一種預(yù)測褐飛虱繁殖力的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種預(yù)測褐飛虱繁殖力的方法，其步驟如下：（1）提取褐飛虱總RNA；（2）合成第一鏈cDNA；（3）PCR反應(yīng)；（4）熒光定量PCR檢測繁殖力相關(guān)基因在四個種群中的表達(dá)；（5）計算繁殖力。本發(fā)明的方法能夠有效、快速、準(zhǔn)確地預(yù)測褐飛虱種群的繁殖力，具有廣闊應(yīng)用空間。
【專利說明】一種預(yù)測褐飛虱繁殖力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種預(yù)測褐飛虱繁殖力的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]褐飛風(fēng)(Nilaparvata Iugens),別名褐稻風(fēng),是稻飛風(fēng)的一種。褐飛風(fēng)有遠(yuǎn)距離遷飛習(xí)性，是我國和許多亞洲國家當(dāng)前水稻上的首要害蟲。褐飛虱種群數(shù)量的預(yù)測包括長中期預(yù)測和短期預(yù)測。長中期預(yù)測主要是利用歷年田間蟲情數(shù)據(jù)、馬爾可夫鏈理論和氣象資料等進(jìn)行分析。種群數(shù)量的短期預(yù)測主要是根據(jù)遷入蟲量、存活率和增殖倍數(shù)等來進(jìn)行。然而，由于褐飛虱本身的遺傳差異也能影響繁殖力，這些預(yù)測模型存在著局限性。已有研究表明，個體之間的遺傳差異可導(dǎo)致其繁殖力有顯著區(qū)別，例如，抗吡蟲啉(殺蟲劑)的褐飛虱的種群增長趨勢指數(shù)只有對殺蟲劑敏感的褐飛虱的約10%。短翅型雌蟲繁殖力比長翅型要高。因此，如何有效地預(yù)測預(yù)報褐飛虱，從而實現(xiàn)有效控制，有著重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對以上要解決的技術(shù)問題，提供一種能夠有效、準(zhǔn)確地預(yù)測褐飛虱繁殖力的方法。
[0004]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種預(yù)測褐飛虱繁殖力的方法，其步驟如下:
[0005](I)提取褐飛虱總RNA ；
[0006](2 )合成第一鏈 cDNA ；
[0007](3) PCR 反應(yīng)；
·[0008](4)熒光定量PCR檢測Fizzy、Sxl、VgR基因的表達(dá)量；
[0009](5)將上述獲得的三個基因的表達(dá)量代入以下算式，算出褐飛虱的繁殖力:
[0010]繁殖力=97.2477-107.8780*Fizzy+220.4907*Sxl_168.1500*VgR R2=0.9316。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的方法，所述步驟(1)的具體操作為:取褐飛虱至1.5ml離心管，加入Iml RNA-Solv Reagent ;勻漿裂解樣品，室溫靜置2_3min ;加入200 μ I氯仿劇烈渦旋15s，冰上放置IOmin ;4。。、12，000Xg離心15min ;小心轉(zhuǎn)移上清至離心管，加入1/3-1/2倍體積的無水乙醇混勻；轉(zhuǎn)移700 μ I混合液至套在收集管RNA柱子中，室溫下10，OOOXg離心30s，棄去濾液；重復(fù)第六步至所有的混合液全部從柱子中過濾；把柱子套回收集管，加300 μ I RNA Wash Buffer I至柱子中，按上述條件離心,棄濾液；用DNase I消化；把柱子套回收集管，加入400μ I RNA Wash Buffer I洗滌柱子，按以上條件離心，棄去濾液；把柱子套回收集管，加入500μ I RNA Wash Buffer II洗滌柱子，按以上條件離心，棄去濾液；使用前，RNA Wash Buffer II需要用無水乙醇稀釋；把柱子套在新收集管，加入500 μ I RNAWash Buffer II洗漆柱子,按以上條件離心,棄去濾液；10，000X g離心空柱2min以上甩干柱子基質(zhì)；把柱子裝在干凈的1.5ml離心管中，加30-50 μ I DEPC Water到柱子基質(zhì)，室溫靜置2min 10，000Xg離心Imin洗脫出RNA。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的方法,所述步驟(2)的具體操作為:在無RNase的0.2ml Eppendorf管中，按以下比例將所需反應(yīng)物加入:5XgDNA Eraser Buffer2 μ 1> gDNA Eraserl μ 1、Total RNA I μ g、RNase Free dH2010 μ I ;加入后在42°C條件下反應(yīng)2min ;再按以下比例將所需反應(yīng)物加入:上述反應(yīng)液 10 μ g、PrimeScript RT Enzyme Mix Il μ 1、RT PrimerMixl μ l、5XPrimeScript Buffer24 μ 1、RNase Free dH204 μ I ;在 PCR 儀上按以下程序進(jìn)行反應(yīng):37°C，15min ;85°C，5s ;反應(yīng)結(jié)束后取1μ I用作RT-PCR檢測。