纖維素降解酶及其基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種纖維素降解酶及其基因序列，所述的纖維素降解酶具有SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。本發(fā)明的酶對(duì)多種微晶纖維素及濾紙具有較高的降解活性，可用于研究纖維素降解機(jī)理，以及作為潛在的纖維素生物轉(zhuǎn)化的輔助因子。
【專利說明】纖維素降解酶及其基因
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及纖維素降解酶及其基因，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】:
[0002]纖維素是地球上數(shù)量最大的可再生性能源物質(zhì)，纖維素的降解、轉(zhuǎn)化是自然界碳素循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，對(duì)這個(gè)過程的有效利用可望在能源、飼料和食物的持續(xù)供應(yīng)上發(fā)揮巨大的作用。但是，至今纖維素的轉(zhuǎn)化效率低，成本高，纖維素降解比較困難。所以新降解纖維素相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)與克隆是高效降解纖維素，實(shí)現(xiàn)纖維素生物轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003]本發(fā)明通過宏基因組文庫的功能篩選、基因克隆、基因測(cè)序等技術(shù)，在中國(guó)松材線蟲中獲得了一種新的降解纖維素相關(guān)基因，該基因被命名為Cen502。該基因全長(zhǎng)約1，398bpDNA序列，共編碼465個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明通過基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)，確定該基因具有降解多種纖維素底物的功能；對(duì)基因(cen502)的序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，該基因與已有的降解纖維素基因具有一定的同源性，但是系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，該基因單獨(dú)位于一個(gè)獨(dú)立分支；所以，該基因?qū)儆诮到饫w維素的一個(gè)新基因，可以用來研究松材線蟲致病機(jī)制，松材線蟲與其宿主的相互關(guān)系，也可以作為潛在的纖維素生物轉(zhuǎn)化的輔助因子。
【具體實(shí)施方式】:
[0004]1、發(fā)明人在中國(guó)南陽松材線蟲疫區(qū)采集到了被感染的松木，并分離到了松材線蟲。對(duì)該樣品清洗，提取宏基因組，構(gòu)建了宏基因組文庫。
[0005]2、根據(jù)文獻(xiàn)，從松材線蟲及其伴生菌的樣品中提取總DNA，以柯斯質(zhì)粒為載體構(gòu)建了 I個(gè)含約9600個(gè)克隆的宏基因組文庫，對(duì)文庫進(jìn)行活性篩選獲得I個(gè)既表達(dá)CMCase活性又表達(dá)β-glucosidase酶活性的克隆。亞克隆及測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)I個(gè)潛在的可編碼465個(gè)氨基酸的ORF (Open Reading Frame),其蛋白質(zhì)產(chǎn)物與I個(gè)來源于BaciIIus polymyxa的beta-glucosidase基因bglA的同源性最高,兩者的一致性為91%,相似性為87%。
[0006]3、基因表達(dá)分析
[0007]3.1載體構(gòu)建
[0008]首先克隆cen502基因，具體是將該基因的PCR產(chǎn)物回收后，直接連接到pMD18_T載體上，得到pMD18-T-Cen502。以pMD18-T_Cen502載體作為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物5’ -ATCTGGATCCATGAAAAAGCTGTG-3’ 和 5’ -ATCGCTCGAGTCCGAGCAATTCAAAG-3 ’，分別引入BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增得到的1.4kb條帶用內(nèi)切酶BamHI和XhoI雙酶切，載體pET30a (商購(gòu)得到)同 樣用BamHI和XhoI雙酶切，回收大的片段，然后用T4DNA連接酶連接兩個(gè)大的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21 (DE3)，利用LB氨芐青霉素平板篩選重組轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒并用內(nèi)切酶酶切鑒定。
