一種指導(dǎo)硝酸甘油用藥及健康飲酒的引物組合物、多重基因檢測試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種指導(dǎo)硝酸甘油用藥及健康飲酒的引物組合物、多重基因檢測試劑盒及其使用方法，包括超純水，X溶液，10×PCR緩沖液，PCR引物，25mM氯化鎂溶液，DNA聚合酶和陽性對(duì)照品，特點(diǎn)是PCR引物包括2個(gè)與硝酸甘油用藥及健康飲酒相關(guān)基因上的2個(gè)SNP位點(diǎn)上的不同基因型的正反向擴(kuò)增引物及反應(yīng)內(nèi)參的正反向擴(kuò)增引物，其基因序列如SEQ?ID?NO.1～NO.8所示；其使用方法包括采集樣本并提取核酸的步驟；以提取的核酸為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)的步驟；最后毛細(xì)電泳分離樣品的步驟，優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、通量高、可靠性強(qiáng)、成本低、無假陰性結(jié)果。
【專利說明】一種指導(dǎo)硝酸甘油用藥及健康飲酒的引物組合物、多重基因檢測試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多重基因檢測試劑盒及其檢測方法，尤其是涉及一種指導(dǎo)硝酸甘油用藥及健康飲酒的引物組合物、多重基因檢測試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]硝酸甘油為硝基血管擴(kuò)張藥，是防治冠心病心絞痛的特效常用藥品之一。硝酸甘油及其它含硝基藥物(如硝普鈉)在體內(nèi)都可產(chǎn)生活性NO自由基，從而激活平滑肌和其他組織的鳥苷酸環(huán)化酶，增加cGMP的合成。cGMP激活cGMP依賴的蛋白激酶，改變平滑肌中不同蛋白的磷酸化，使肌球蛋白(myosin)輕鏈去磷酸化。已知肌球蛋白輕鏈的磷酸化與維持平滑肌的收縮狀態(tài)有關(guān)，實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明硝基血管擴(kuò)張劑的藥理和生化作用與血壓內(nèi)皮衍生舒張因子(EDRF)(已證明為NO或含NO的物質(zhì))相同。研究發(fā)現(xiàn)ALDH2基因與硝酸甘油轉(zhuǎn)化為NO密切相關(guān)。但如果病人ALDH2基因中發(fā)生Glu504Lys突變，就會(huì)影響ALDH2的酯酶活性，使硝酸甘油在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過程受阻，從而不能有效代謝硝酸甘油，導(dǎo)致一氧化氮減少甚至無法產(chǎn)生一氧化氮，藥物也就難以有效發(fā)揮作用，長時(shí)間不能解除的心絞痛可能發(fā)展為急性心肌梗塞，引起生命危險(xiǎn)。大約三分之一的東亞人具有ALDH2基因Glu504Lys突變，對(duì)ALDH2基因多態(tài)性的診斷能夠科學(xué)地指導(dǎo)心絞痛患者選擇藥物。
[0003]同時(shí)，ALDH2也是酒精代謝途徑中關(guān)鍵酶基因之一。酒精進(jìn)入體內(nèi)后，首先經(jīng)乙醇脫氫酶IB (ADHlB)催化，代謝為乙醛。乙醛會(huì)進(jìn)一步在乙醛脫氫酶2 (ALDH2)的作用下轉(zhuǎn)化為乙酸，乙酸最終代謝生成C02和水，排出體外。乙醛不穩(wěn)定且容易產(chǎn)生自由基。乙醛蓄積將會(huì)造成許多組織和器官如肝、腎、心、腦嚴(yán)重傷害并可能致癌，如肝癌、胃癌等。世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)在2009年把酒精代謝物乙醛歸為一級(jí)致癌原(與黃曲霉素同級(jí))。ALDH2基因發(fā)生Glu504Lys突變后，編碼得到的是沒有活性的蛋白，乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸受阻，會(huì)造成乙醛堆積。ADHlB基因發(fā)生·Arg48His突變后，乙醇轉(zhuǎn)化成乙醛的速度是野生型的40到100倍，會(huì)導(dǎo)致乙醛迅速產(chǎn)生。對(duì)ALDH2和ADHlB基因多態(tài)性的診斷能夠科學(xué)地指導(dǎo)人們健康飲酒。
[0004]現(xiàn)有的用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測方法主要為基因芯片、熒光定量PCR及Sanger測序法。
[0005](I) qPCR檢測方法:采用熒光淬滅及雙末端標(biāo)記技術(shù)，針對(duì)SNP位點(diǎn)變異設(shè)計(jì)特異性的探針。其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)。其缺點(diǎn)是(I)通量低:不適宜多SNP位點(diǎn)的檢測；難以設(shè)置內(nèi)控基因。(2)成本較高:探針標(biāo)記成本高；若需獲得所有相關(guān)SNP信息，需進(jìn)行多個(gè)檢測試驗(yàn)，疊加成本更加昂貴。
