來自枯草芽孢桿菌的變體α-淀粉酶及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供來自枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶(AmyE)、其變體、編碼AmyE或其變體的核酸，以及含有該核酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明公開了包括淀粉液化和/或糖化的使用AmyE或其變體的方法。此類方法可以產(chǎn)生用于乙醇產(chǎn)生或高果糖玉米糖漿產(chǎn)生的糖。在一些情況下，可以在低pH、不存在鈣和/或不存在葡糖淀粉酶的情況下使用該淀粉酶。
【專利說明】來自枯草芽孢桿菌的變體Ct-淀粉酶及其使用方法
[0001]本申請是發(fā)明人于2009年6月5日提交的題為“來自枯草芽孢桿菌的變體淀粉酶及其使用方法”的中國專利申請200980129658.X的分案申請。
[0002]優(yōu)先權(quán)
[0003]本申請要求2008年6月6日提交的美國臨時專利申請61/059，513和61/059，618的優(yōu)先權(quán)，這兩個臨時專利申請以其整體引入作為參考。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]提供來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的α -淀粉酶(AmyE)、其變體、編碼AmyE或其變體的核酸以及含有該核酸的宿主細(xì)胞。公開了使用AmyE或其變體的方法，其包括淀粉液化和/或糖化。此類方法可以產(chǎn)生用于乙醇產(chǎn)生或高果糖玉米糖漿產(chǎn)生的糖類。在一些情況下，可以在低pH、不存在鈣和/或不存在葡糖淀粉酶的情況下使用這些淀粉酶。
【背景技術(shù)】
[0005]谷粒、谷物和植物淀粉，例如玉米淀粉被廣泛用于工業(yè)制gr1-如糖漿和生物燃料的產(chǎn)物。例如，高果糖玉米糖漿(HFCS)是加工形式的玉米糖漿，其具有高果糖含量和與糖相當(dāng)?shù)奶鸲龋沟肏FCS可在軟飲料和其他加工食物中用作糖替代物。HFCS生產(chǎn)目前代表了十億美元的產(chǎn)業(yè)。生產(chǎn)乙醇作為生物燃料也是不斷增長的產(chǎn)業(yè)。
[0006]可以通過催化淀粉降解為葡萄糖的酶促方法從淀粉產(chǎn)生糖漿和生物燃料。此酶促方法通常涉及一系列酶催化的反應(yīng)。
[0007](I)液化:`0【.淀粉酶(EC3.2.1.1)首先催化可含有30-40% w/w干固體(ds)的淀粉懸液降解為麥芽葡聚糖(maltodextran)。α -淀粉酶是催化隨機切割內(nèi)部的α -1, 4-D-糖苷鍵的內(nèi)水解酶(endohydrolase)。因為通常在高溫,例如90_100°C下進行液化，所以優(yōu)選將熱穩(wěn)定的α -淀粉酶，如來自芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.)的α -淀粉酶用于此步驟。目前用于此步驟的α -淀粉酶，例如來自地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis)、解淀粉芽抱桿菌(B.amy1Iipuefaciens)和嗜熱脂肪芽抱桿菌(B.stearothermophiIus)(AmyS)的α -淀粉酶不產(chǎn)生顯著量的葡萄糖。相反,產(chǎn)生的液化產(chǎn)物(Iiquefact)具有低葡萄糖當(dāng)量(DE)且含有麥芽糖和高聚合度(DPn)糖類。
[0008](2)糖化:葡糖淀粉酶和/或產(chǎn)麥芽糖α -淀粉酶催化液化后形成的麥芽葡聚糖的非還原端水解，釋放D-葡萄糖、麥芽糖和異麥芽糖。糖化產(chǎn)生富含葡萄糖的糖漿或高麥芽糖糖漿。在前者的情況下，葡糖淀粉酶通常于升高的溫度在酸性條件下催化糖化，例如在60°C、pH4.3下。用于此方法中的葡糖淀粉酶通常獲自真菌，例如用于Optidex? L400中的黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶或灰腐質(zhì)霉(Humicula grisea)葡糖淀粉酶。脫支酶，如支鏈淀粉酶可以輔助糖化。
[0009]備選地，產(chǎn)麥芽糖(maltogenic) α-淀粉酶可以催化糖化來形成高麥芽糖糖漿。產(chǎn)麥芽糖α -淀粉酶通常具有比葡糖淀粉酶更高的最適PH和更低的最適溫度，且產(chǎn)麥芽糖淀粉酶通常需要Ca2+。目前用于此應(yīng)用中的產(chǎn)麥芽糖α -淀粉酶包括枯草芽孢桿菌α-淀粉酶、植物淀粉酶以及來自米曲霉(Aspergillus oryzae)的α -淀粉酶(Clarase? L的
活性成分)。用于產(chǎn)生多種產(chǎn)物的示例性糖化反應(yīng)顯示于以下:
[0010]