[0009]3.2大腸桿菌的轉(zhuǎn)化[0010]大腸桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化按照常規(guī)方法進(jìn)行。
[0011]3.3異丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)陽性轉(zhuǎn)化子分泌表達(dá)
[0012]將陽性菌轉(zhuǎn)接入50mLLB培養(yǎng)液，37 °C 150r/min培養(yǎng)過夜，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD6000.7)加IPTG(0.1mM)誘導(dǎo)表達(dá)，再培養(yǎng)5h。然后，將其轉(zhuǎn)到添加0.2%羧甲基纖維素(CMC)的LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)一定的時(shí)間，用0.2%的剛果紅染色20min，然后用Imol/LNaCl溶液洗滌20min，觀察水解圈的大小。
[0013]3.4表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳
[0014]將陽性轉(zhuǎn)化子從斜面接入到IOmL含有10 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37°C 200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，以2%的接種量轉(zhuǎn)接至25mL新鮮液體LB培養(yǎng)基，繼續(xù)于370C 200r/min 培養(yǎng)至 0D600=1 左右，在 30°C下采用 0.2mmol/L 的 IPTG誘導(dǎo) 5h。取 20 μ L 菌液加入5 μ L5 X SDS-PAGE電泳加樣緩沖液，100°C水浴5min，取10 μ L進(jìn)樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。SDS-PAGff電泳在51KD左右有表達(dá)蛋白帶，通過收集條帶得到純化后的纖維素酶蛋白樣品。
[0015]3.5纖維素酶活性測(cè)試
[0016]將表達(dá)出來的酶進(jìn)行分離純化，用純酶測(cè)定的酶活。
[0017]酶活計(jì)算公式:酶活=還原糖濃度X稀釋倍數(shù)X 1000/作用時(shí)間XVXT纖維素酶活力的國(guó)際單位:ImL酶底物反應(yīng)液Imin內(nèi)產(chǎn)生相當(dāng)于I μ g/mL葡萄糖的還原糖量規(guī)定為I國(guó)際單位(IIU)。
[0018]降解纖維素酶活力采用3，5- 二硝基水楊酸法(DNS)測(cè)定:取1.5mL配好的CMC溶液與帶有15mL刻度的試管中，每支試管分別加入離心后的酶液0.5mL混勻，放入50°C恒溫水浴中糖化60min，取出加入DNS試劑2mL，沸水浴中煮沸l(wèi)Omin，用蒸餾水定容至15mL，在冷水中冷卻。測(cè)得0D550值，查閱葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出含糖量。
[0019]濾紙酶活性采用濾紙條作為底物來測(cè)定:取50mg(約lX6cm)濾紙條，將離心后的酶液吸取0.5mL，放入試管，加入1.5mLHAC-NaAC緩沖液，放入50°C恒溫水浴中糖化60min，取出加入DNS試劑2mL，沸水浴中煮沸l(wèi)Omin，用蒸餾水定容至15mL，在冷水中冷卻。同上測(cè)得OD值，查閱葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出含糖量。
[0020]標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取7只帶有15mL刻度的試管，按下表取試劑。
[0021]表1測(cè)酶活時(shí)取試劑量的表
[0022]
【權(quán)利要求】
1.一種纖維素降解酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列為SEQ ID N0.1或者是與SEQID N0.1的氨基酸序列具有99%以上同源性的序列。
2.權(quán)利要求1所述的纖維素降解酶的基因，其特征在于所述的基因氨基酸序列為SEQID N0.2。
3.權(quán)利要求1所述的纖維素降解酶在降解纖維素中的應(yīng)用，優(yōu)選的，在降解微晶纖維素和/或?yàn)V紙中的應(yīng)用。
4.一種載體，其特征在于含有權(quán)利要求2所述的序列。
5.權(quán)利要求2所述的基因或權(quán)利要求4所述的載體在研究松材線蟲的致病機(jī)理、松材線蟲與其宿主之間的相互關(guān)系，或作為潛在的纖維素生物轉(zhuǎn)化的輔助因子中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103911360SQ201410014799
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】牛秋紅, 張 林, 樊永欣, 鄭豪盈 申請(qǐng)人:南陽師范學(xué)院