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的方法，所述步驟(3)包括PCR反應(yīng)、PCR產(chǎn)物回收、制備大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞、連接PCR產(chǎn)物和pMD18_T載體、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的方法，所述PCR反應(yīng)的具體步驟為:根據(jù)昆蟲中的Fizzy、Sxl、VgR基因進(jìn)行序列比對，設(shè)計如下簡并引物，其中，F(xiàn)izzy基因的上游引物為5，-ATGTTCARYGGNHCNTGG-3 ’，下游引物為 5 ’ -GTNTTYGGNTCNHTNTAY-3 SxI 基因的上游引物為 5’ -NGCRCAYCGRCTNGCYACNA-3’，下游引物為 5’ -CTANACGTNY TTR ATWTCHT-3’ ；VgR 基因的上游引物為 5’ -ACARAAAGCYGRGTHYACAG-3’，下游引物為 5’ -GGCATRTTRTTRGGRTTYTG-3 ’ ；PCR反應(yīng)程序為:加熱蓋，95°C預(yù)變性5min ;然后95°C變性30s，45°C退火30s，72°C延伸60s，3個循環(huán)；然后再95°C變性30s，48°C退火30s，72°C延伸60s，28個循環(huán)；最后72°C再延伸IOmin ;第一輪PCR反應(yīng)分別以相應(yīng)的外側(cè)引物I，反應(yīng)結(jié)束后，再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，按上述體系和程序進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物分別為相應(yīng)的內(nèi)側(cè)引物2 ;取5μ IPCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，其余用于膠回收。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的方法，所述步驟(4)的具體操作為:設(shè)計Fizzy、Sxl、VgR三個基因熒光定量PCR的擴(kuò)增引物:其中，F(xiàn)izzy基因的上游引物為5’ -CCAGGCAACCAGTAITTAG-3’，下游引物為 5’ -CAGACCAGTTCGGAGGAG-3’ ；Sxl 基因的上游引物為5，-CGGCTTTGGATTTGTAAC-3 ’，下游引物為 5 ’ -ACGGTCTGGCATAGGATA-3，; VgR 基因的上游引物為 5’ -ATCTACTTCACCGATTCTGG-3’，下游引物為 5’ -ATCACCGACCTGTTACCC-3’ ；制作β-Actin和三個繁殖力相關(guān)基因Fizzy、Sxl、VgR熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線:1)分別將含有目的基因片段的質(zhì)粒樣品原液稀釋成原濃度的1/10、1/100、1/1000、1/10000、1/100000、1/1000000 ；2)在10μ I反應(yīng)體系中，將倍比稀`釋濃度的質(zhì)粒樣品加入I μ UpASYBRPremix ExTaq5 μ I及上、下游引物各0.2 μ I,最后各加滅菌超純水補(bǔ)足至10 μ I ;3)突光定量PCR反應(yīng)條件均為:95°C預(yù)變性IOs ;95°C變性5s，58°C退火15s，72°C延伸20s的條件下40個循環(huán)，制作熔點(diǎn)曲線，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法能夠有效、準(zhǔn)確、快速地預(yù)測褐飛虱的繁殖力，從而能夠有效節(jié)省人力物力，提高防治效果。
【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的方法作進(jìn)一步的詳述，以更好地理解本發(fā)明。
[0018]實施例
[0019]選取高、低繁殖力種群、海南種群、廣東種群按照以下方法預(yù)測繁殖力:
[0020]一、提取褐飛虱總RNA