【權(quán)利要求】
1.分離的變體多肽，其具有α-淀粉酶活性和至少一種改善酶性能的改變的特征，所述變體多肽包含與選自AmyE的親本α -淀粉酶多肽(SEQID NO:1)具有至少90%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或與AmyE的截短變體(SEQ ID NO: 2)具有至少92%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，以及包含選自1、43、100、131、142、200、226、254、402和424的一個或多個位置上的修飾，其中所述修飾產(chǎn)生就至少一種改善酶性能的特征而言具有大于1.0的性能指數(shù)(PI)的變體多肽。
2.權(quán)利要求1的變體多肽，其在選自1、43、100、131、142、200、226、254、402和424的一個或多個位置上包含修飾，其中所述修飾產(chǎn)生就蛋白質(zhì)表達而言具有大于0.5的性能指數(shù)(ΡΙ)，且就至少一種改善酶性能的特征而言具有大于1.1的PI的變體多肽。
3.權(quán)利要求1的變體多肽，其中所述一個或多個位置選自1、43、100、131、142、200、226、254、402和424，該位置在全長或截短親本多肽中對性能而言是非完全限制性的。
4.權(quán)利要求1的變體多肽，其中所述修飾是在選自1A、43M、100M、100L、131H、142S、142Y、200N、2261、2541、254V、402M和424A的一個或多個位置上，將存在于親本多肽中的一個或多個氨基殘基取代為不同的氨基酸殘基。
5.權(quán)利要求4的變體多肽，其中所述取代將存在于位置I上的氨基酸殘基改變?yōu)锳，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
6.權(quán)利要求4的變體多肽，其中所述取代將存在于位置43上的氨基酸殘基改變?yōu)镸，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
7.權(quán)利要求4的變體多肽，其中所述取代將存在于位置100上的氨基酸殘基改變?yōu)長或M，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
8.權(quán)利要求4的變體多肽，其中所述取代將存在于位置131上的氨基酸殘基改變?yōu)镠，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
9.權(quán)利要求4的變體多肽，其中所述取代將存在于位置142上的氨基酸殘基改變?yōu)镾或Y，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
10.權(quán)利要求4的變體多肽，其中所述取代將存在于位置200上的氨基酸殘基改變?yōu)镹，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
11.權(quán)利要求4的變體多肽，其中所述取代將存在于位置226上的氨基酸殘基改變?yōu)镮，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
12.權(quán)利要求4的變體多肽，其中所述取代將存在于位置254上的氨基酸殘基改變?yōu)镮或V，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
13.權(quán)利要求4的變體多肽，其中所述取代將存在于位置402上的氨基酸殘基改變?yōu)镸，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
14.權(quán)利要求4的變體多肽，其中所述取代將存在于位置424上的氨基酸殘基改變?yōu)锳，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
15.權(quán)利要求1的變體多肽，其中所述親本多肽與SEQID NO: 3的氨基酸序列具有至少97%氨基酸序列同一性。
16.權(quán)利要求1的變體多肽，其中所述改善酶性能的特征選自提高的熱穩(wěn)定性、提高的比活和提聞的蛋白質(zhì)表達。
17.洗滌劑組合物，其含有權(quán)利要求1的變體多肽。
18.淀粉轉(zhuǎn)化組合物，其含有權(quán)利要求1的變體多肽。
19.權(quán)利要求18的淀粉轉(zhuǎn)化組合物，其進一步包含具有葡糖淀粉酶活性的其他多肽。