[0006](2)基因芯片法:基因芯片是通過微加工技術(shù)，將數(shù)以萬計(jì)、乃至百萬計(jì)的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規(guī)律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個(gè)二維DNA探針陣列，利用這類芯片與標(biāo)記的生物樣品進(jìn)行雜交，可對(duì)樣品的基因表達(dá)譜生物信息進(jìn)行快速定性和定量分析。DNA芯片:由于高通量等優(yōu)點(diǎn)在SNP檢測中得到大量應(yīng)用，依靠野生型與突變型基因雜交動(dòng)力學(xué)的差異對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測。其優(yōu)點(diǎn)是:(1)高通量并行檢測；(2)操作簡便快速:整個(gè)檢測只需4-8小時(shí)基本可以出結(jié)果。缺點(diǎn):1)不同SNP位點(diǎn)之間的雜交動(dòng)力學(xué)差異不同，在進(jìn)行多位點(diǎn)同時(shí)檢測時(shí)條件難以控制；2)技術(shù)成本昂貴、復(fù)雜:每個(gè)樣品需要一個(gè)芯片，成本大于YlOOO/樣品，不利于大規(guī)模推廣；探針的合成與固定比較復(fù)雜，特別是制作高密度的探針陣列，是主要的限速步驟；3)重復(fù)性差，準(zhǔn)確性低，易出現(xiàn)假陽性假陰性結(jié)果；4)靈敏度較低:芯片法需核酸量較大，一般須先做多重PCR擴(kuò)增，由于引物較多，容易自身產(chǎn)生二聚體，發(fā)夾結(jié)構(gòu)，或由于Tm值不同，而導(dǎo)致擴(kuò)增目的片段效率不同，進(jìn)而影響檢測的靈敏度；5)由于芯片的種類較多，難以制定一個(gè)統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
[0007](3)Sanger (雙脫氧鏈終止法)測序法:Sanger法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，并且在每個(gè)堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測，從而獲得可見的DNA堿基序列。其優(yōu)點(diǎn)是SNP分析金標(biāo)準(zhǔn)，能發(fā)現(xiàn)已知SNP，也能發(fā)現(xiàn)未知SNP。缺點(diǎn)是每個(gè)樣本的每個(gè)位點(diǎn)均需要經(jīng)PCR擴(kuò)增，跑膠，然后切膠純化，再測序。步驟多而分散，成本較高，工作量大，周期長，多個(gè)SNP位點(diǎn)檢測累計(jì)價(jià)格相對(duì)昂貴。
[0008]多重SNP位點(diǎn)檢測方法基于多重PCR和毛細(xì)管電泳(CE)分離技術(shù)。采用多重PCR方法，在同一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)加入≥1對(duì)特異性基因擴(kuò)增引物及反應(yīng)內(nèi)參引物，根據(jù)基因擴(kuò)增片段的大小用毛細(xì)管電泳分離分析多個(gè)SNP位點(diǎn)及基因型，能快速有效地檢測多個(gè)SNP位點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)方法存在的缺陷，具有以下優(yōu)勢:
[0009]1、高通量:本系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)單個(gè)反應(yīng)檢測30-40個(gè)位點(diǎn)。
[0010]2、準(zhǔn)確性強(qiáng):采用CE對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離，可將非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物、引物二聚體和特異性擴(kuò)增產(chǎn)物分離，最大程度降低假陽性；
[0011]3、敏感性高，結(jié)果重復(fù)性好:本系統(tǒng)克服了傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增方法的不均等擴(kuò)增造成的偏差，提高了對(duì)一套目的基因進(jìn)行定性的速度和敏感性，采用激光誘導(dǎo)熒光-PMT，具有超高靈敏度；
[0012]4、方法簡便，使用經(jīng)濟(jì):本發(fā)明提供從試劑、多重PCR引物設(shè)計(jì)、結(jié)果分析等全套實(shí)驗(yàn)方案；每個(gè)樣品的檢測成本少于Y50,利于大規(guī)模推廣；
[0013]5、靈活性強(qiáng):可隨時(shí)根據(jù)需求調(diào)整檢測的靶基因。
[0014]6、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。
[0015]目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于基于多重PCR和CE分離的多重SNP檢測指導(dǎo)噻嗪類利尿藥用藥的試劑盒及其使用方法的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、通量高、可靠性強(qiáng)、成本低、無假陰性結(jié)果的基于多重SNP檢測系統(tǒng)的指導(dǎo)硝酸甘油用藥及健康飲酒的引物組合物。