[0021]1.取5-10頭揭飛風(fēng)(雌成蟲10天)至1.5ml離心管，加入1ml RNA-Solv Reagent。
[0022]2.勻漿裂解樣品，室溫靜置2_3min。
[0023]3.加入200 μ I氯仿劇烈渦旋15s，冰上放置lOmin。[0024]4.4。0，12，000\8離心151^11。
[0025]5.小心轉(zhuǎn)移上清至離心管，加入1/3-1/2倍體積的無水乙醇混勻。
[0026]6.轉(zhuǎn)移700 μ I混合液至收集管RNA柱子中，室溫下10，000 X g離心30s，棄去濾液。
[0027]7.重復(fù)第六步至所有的混合液全部從柱子中過濾。
[0028]8.把柱子套回收集管，加300 μ I RNA Wash Buffer I至柱子中，按上柱條件離心，棄濾液；
[0029]9.DNase I 消化:
[0030]9a.配制 DNase 消化液(Digestion Buffer, 73.5 μ I ；RNase-Free DNase I,
1.5 μ I)，混勻。
[0031]9b.將上述消化液轉(zhuǎn)移至柱子膜的正中央，不要將消化液轉(zhuǎn)移至柱子內(nèi)壁。
[0032]9c.室溫靜置 15min。
[0033]10.把柱子套回收集管，加入400 μ I RNA Wash Buffer I洗滌柱子，按以上條件離心，棄去濾液。
[0034]11.把柱子套回收集管，加入500 μ I RNA Wash Buffer II洗滌柱子，按以上條件離心，棄去濾液。使用前，RNA Wash Buffer II需要用無水乙醇稀釋。
[0035]12.把柱子套在新收集管，加入500 μ I RNA Wash Buffer II洗滌柱子，按以上條件離心,棄去濾液。10，000父8離心空柱211^11以上甩干柱子基質(zhì)。
[0036]13.把柱子裝在干凈的1.5ml離心管中，加30-50 μ I DEPC Water到柱子基質(zhì)，室溫靜置2min?！?0，000 Xg離心Imin洗脫出RNA。
[0037]14.將所獲得的RNA用凝膠電泳和分光光度計檢測濃度和純度。0D26(i/28(i值在
1.8-2.0之間可進(jìn)行下一步實驗。
[0038]RNA濃度計算公式:總RNA濃度(μ g/ml) =A260 X稀釋倍數(shù)X 40
[0039]注:以上用到的移液器的吸頭和Eppendorf管均采用Axygen RNase Free產(chǎn)品。
[0040]二、合成第一鏈 cDNA
[0041]1.在無RNase的0.2ml Eppendorf管中，按以下比例將所需反應(yīng)物加入:
【權(quán)利要求】
1.一種預(yù)測褐飛虱繁殖力的方法，其步驟如下: (1)提取褐飛虱總RNA; (2)合成第一鏈cDNA； (3)PCR 反應(yīng)； (4)熒光定量PCR檢測Fizzy、Sxl、VgR基因的表達(dá)量； (5)將上述獲得的三個基因的表達(dá)量代入以下算式，算出褐飛虱的繁殖力:
繁殖力=97.2477-107.8780*Fizzy+220.4907*Sxl_168.1500*VgR R2=0.9316。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)的具體操作為:取褐飛虱至1.5ml離心管,加入1ml RNA-Solv Reagent ;勻衆(zhòng)裂解樣品，室溫靜置2_3min ;加入200 μ I氯仿劇烈潤旋15s,冰上放置IOmin ;4°C、12，000 X g離心15min ;小心轉(zhuǎn)移上清至離心管，加入1/3-1/2倍體積的無水乙醇混勻；轉(zhuǎn)移700 μ I混合液至套在收集管RNA柱子中，室溫下10，OOOXg離心30s，棄去濾液；重復(fù)第六步至所有的混合液全部從柱子中過濾；把柱子套回收集管，加300μ1 RNA Wash Buffer I至柱子中，按上柱條件離心,棄濾液；用DNaseI消化；把柱子套回收集管，加入400 μ I RNA Wash Buffer I洗滌柱子，按以上條件離心，棄去濾液；把柱子套回收集管，加入500 μ I RNA Wash Buffer II洗滌柱子，按以上條件離心，棄去濾液；使用前，RNA Wash Buffer II需要用無水乙醇稀釋；把柱子套在新收集管，加Λ 500 μ I RNA Wash Buffer II洗漆柱子,按以上條件離心,棄去濾液；10，000X g離心空柱2min以上甩干柱子基質(zhì)；把柱子裝在干凈的1.5ml離心管中，加30-50 μ I DEPC Water到柱子基質(zhì)，室溫靜置2min 10, OOOXg離心Imin洗脫出RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)的具體操作為:在無RNase的0.2ml Eppendorf管中，按以下比例將所需反應(yīng)物加入:5Xg