20.分離的變體多肽，其具有α-淀粉酶活性和至少一種改善酶性能的改變的特征，所述變體多肽包含與選自AmyE的親本α -淀粉酶多肽(SEQID NO:1)具有至少90%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或與AmyE的截短變體(SEQ ID NO: 2)具有至少92%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，以及包含選自35、56、65、158、189、192、298、320、386和395的一個或多個位置上的修飾，其中所述修飾產(chǎn)生就至少一種改善酶性能的特征而言具有大于1.0的性能指數(shù)(PI)的變體多肽。
21.權(quán)利要求20的變體多肽，其在選自35、56、65、158、189、192、298、320、386和395的一個或多個位置上包含修飾，其中所述修飾產(chǎn)生就蛋白質(zhì)表達而言具有大于0.5的性能指數(shù)(ΡΙ)，且就至少一種改善酶性能的特征而言具有大于1.1的PI的變體多肽。`
22.權(quán)利要求20的變體多肽，其中所述一個或多個位置選自35、56、65、158、189、192、298、320、386和395，該位置在全長或截短親本多肽中對性能而言是非完全限制性的。
23.權(quán)利要求1的變體多肽，其中所述修飾是在選自T35V/1、S56W/R、Τ65Ι、L158V、Y189F、Q192N/E、G298L、S320T、A386R和D395K的一個或多個位置上，將存在于親本多肽中的一個或多個氨基殘基取代為不同的氨基酸殘基。
24.權(quán)利要求23的變體多肽，其中所述取代將存在于位置35上的氨基酸殘基改變?yōu)閂或I，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
25.權(quán)利要求23的變體多肽，其中所述取代將存在于位置56上的氨基酸殘基改變?yōu)閃或R，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
26.權(quán)利要求23的變體多肽，其中所述取代將存在于位置65上的氨基酸殘基改變?yōu)镮，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
27.權(quán)利要求23的變體多肽，其中所述取代將存在于位置158上的氨基酸殘基改變?yōu)閂，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
28.權(quán)利要求23的變體多肽，其中所述取代將存在于位置189上的氨基酸殘基改變?yōu)镕，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
29.權(quán)利要求23的變體多肽，其中所述取代將存在于位置192上的氨基酸殘基改變?yōu)镹或E，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
30.權(quán)利要求23的變體多肽，其中所述取代將存在于位置298上的氨基酸殘基改變?yōu)長，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
31.權(quán)利要求23的變體多肽，其中所述取代將存在于位置320上的氨基酸殘基改變?yōu)門，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
32.權(quán)利要求23的變體多肽，其中所述取代將存在于位置386上的氨基酸殘基改變?yōu)镽，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
33.權(quán)利要求23的變體多肽，其中所述取代將存在于位置395上的氨基酸殘基改變?yōu)镵，且與親本多肽相比，所述變體多肽顯示提高的將麥芽糖和麥芽七糖底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的能力。
34.權(quán)利要求20的變體多肽，其中所述親本多肽與SEQID NO:3的氨基酸序列具有至少97%氨基酸序列同一性。
35.權(quán)利要求20的變體多肽，其中所述改善酶性能的特征選自提高的熱穩(wěn)定性、提高的比活和提聞的蛋白質(zhì)表達。
36.洗滌劑組合物，其含有權(quán)利要求20的變體多肽。
37.淀粉轉(zhuǎn)化組合物，其含有權(quán)利要求20的變體多肽。
38.權(quán)利要求37的淀粉轉(zhuǎn)化組合物，其進一步包含具有葡糖淀粉酶活性的其他多肽。
【文檔編號】C12R1/125GK103773749SQ201410016942
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2009年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2008年6月6日
【發(fā)明者】L·卡斯考-佩雷拉, W·A·奎瓦斯, D·A·埃斯特爾, 李祥揆, S·D·鮑爾, S·W·拉默, A·R·托波扎達, L·華萊士 申請人:丹尼斯科美國公司