極地雪藻固定化保種方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微藻養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其涉及一種極地雪藻固定化保種方法。極地雪藻傳統(tǒng)保種方法存在很多缺點(diǎn)：保種時(shí)間短，為1-2年，營(yíng)養(yǎng)鹽消耗快，培養(yǎng)基易老化，需頻繁更換培養(yǎng)基，工作量大，細(xì)胞存活率低，易污染。本發(fā)明用蛋白胨代替?zhèn)鹘y(tǒng)的褐藻酸鈉或瓊脂作為主要固定劑，且在培養(yǎng)基中增加了檸檬酸鐵、山梨酸鉀、葡萄糖、海泥抽提液、土壤抽出液等營(yíng)養(yǎng)成分，并添加了乙二醇作為抗凍劑，接種后的培養(yǎng)基置于溫度為-50±2℃、光照強(qiáng)度200-400lx的低溫、弱光培養(yǎng)箱中保存。新方法能顯著提高藻細(xì)胞的存活率，大大降低工作量，不易污染，種質(zhì)純正，保種時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6-8年而且保種成本降為原來(lái)的1/3。
【專利說(shuō)明】極地雪藻固定化保種方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微藻養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其涉及一種極地雪藻固定化保種方法。
【背景技術(shù)】
[0002]雪藻snow algae是生活在兩極及相似極端環(huán)境中的一類特殊的單細(xì)胞微藻類群，已發(fā)現(xiàn)有幾十種，分屬不同門(mén)類。大部分分布在雪地幾厘米深的表層，冰雪融化時(shí)形成雪地藻華snow algal bloom,因細(xì)胞富含奸青素而呈深紅色，因此又稱血雪blood snow。其中極地雪藻Chlamydomonas nivalis是一種淡水單細(xì)胞綠藻,在分類學(xué)上屬于綠藻門(mén)Chlorophata、綠藻綱Chlorophyceae、團(tuán)藻目Volvocales。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的奸青素有抗紫外輻射功效。極地雪藻最適生長(zhǎng)溫度是8-10°C，在營(yíng)養(yǎng)豐富和低光強(qiáng)下保持綠色并快速生長(zhǎng)，而在營(yíng)養(yǎng)貧乏和高光強(qiáng)等極端環(huán)境下細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢并開(kāi)始大量積累紅色類胡蘿卜素一蝦青素。極地雪藻還具有生產(chǎn)高不飽和脂肪酸的潛在前途，在理想的培養(yǎng)條件下，極地雪藻含有的不飽和脂肪酸占總脂肪酸的80%以上。 [0003]在微藻的培養(yǎng)和應(yīng)用中，保種工作十分重要，它是微藻培養(yǎng)和進(jìn)一步應(yīng)用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。由于藻種極易受污染，分離和純化技術(shù)較復(fù)雜而且耗時(shí)較長(zhǎng)，因此在微藻保種中要盡量減少接種次數(shù)，避免藻種被雜藻、細(xì)菌或原生動(dòng)物污染。傳統(tǒng)的保種方法是用褐藻酸鈉或瓊脂作為主要固定劑，接種后的固體培養(yǎng)基置于溫度為3-6°C，光照強(qiáng)度為1000-15001x的條件下保存。該方法存在很多缺點(diǎn):保種時(shí)間短，為1-2年，營(yíng)養(yǎng)鹽消耗快，培養(yǎng)基易老化，需頻繁更換培養(yǎng)基，工作量大，細(xì)胞存活率低，僅為37 %左右，易因污染而導(dǎo)致保種失敗。
