(yīng)條，將反應(yīng)板置于37°C孵育30min ；
57.在所有孔內(nèi)加入50μL終止液，振蕩反應(yīng)板5s;酶標(biāo)儀讀數(shù)，波長為450nm和630nm雙波長，先用空白孔調(diào)零，然后讀取各孔OD值。
[0062]結(jié)果判斷:C0V=陰性對(duì)照平均值+0.1。當(dāng)待測(cè)樣本OD值≥COV時(shí)，判斷為陽性；當(dāng)待測(cè)樣本OD值〈C0V時(shí)，判斷為陰性。
[0063](2)乙肝 e 抗原(HBeAg) (ELISA 法)
乙型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒(購自上?？迫A生物技術(shù)有限公司)生產(chǎn)許可證號(hào):滬食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20030916號(hào)，產(chǎn)品注冊(cè)號(hào):國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2012第3400740號(hào)，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào):YZB/國2142-2012生產(chǎn)批號(hào):20121206進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法參照說明書進(jìn)行。
[0064]檢測(cè)具體操作如下:
S1.配置工作濃度洗滌液，用純水進(jìn)行25倍稀釋；
S2.根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，選擇9個(gè)孔的反應(yīng)板條(9個(gè)孔，一個(gè)空白對(duì)照孔，兩個(gè)陰性對(duì)照孔，兩個(gè)陽性對(duì)照孔，4個(gè)嵌合鼠樣品)；
S3.每孔加入待測(cè)樣品50μL，設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照(陰性對(duì)照何陽性對(duì)照為試劑盒自帶)各2孔，每孔加入陰性對(duì)照(或陽性對(duì)照)各50μL，并設(shè)空白對(duì)照I孔；
S4.每孔加入50μL酶結(jié)合物(空白對(duì)照孔不加)，充分混勻，封板，置于37°C孵育30min ；
S5.洗板:棄去孔內(nèi)液體，用步驟SI配置的工作濃度洗滌液注滿各孔，靜置5s，甩干，重復(fù)5次后拍干；
S6.每孔加入顯色劑A、顯色劑B各50μL，混勻，封板，置于37°C孵育15min；
S7.每孔加入終止液50μL，混勻；酶標(biāo)儀讀數(shù)，波長為450nm和630nm雙波長，先用空白孔調(diào)零，然后讀取各孔OD值。
[0065]結(jié)果判斷=COV=陰性對(duì)照平均OD值X 2.1 (陰性對(duì)照OD值低于0.050按0.050計(jì)算，高于0.050按實(shí)際OD值計(jì)算)。當(dāng)待測(cè)樣本OD值≥ COV時(shí)，判斷為陽性；當(dāng)待測(cè)樣本OD值〈C0V時(shí)，判斷為陰性。
[0066]3、鑒定結(jié)果
8只H)代小鼠中有陽性嵌合小鼠4只，嵌合鼠陽性率為50%。
[0067]實(shí)驗(yàn)例3實(shí)施例1制備1.3拷貝C型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的傳代鑒定1、將實(shí)施例制備得到的嵌合鼠(H)代)和正常的KM鼠合籠，得到Fl代小鼠32只。
[0068]2、小鼠嵌合率的統(tǒng)計(jì)，以及ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠血清和尿液中的乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝e抗原(HBeAg)的方法同實(shí)施例2。
[0069]3、鑒定結(jié)果
(1)32只Fl代小鼠中有5只為陽性嵌合小鼠，嵌合鼠陽性率為15.6%，表明本發(fā)明方法構(gòu)建得到能夠傳代的嵌合鼠。
[0070](2) 5只Fl代嵌合小鼠分別編號(hào)為BI~B5。
[0071]ELISA檢測(cè)乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝e抗原(HBeAg)的結(jié)果顯示，BI~B5小鼠血清和尿液中的HBsAg和HBeAg均為陽性。測(cè)得OD值如表1所示:
表1 ELISA檢測(cè)Fl代嵌合小鼠血清和尿液中的HBsAg和HBeAg
【權(quán)利要求】