DNA Eraser Buffer2 μ 1>gDNA Eraserl μ 1、 Total RNAl μ g、RNase Free dH2010 μ I ;加入后在 42 °C 條件下反應(yīng)2min ;再按以下比例將所需反應(yīng)物加入:上述反應(yīng)液10 μ g、PrimeScript RT Enzyme MixIlμ 1、RT Primer Mixl μ 1、5XPrimeScript Buffer24 μ 1、RNase Free dH204 μ I ;在 PCR儀上按以下程序進(jìn)行反應(yīng):37°C，15min ；85°C,5s ;反應(yīng)結(jié)束后取1μ I用作RT-PCR檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)包括PCR反應(yīng)、PCR產(chǎn)物回收、制備大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞、連接PCR產(chǎn)物和pMD18_T載體、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)的具體步驟為:根據(jù)昆蟲中的Fizzy、Sxl、VgR基因進(jìn)行序列比對，設(shè)計如下簡并引物，其中，F(xiàn)izzy基因的上游引物為5’ -ATGTTCARYGGNHCNTGG-3’，下游引物為 5’ -GTNTTYGGNTCNHTNTAY-3’ ；Sxl 基因的上游引物為 5’-NGCRCAYCGRCTNGCYACNA-3’，下游引物為 5 ’-CTANACGTNYTTR ATWTCHT-3’;VgR 基因的上游引物為 5’ -ACARAAAGCYGRGTHYACAG-3’，下游引物為 5’ -GGCATRTTRTTRGGRTTYTG-3 ’ ；PCR反應(yīng)程序為:加熱蓋，95°C預(yù)變性5min ;然后95°C變性30s，45°C退火30s，72°C延伸60s，3個循環(huán)；然后再951:變性308，481:退火308，721:延伸608，28個循環(huán)；最后72°C再延伸IOmin ;第一輪PCR反應(yīng)分別以相應(yīng)的外側(cè)引物I，反應(yīng)結(jié)束后，再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，按上述體系和程序進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物分別為相應(yīng)的內(nèi)側(cè)引物2 5 μ IPCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，其余用于膠回收。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)的具體操作為:設(shè)計Fizzy、Sxl、VgR三個基因熒光定量PCR的擴(kuò)增引物:其中，F(xiàn)izzy基因的上游引物為5’ -CCAGGCAACCAGTATTTAG-3’，下游引物為 5’ -CAGACCAGTTCGGAGGAG-3’ ；Sxl 基因的上游引物為 5’ -CGGCTTTGGATTTGTAAC-3’，下游引物為 5’ -ACGGTCTGGCATAGGATA-3’ ；VgR 基因的上游引物為 5 ’ -ATCTACTTCACCGATTCTGG-3 ’，下游引物為 5 ’ -ATCACCGACCTGTTACCC-3，；制作β-Actin和三個繁殖力相關(guān)基因Fizzy、Sxl、VgR熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線:1)分別將含有目的基因片段的質(zhì)粒樣品原液稀釋成原濃度的1/10、1/100、1/1000、1/10000、1/100000、1/1000000 ；2)在10μ I反應(yīng)體系中，將倍比稀釋濃度的質(zhì)粒樣品加入1μ 1，加入SYBRPremix ExTaq5 μ I及上、下游引物各0.2 μ I,最后各加滅菌超純水補(bǔ)足至10 μ I ;3)突光定量PCR反應(yīng)條件均為:95°C預(yù)變性IOs ;95°C變性5s，58°C退火15s，72°C延伸20s的條件下40個循環(huán)，制作熔點(diǎn)曲線，`確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。
【文檔編號】C12Q1/68GK103866000SQ201410016686
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月14日
【發(fā)明者】張文慶, 張鑒清, 何源 申請人:中山大學(xué)