[0004]本發(fā)明是用蛋白胨代替?zhèn)鹘y(tǒng)的褐藻酸鈉或瓊脂作為主要固定劑，而且在培養(yǎng)基中增加了碳酸氫鈉、檸檬酸鐵、山梨酸鉀、葡萄糖、海泥抽提液、土壤抽出液、絡(luò)合劑乙二胺四乙酸等營(yíng)養(yǎng)成分，營(yíng)養(yǎng)更加全面并添加了乙二醇作為抗凍劑，接種后的培養(yǎng)基置于溫度為-50±2°C、光照強(qiáng)度200-4001X的低溫、弱光培養(yǎng)箱中保存。采用本方法保存極地雪藻能顯著提高藻細(xì)胞的存活率，存活率由原來(lái)的37%提高到了 94%，大大降低了工作量，不易污染，種質(zhì)純正，大大延長(zhǎng)保種時(shí)間，長(zhǎng)達(dá)6-8年而且保種成本降為原來(lái)的1/3。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服目前技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種極地雪藻固定化保種方法，方法如下:
[0006]一種極地雪藻固定化保種所用軟蛋白胨固體培養(yǎng)基，配方如下:
[0007]A 溶液:NH4N0340 毫克，NaN035 毫克，尿素 5 毫克，KH2PO4L 8 毫克，Na2Si038 毫克，NaHC03500毫克，九二 O植物生長(zhǎng)刺激素8國(guó)際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，環(huán)己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸純凈淡水1000毫升；
[0008]B溶液:即f/2微量元素溶液=ZnSO4.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010 毫克，F(xiàn)eC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35克，蒸餾水1000毫升；
[0009]將上述A、B溶液煮沸消毒后，裝入高壓滅菌過(guò)的棕色試劑瓶中置于4°C冰箱低溫保存；(:溶液配制完后裝入高壓滅菌過(guò)的棕色試劑瓶，置于4°C低溫冰箱備用；
[0010]從冰箱中取出上述A和B兩種溶液進(jìn)行混合，使用前兩個(gè)棕色瓶均充分搖勻，取A溶液1000毫升，B溶液I毫升，混合于1500毫升的三角燒瓶中；混合液用I %的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)值到7.5左右，按重量比6%。的比例稱重蛋白胨，加入三角燒瓶中，攪拌均勻，再加入重量比0.5%。的乙二醇，攪拌3分鐘，后置于電熱爐上加熱融化；培養(yǎng)液分裝于100毫升的三角燒瓶中，分裝量30毫升，三角燒瓶瓶口用無(wú)菌培養(yǎng)容器封口膜封口 ；將上述配制好的固體培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋中滅菌，溫度121 °C，滅菌20-30分鐘，取出冷卻，即可。
[0011]一種極地雪藻固定化保種方法，步驟如下:
[0012](I)極地雪藻預(yù)先進(jìn)行提純和液體培養(yǎng)，以確保接種時(shí)藻種處于指數(shù)生長(zhǎng)期，所述液體培養(yǎng)是本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)方法，只要能確保接種時(shí)藻種處于指數(shù)生長(zhǎng)期即可；
[0013](2)液體培養(yǎng)基的配制
[0014]A 溶液:NH4N0340 毫克，NaN035 毫克，尿素 5 毫克，KH2PO4L 8 毫克，Na2Si038 毫克，NaHC03500毫克，九二 O植物生長(zhǎng)刺激素8國(guó)際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，環(huán)己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸純凈淡水1000毫升；
[0015]B溶液:即f/2微量元素溶液=ZnSO4.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010 毫克，F(xiàn)eC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35克，蒸餾水1000毫升；
[0016]C溶液:即f/2維生素溶液:維生素B120.5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素H0.5毫克，蒸餾水1000毫開(kāi)；