1.一種1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下: .51.胚胎干細(xì)胞系的建立； .52.將1.3倍加長片段C型HBV質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)到胚胎干細(xì)胞，經(jīng)過鑒定得到陽性的胚胎干細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)； .53.把陽性胚胎干細(xì)胞注射到囊胚中，將注射好的囊胚移植到假孕母鼠的子宮，培育得到1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，SI所述胚胎干細(xì)胞系的建立方法如下: .511.取懷孕3.5天的C57BL/6J雌性孕鼠，斷頸處死； .512.用酒精將Sll處死的孕鼠消毒； .513.打開孕鼠腹腔，修除去脂肪和系膜，從輸卵管根部及子宮下端分叉處剪下雙側(cè)子宮，將雙角子宮于陰道處剪斷； .514.注射器吸入沖胚液，注射器的針頭在使用之前把針尖剪掉磨平滅菌；將注射器從子宮的一端插入子宮腔內(nèi)，夾緊，吹入沖胚液，再從子宮的另一端插入注射器，吹入沖胚液； .515.將上述沖胚液取出置于平皿中，平皿置于解剖鏡下，用口叼管吸取少量沖胚液，將囊胚吸出； .516.然后將囊胚放入胚胎培養(yǎng)基中，觀察，選擇比較好的囊胚； .517.將選擇的囊胚吹入預(yù)先接種了飼養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞板，換用小鼠胚胎干細(xì)胞建系培養(yǎng)基，每孔中放I個(gè)囊胚； .518.放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，囊胚逐漸長大，最后貼壁，滋胚層展開，囊胚的內(nèi)細(xì)胞不斷增殖； .519.培養(yǎng)4~6天后，囊胚的內(nèi)細(xì)胞成為一團(tuán)圓柱形或凸起細(xì)胞團(tuán)，此時(shí)可離散囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，得到胚胎干細(xì)胞系。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，S2所述電轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法如下: .521.將培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞系用胰酶消化為單個(gè)細(xì)胞，加入終止培養(yǎng)基終止消化，離心，去除上清，然后用減血清培養(yǎng)基opt1-MEM進(jìn)行懸??； .522.懸浮液中加入電轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的C型HBV質(zhì)粒，混勻，轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯中，用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)導(dǎo)，電轉(zhuǎn)導(dǎo)后迅速加入細(xì)胞培養(yǎng)基，然后鋪到細(xì)胞板中； .523.第二天，更換培養(yǎng)基為嘌呤霉素抗性的培養(yǎng)基，每天進(jìn)行換液； .524.培養(yǎng)5~7天后，只有轉(zhuǎn)入了質(zhì)粒的細(xì)胞才能生長成集落克隆，分別挑取篩選出來的克隆到細(xì)胞板中，每個(gè)孔I個(gè)細(xì)胞克?。? .525.第二天，將細(xì)胞傳代到新的細(xì)胞板中，再次長滿后，細(xì)胞用于提取DNA進(jìn)行PCR鑒定，得到陽性克??； . 526.將得到的陽性克隆的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到陽性胚胎干細(xì)胞系。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，S3所述注射的方法如下: .531.將電轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得的陽性胚胎干細(xì)胞系消化重懸成單個(gè)細(xì)胞； .532.用激光破膜儀在囊胚的透明帶上打孔，用注射針將陽性胚胎干細(xì)胞打到囊胚腔里面，然后用KSOMaa胚胎培養(yǎng)基培養(yǎng)2~3小時(shí)后，顯微鏡下觀察囊胚形態(tài)恢復(fù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，S3所述的假孕母鼠通過如下方法獲得:將KM母鼠和KM結(jié)扎公鼠按照雌雄比例2:1進(jìn)行合籠飼養(yǎng)，次晨挑選有陰栓且陰門腫脹、紅潤的母鼠，即為假孕母鼠，記作0.5天假孕母鼠，而囊胚移植于2.5天假孕母鼠。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述所述構(gòu)建方法制備得到的1.3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在乙肝相關(guān)研究領(lǐng)域方面的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，1 .3拷貝C基因型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在研究機(jī)體免疫系統(tǒng)抗乙肝病毒感染、免疫致病過程中和抗乙肝病毒藥物開發(fā)方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/0735GK103952441SQ201410011674
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】劉光澤, 陳媚娟, 李秀梅, 謝勇, 張振偉, 孔祥平 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第四五八醫(yī)院