[0017]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于提供包含上述引物組合物的試劑盒及其使用方法。
[0018]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)手段是:一種指導(dǎo)硝酸甘油用藥及健康飲酒的引物組合物，包括以下2個(gè)與硝酸甘油用藥及健康飲酒相關(guān)基因上的2個(gè)SNP位點(diǎn)上的不同基因型的正反向擴(kuò)增引物的正反向擴(kuò)增引物及反應(yīng)內(nèi)參的正反向擴(kuò)增引物，其核酸序列如下表1所示:
[0019]表1
【權(quán)利要求】
1.一種指導(dǎo)硝酸甘油用藥及健康飲酒的引物組合物，其特征在于，包括以下2個(gè)與硝酸甘油用藥及健康飲酒相關(guān)基因上的2個(gè)SNP位點(diǎn)上的不同基因型的正反向擴(kuò)增引物的正反向擴(kuò)增引物及反應(yīng)內(nèi)參的正反向擴(kuò)增引物，其核酸序列如下:
2.一種指導(dǎo)硝酸甘油用藥及健康飲酒的多重基因檢測試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求I所述的引物組合物、PCR反應(yīng)液和陽性對(duì)照品；所述PCR反應(yīng)液包括以下組分:超純水，X溶液，10XPCR緩沖液，25mM氯化鎂溶液，DNA聚合酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種指導(dǎo)硝酸甘油用藥及健康飲酒的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，所述的通用引物正向擴(kuò)增引物序列為AGGTGACACTATAGAATAJn SEQ ID N0.9所示；反向擴(kuò)增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA,如SEQ ID N0.10所示；所述的通用引物正向擴(kuò)增引物帶熒光標(biāo)記。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種指導(dǎo)硝酸甘油用藥及健康飲酒的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:所述的陽性對(duì)照品為上述2個(gè)與硝酸甘油用藥及健康飲酒相關(guān)基因上的2個(gè)SNP位點(diǎn)上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段。
5.上述一種指導(dǎo)硝酸甘油用藥及健康飲酒的多重基因檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，具體包括以下步驟: (1)采集樣本并提取核酸 采集患者口腔拭子或血液樣品的分離培養(yǎng)物，從分離培養(yǎng)物中提取核酸； (2)以提取的核酸為模板進(jìn)行PCR反應(yīng) 取DNA樣品2 μ L，10 X PCR緩沖液2 μ L，25mM的氯化鎂3.4 μ L，PCR弓丨物溶液2 μ L，DNA聚合酶0.6 μ L，X溶液2 μ L，超純水10 μ L混勻后加入到96孔樣品板上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件:95°C 2分鐘；94aC 30秒鐘，55°C 30秒鐘，70°C I分鐘，循環(huán)35次；70°C I分鐘；4°C直至收取PCR產(chǎn)物；其中所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)和通用引物，所述的通用引物正向擴(kuò)增引物序列為AGGTGACACTATAGAATAJn SEQ ID N0.9所示；反向擴(kuò)增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，如SEQ ID N0.10所示；所述的通用引物正向擴(kuò)增引物帶熒光標(biāo)記；PCR引物溶液中各PCR引物濃度均為200nM，所述的PCR引物包括以下2個(gè)與硝酸甘油用藥及健康飲酒相關(guān)基因上的2個(gè)SNP位點(diǎn)上的不同基因型的正反向擴(kuò)增引物及反應(yīng)內(nèi)參的正反向擴(kuò)增引物，基因序列如序列表中SEQ ID N0.1~N0.8所示； (3)毛細(xì)電泳分離樣品取PCR產(chǎn)物0.1-1 μ L，上樣緩沖液38.75 μ L, DNA Marker0.5 μ L，礦物油一滴混合均勻后加入到96孔分離液板上進(jìn)行毛細(xì)電泳分離樣品，將遺傳分析儀軟件獲得的圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比，獲得指 導(dǎo)硝酸甘油用藥及健康飲酒相關(guān)基因的SNP位點(diǎn)的等位基因型。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103849681SQ201410014274
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】吳勇, 曾縣平, 南麗 申請人:寧波海爾施基因科技有限公司