[0017]將上述A、B溶液煮沸消毒后，裝入高壓滅菌過(guò)的棕色試劑瓶中置于4°C冰箱低溫保存；(:溶液配制完后裝入高壓滅菌過(guò)的棕色試劑瓶(所述C溶液不要煮沸，因維生素遇高溫易分解變性)，置于4°C低溫冰箱備用；
[0018](3)軟蛋白胨固體培養(yǎng)基制備
[0019]從冰箱中取出上述A和B兩種溶液進(jìn)行混合，使用前兩個(gè)棕色瓶均充分搖勻，取A溶液1000毫升，B溶液I毫升，混合于1500毫升的三角燒瓶中；混合液用I %的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)值到7.5左右，按6%。的比例稱重蛋白胨，加入三角燒瓶中，攪拌均勻，再加入0.5%o的乙二醇，攪拌3分鐘，后置于電熱爐上加熱融化；培養(yǎng)液分裝于100毫升的三角燒瓶中，分裝量30毫升，三角燒瓶瓶口用無(wú)菌培養(yǎng)容器封口膜封口 ；將上述配制好的固體培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋中滅菌，溫度121 °C，滅菌20-30分鐘，取出冷卻，次日待用。
[0020](4 )軟蛋白胨固體培養(yǎng)基接種和培養(yǎng)
[0021]將軟蛋白胨固體培養(yǎng)基放在六孔電熱水浴鍋中，調(diào)至42°C，此時(shí)軟蛋白胨固體培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)；于無(wú)菌超凈工作臺(tái)上，用液槍吸取0.1毫升藻種液，迅速注射到呈液化狀態(tài)的培養(yǎng)基中，搖勻，立即放到常溫、流動(dòng)的自來(lái)水中降溫(30秒內(nèi)完成)；然后將接種完畢的固體培養(yǎng)基置于10± 1°C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，光強(qiáng)4000-5000lx，約15-20天，可見(jiàn)長(zhǎng)出的藻細(xì)胞團(tuán)。
[0022](5)低溫保存
[0023]在超凈工作臺(tái)環(huán)境中挑選藻種群生長(zhǎng)良好的三角燒瓶，在其表面覆蓋0.2厘米厚的液體培養(yǎng)基(用A溶液200毫升，B溶液I毫升，C溶液I毫升混合而成的單細(xì)胞培養(yǎng)液)，置于-50±2°C的低溫培養(yǎng)箱中，200-4001x弱光照射，在此培養(yǎng)條件下，藻種可保存6_8年。
[0024]有益效果極地雪藻傳統(tǒng)的固定化保種方法是用褐藻酸鈉或瓊脂作為主要固定劑，接種后的培養(yǎng)基置于溫度3-6°C，光照強(qiáng)度1000-15001X的環(huán)境中保存。該方法存在很多缺點(diǎn):保種時(shí)間短，為1-2年，營(yíng)養(yǎng)鹽消耗快，培養(yǎng)基易老化，需頻繁地更換培養(yǎng)基，工作量大，細(xì)胞存活率低，僅為37%左右，易因污染而導(dǎo)致保種失敗。我發(fā)明的新方法是用蛋白胨代替?zhèn)鹘y(tǒng)的褐藻酸鈉或瓊脂作為主要固定劑，而且在培養(yǎng)基中我增加了碳酸氫鈉、檸檬酸鐵、山梨酸鉀、葡萄糖、海泥抽提液等營(yíng)養(yǎng)成分，有利于極地雪藻的存活，并添加了乙二醇作為抗凍劑，接種后的培養(yǎng)基置于溫度為_(kāi)50±2°C、光強(qiáng)200-4001x的低溫、弱光條件下保存。采用新方法保存極地雪藻能顯著提高藻細(xì)胞的生命活力，細(xì)胞存活率高達(dá)92%，大大降低工作量，不易污染，種質(zhì)純正，大大延長(zhǎng)保種時(shí)間，長(zhǎng)達(dá)6-8年而且保種成本降為原來(lái)的1/3?！揪唧w實(shí)施方式】
[0025]極地雪藻培養(yǎng)基制備方法
[0026]I)九二 O植物生長(zhǎng)刺激素為白色結(jié)晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(一般每克用50毫升酒精或60度白酒溶解I小時(shí)以上)，再按所需濃度兌水稀釋；
[0027]2)因檸檬酸鐵(FeC6H5O7.5H20)較難溶解，可加少量自來(lái)水在火爐上微熱至80-90°C，并不斷攪拌至全部融化；
[0028]3)各種營(yíng)養(yǎng)鹽按配方中提供的順序加入，以免發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；
[0029]4)各種營(yíng)養(yǎng)鹽特別是f/2微量元素溶液和f/2維生素溶液均需預(yù)先配成母液備用；但放置時(shí)間不要超過(guò)7天，且最好放進(jìn)4°C冰箱冷藏保存?zhèn)溆茫?br> [0030]5)人尿制備方法:取人尿1000毫升，燒瓶煮沸后冷卻備用；
[0031]6)海泥抽取液制備方法:取比較肥沃又不於黑的海泥，以1份泥加2分淡水，充分?jǐn)嚢杈鶆?，靜置1-2分鐘，取上層泥漿于鋁鍋中，按每1000毫升泥漿加I克NaOH的量加入NaOH，煮沸20-30分鐘。煮時(shí)需不斷攪拌均勻，煮后靜置24小時(shí)取上清液備用；
[0032]7) 土壤抽出液制備方法:取土壤I千克，加蒸餾水1000毫升，再加入Na0H2_3克，煮沸120分鐘，冷卻后過(guò)濾，將清液置于暗處?kù)o置2天，取上清液備用。
[0033]8)所有藥品純度均需化學(xué)純級(jí)別。
[0034]極地雪藻固定化保種方法
[0035]I藻類生物材料預(yù)先進(jìn)行提純和液體培養(yǎng)，以確保接種時(shí)藻種處于指數(shù)生長(zhǎng)期。
[0036]2液體培養(yǎng)基的配制
[0037]A 溶液:NH4N0340 暈克，NaN035 暈克，尿素 5 暈克，KH2PO4L 8 暈克，Na2Si038 暈克，NaHC03500毫克，九二 O植物生長(zhǎng)刺激素8國(guó)際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，環(huán)己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸純凈淡水1000毫升。
[0038]B溶液即f/2微量元素溶液=ZnSO4.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010 毫克，F(xiàn)eC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35克，蒸餾水1000毫升。
[0039]C溶液即f/2維生素溶液:維生素B120.5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素H0.5毫克，蒸餾水1000毫升。
[0040]將上述A、B溶液煮沸消毒后，裝入高壓滅菌過(guò)的棕色試劑瓶中置于4°C冰箱低溫保存。C溶液配制完后裝入高壓滅菌過(guò)的棕色試劑瓶(不要煮沸，因維生素遇高溫易分解變性)，置于4°C低溫冰箱備用。
[0041]3軟蛋白胨固體培養(yǎng)基制備
[0042]從冰箱中取出上述A和B兩種溶液進(jìn)行混合，使用前兩個(gè)棕色瓶均充分搖勻，取A溶液1000毫升，B溶液I毫升，混合于1500毫升的三角燒瓶中。混合液用I %的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)值到7.5左右，按6%。的比例稱重蛋白胨，加入三角燒瓶中，攪拌均勻，再加入0.5%o的乙二醇，攪拌3分鐘，后置于電熱爐上加熱融化。培養(yǎng)液分裝于100毫升的三角燒瓶中，分裝量30毫升，三角燒瓶瓶口用無(wú)菌培養(yǎng)容器封口膜封口。將上述配制好的固體培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋中滅菌，溫度121 °C，滅菌20-30分鐘，取出冷卻，次日待用。
[0043]4軟蛋白胨固體培養(yǎng)基接種和培養(yǎng)
[0044]將軟蛋白胨固體培養(yǎng)基放在六孔電熱水浴鍋中，調(diào)至42°C，此時(shí)軟蛋白胨固體培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)。于無(wú)菌超凈工作臺(tái)上，用液槍吸取0.1毫升即100 μ l藻種液，迅速注射到呈液化狀態(tài)的培養(yǎng)基中，搖勻，立即放到常溫、流動(dòng)的自來(lái)水中降溫(30秒內(nèi)完成)。然后將接種完畢的固體培養(yǎng)基置于10± 1°C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，光強(qiáng)4000-5000lx，約15-20天，可見(jiàn)長(zhǎng)出的藻細(xì)胞團(tuán)。
[0045]5低溫保存
[0046]在超凈工作臺(tái)環(huán)境中挑選藻種群生長(zhǎng)良好的三角燒瓶，在其表面覆蓋0.2厘米厚的液體培養(yǎng)基(用A溶液200毫升，B溶液I毫升，C溶液I毫升混合而成的單細(xì)胞培養(yǎng)液)，置于-50±2°C的低溫培養(yǎng)箱中，200-400Ix弱光照射，在此培養(yǎng)條件下，藻種可保存6_8年。
[0047]一種極地雪藻固定化保種所用軟蛋白胨固體培養(yǎng)基，配方如下:
[0048]A 溶液:NH4N0340 暈克，NaN035 暈克，尿素 5 暈克，KH2PO4L 8 暈克，Na2Si038 暈克，NaHC03500毫克，九二 O植物生長(zhǎng)刺激素8國(guó)際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，環(huán)己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸純凈淡水1000毫升；
[0049]B溶液:即f/2微量元素溶液=ZnSO4.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010 毫克，F(xiàn)eC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35克，蒸餾水1000毫升；
[0050]將上述A、B溶液煮沸消毒后，裝入高壓滅菌過(guò)的棕色試劑瓶中置于4°C冰箱低溫保存；(:溶液配制完后裝入高壓滅菌過(guò)的棕色試劑瓶，置于4°C低溫冰箱備用；
[0051]從冰箱中取出上述A和B兩種溶液進(jìn)行混合，使用前兩個(gè)棕色瓶均充分搖勻，取A溶液1000毫升，B溶液I毫升，混合于1500毫升的三角燒瓶中；混合液用I %的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)值到7.5左右，按重量比6%。的比例稱重蛋白胨，加入三角燒瓶中，攪拌均勻，再加入重量比0.5%。的乙二醇，攪拌3分鐘，后置于電熱爐上加熱融化；培養(yǎng)液分裝于100毫升的三角燒瓶中，分裝量30毫升，三角燒瓶瓶口用無(wú)菌培養(yǎng)容器封口膜封口 ；將上述配制好的固體培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋中滅菌，溫度121 °C，滅菌20-30分鐘，取出冷卻，即可。
[0052]一種極地雪藻固定化保種方法，步驟如下:
[0053](I)極地雪藻預(yù)先進(jìn)行提純和液體培養(yǎng)，以確保接種時(shí)藻種處于指數(shù)生長(zhǎng)期，所述液體培養(yǎng)是本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)方法，只要能確保接種時(shí)藻種處于指數(shù)生長(zhǎng)期即可；
[0054](2)液體培養(yǎng)基的配制
[0055]A 溶液:NH4N0340 毫克，NaN035 毫克，尿素 5 毫克，KH2PO4L 8 毫克，Na2Si038 毫克，NaHC03500毫克，九二 O植物生長(zhǎng)刺激素8國(guó)際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，環(huán)己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸純凈淡水1000毫升；
[0056]B溶液:即f/2微量元素溶液=ZnSO4.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010 毫克，F(xiàn)eC6H 5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35克，蒸餾水1000毫升；
[0057]C溶液:即f/2維生素溶液:維生素B120.5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素H0.5毫克，蒸餾水1000毫升；
[0058]將上述A、B溶液煮沸消毒后，裝入高壓滅菌過(guò)的棕色試劑瓶中置于4°C冰箱低溫保存；(:溶液配制完后裝入高壓滅菌過(guò)的棕色試劑瓶(所述C溶液不要煮沸，因維生素遇高溫易分解變性)，置于4°C低溫冰箱備用；
[0059](3)軟蛋白胨固體培養(yǎng)基制備
[0060]從冰箱中取出上述A和B兩種溶液進(jìn)行混合,使用前兩個(gè)棕色瓶均充分搖勻,取A溶液1000毫升，B溶液I毫升，混合于1500毫升的三角燒瓶中；混合液用I %的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)值到7.5左右，按6%。的比例稱重蛋白胨，加入三角燒瓶中，攪拌均勻，再加入0.5%o的乙二醇，攪拌3分鐘，后置于電熱爐上加熱融化；培養(yǎng)液分裝于100毫升的三角燒瓶中，分裝量30毫升，三角燒瓶瓶口用無(wú)菌培養(yǎng)容器封口膜封口 ；將上述配制好的固體培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋中滅菌，溫度121 °C，滅菌20-30分鐘，取出冷卻，次日待用。
[0061](4)軟蛋白胨固體培養(yǎng)基接種和培養(yǎng)
[0062]將軟蛋白胨固體培養(yǎng)基放在六孔電熱水浴鍋中，調(diào)至42°C，此時(shí)軟蛋白胨固體培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)；于無(wú)菌超凈工作臺(tái)上，用液槍吸取0.1毫升藻種液，迅速注射到呈液化狀態(tài)的培養(yǎng)基中，搖勻，立即放到常溫、流動(dòng)的自來(lái)水中降溫(30秒內(nèi)完成)；然后將接種完畢的固體培養(yǎng)基置于10± 1°C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，光強(qiáng)4000-5000lx，約15-20天，可見(jiàn)長(zhǎng)出的藻細(xì)胞團(tuán)。
[0063](5)低溫保存
[0064]在超凈工作臺(tái)環(huán)境中挑選藻種群生長(zhǎng)良好的三角燒瓶，在其表面覆蓋0.2厘米厚的液體培養(yǎng)基(用A溶液200毫升，B溶液I毫升，C溶液I毫升混合而成的單細(xì)胞培養(yǎng)液)，置于-50±2°C的低溫培養(yǎng)箱中，200-4001x弱光照射，在此培養(yǎng)條件下，藻種可保存6_8年。 [0065]最后應(yīng)說(shuō)明的是:以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種極地雪藻固定化保種所用軟蛋白胨固體培養(yǎng)基，其特征在于配方如下: A溶液:NH4N0340毫克，NaN035毫克，尿素5毫克，KH2PO4L 8毫克，Na2Si038毫克，NaHC03500毫克，九二 O植物生長(zhǎng)刺激素8國(guó)際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，環(huán)己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸純凈淡水1000毫升； B 溶液:即 f/2 微量元素溶液=ZnSO4.4Η2023 毫克，MnCl2.4Η20178 毫克，CuSO4.5Η2010毫克，F(xiàn)eC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35 克，蒸餾水1000毫升； 將上述A、B溶液煮沸消毒后，裝入高壓滅菌過(guò)的棕色試劑瓶中置于4°C冰箱低溫保存；C溶液配制完后裝入高壓滅菌過(guò)的棕色試劑瓶，置于4°C低溫冰箱備用； 從冰箱中取出上述A和B兩種溶液進(jìn)行混合，使用前兩個(gè)棕色瓶均充分搖勻，取A溶液1000毫升，B溶液I毫升，混合于1500毫升的三角燒瓶中；混合液用I %的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)值到7.5左右，按重量比6%。的比例稱重蛋白胨，加入三角燒瓶中，攪拌均勻，再加入重量比0.5%。的乙二醇，攪拌3分鐘，后置于電熱爐上加熱融化；培養(yǎng)液分裝于100毫升的三角燒瓶中，分裝量30毫升，三角燒瓶瓶口用無(wú)菌培養(yǎng)容器封口膜封口 ；將上述配制好的固體培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋中滅菌，溫度121 °C，滅菌20-30分鐘，取出冷卻，即可。
2.一種極地雪藻固定化保種方法，其特征在于步驟如下: (1)極地雪藻預(yù)先進(jìn)行提純和液體培養(yǎng)，以確保接種時(shí)藻種處于指數(shù)生長(zhǎng)期； (2)液體培養(yǎng)基的配制 A溶液:NH4N0340毫克，NaN035毫克，尿素5毫克，KH2PO4L 8毫克，Na2Si038毫克，NaHC03500毫克，九二 O植物生長(zhǎng)刺激素8國(guó)際單位，山梨酸鉀10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯15毫克，環(huán)己基氨基磺酸鈉20毫克，蜂膠9毫克，麥芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸鈉8毫克，焦磷酸鐵4毫克，檸檬酸鉀6毫克，乙酸鈉5毫克，山梨糖醇液I毫升，三聚甘油單硬脂酸酯10毫克，人尿I毫升，海泥抽取液I毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸純凈淡水1000毫升； B 溶液:即 f/2 微量元素溶液=ZnSO4.4Η2023 毫克，MnCl2.4Η20178 毫克，CuSO4.5Η2010毫克，F(xiàn)eC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35 克，蒸餾水1000毫升； C溶液:即f/2維生素溶液:維生素B120.5毫克,維生素B1IOO毫克,維生素H0.5毫克，蒸餾水1000毫升； 將上述A、B溶液煮沸消毒后，裝入高壓滅菌過(guò)的棕色試劑瓶中置于4°C冰箱低溫保存；C溶液配制完后裝入高壓滅菌過(guò)的棕色試劑瓶，置于4°C低溫冰箱備用； (3)軟蛋白胨固體培養(yǎng)基制備 從冰箱中取出上述A和B兩種溶液進(jìn)行混合，使用前兩個(gè)棕色瓶均充分搖勻，取A溶液1000毫升，B溶液I毫升，混合于1500毫升的三角燒瓶中；混合液用I %的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)值到7.5左右，按6%。的比例稱重蛋白胨，加入三角燒瓶中，攪拌均勻，再加入0.5%。的乙二醇，攪拌3分鐘，后置于電熱爐上加熱融化；培養(yǎng)液分裝于100毫升的三角燒瓶中，分裝量30毫升，三角燒瓶瓶口用無(wú)菌培養(yǎng)容器封口膜封口 ；將上述配制好的固體培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋中滅菌，溫度121 °C，滅菌20-30分鐘，取出冷卻，次日待用。 (4)軟蛋白胨固體培養(yǎng)基接種和培養(yǎng) 將軟蛋白胨固體培養(yǎng)基放在六孔電熱水浴鍋中，調(diào)至42°C，此時(shí)軟蛋白胨固體培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)；于無(wú)菌超凈工作臺(tái)上，用液槍吸取0.1毫升藻種液，迅速注射到呈液化狀態(tài)的培養(yǎng)基中，搖勻，立即放到常溫、流動(dòng)的自來(lái)水中降溫(30秒內(nèi)完成)；然后將接種完畢的固體培養(yǎng)基置于10±1°〇的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，光強(qiáng)4000-500011，約15-20天，可見(jiàn)長(zhǎng)出的藻細(xì)胞團(tuán)。 (5)低溫保存 在超凈工作臺(tái)環(huán)境中挑選藻種群生長(zhǎng)良好的三角燒瓶，在其表面覆蓋0.2厘米厚的液體培養(yǎng)基(用A溶液200毫升，B溶液I毫升，C溶液I毫升混合而成的單細(xì)胞培養(yǎng)液)，置于_50±2°C的低溫培養(yǎng) 箱中，200-4001x弱光照射，在此培養(yǎng)條件下，藻種可保存6_8年。
【文檔編號(hào)】C12R1/89GK103740692SQ201410016830
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】王培磊, 王博侖 申請(qǐng)人:臨沂大學(xué)