桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)cyp6cy3啟動(dòng)子及活性分析的制作方法
【專利摘要】桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子及活性分析屬生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明所述啟動(dòng)子序列如SEQ?ID?NO:1所示，其中SEQ?ID?NO：1的-1bp至-2230bp區(qū)為桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子DNA序列，SEQ?ID?NO:1的+1bp至+71bp區(qū)為桃蚜P450基因CYP6CY3的5’非翻譯區(qū)的DNA序列；本發(fā)明可用于真核基因的高效表達(dá)，應(yīng)用于獲得低豐度基因研究，使其獲得高水平、穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)于目的功能研究具有積極意義。
【專利說明】桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子及活性分析
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一段DNA序列，它可以作為啟動(dòng)子調(diào)控基因的表達(dá)。具體涉及一種來源于桃蚜P450基因CYP6CY3并在細(xì)胞中高度表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列。
【背景技術(shù)】
[0002]桃蚜是一種世界性農(nóng)業(yè)害蟲，通過取食和病毒傳播來危害農(nóng)作物。吡蟲啉是能有效防治桃蚜的新煙堿類殺蟲劑，但是田間種群已經(jīng)對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生了不同水平的抗性。Puinean等(2010)研究表明桃蚜CYP6CY3超量表達(dá)導(dǎo)致其對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生高水平抗性。這可能是桃蚜利用吡蟲啉作為化學(xué)感應(yīng)信號(hào)來啟動(dòng)其耐受機(jī)制進(jìn)而應(yīng)對(duì)吡蟲啉脅迫的重要生理機(jī)能。這也顯示出桃蚜CYP6CY3基因啟動(dòng)子極可能具有較高誘導(dǎo)活性，迄今為止，未有從桃蚜中分離的高活性啟動(dòng)子。目前能應(yīng)用于真核表達(dá)研究的桃蚜啟動(dòng)子還未有。因此，對(duì)于新的高活性的桃蚜相關(guān)啟動(dòng)子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉(zhuǎn)錄因子的研究具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子序列能夠誘導(dǎo)目的基因高水平表達(dá)，而且該啟動(dòng)子來源于桃蚜P450基因CYP6CY3。
[0004]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的CYP6CY3啟動(dòng)子真核表達(dá)載體，該載體指導(dǎo)高水平表達(dá)目的基因CYP6CY3的啟動(dòng)子序列和5’非翻譯區(qū)。
[0005]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種所述真核細(xì)胞表達(dá)載體的表達(dá)，該載體的表達(dá)能反映啟動(dòng)子活性的高低。`
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明克隆了桃蚜P450基因CYP6CY3的啟動(dòng)子區(qū)，并構(gòu)建了真核表達(dá)載體，所述載體包含帶有CYP6CY3基因的5’非翻譯區(qū)的上述啟動(dòng)子。隨后利用所述載體在Sf9細(xì)胞中表達(dá)，并檢測(cè)到該啟動(dòng)子的高水平活性。
[0007]本發(fā)明提供一種獲得的桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子序列，所述啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO:1所示，其中SEQ I DNO:1的-1bp至_2230bp區(qū)(見序列表)為桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子DNA序列，在真核細(xì)胞中本發(fā)明所述的啟動(dòng)子高水平活性。
[0008]獲得的桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子序列源自桃蚜P450基因CYP6CY3。
[0009]SEQIDN0:1的+Ibp至+71bp區(qū)(見序列表)為桃蚜P450基因CYP6CY3的5’非翻譯區(qū)的DNA序列，本發(fā)明所述的桃蚜CYP6CY3基因的5’非翻譯區(qū)能在Sf9細(xì)胞中通過增強(qiáng)目標(biāo)外源基因的翻譯效力，而誘導(dǎo)目標(biāo)基因的高水平表達(dá)。
[0010]為實(shí)現(xiàn)另一個(gè)目的，本發(fā)明提供一種用于細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞表達(dá)載體，所述真核細(xì)胞表達(dá)載體包含桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子序列。
[0011]上述用于Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)染的真核表達(dá)載體是指能夠在細(xì)胞中瞬時(shí)、高水平表達(dá)外源基因的載體。例如PGL3載體、pGL4載體。[0012]一種用真核細(xì)胞表達(dá)載體的表達(dá)，所述真核細(xì)胞表達(dá)包含桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子序列。
[0013]關(guān)于本發(fā)明所述的用于真核細(xì)胞的表達(dá)載體(pGL3)，所述的桃蚜CYP6CY3基因的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)在表達(dá)載體中位于外源基因(Luc+)的前面。本發(fā)明提供通過插入本發(fā)明所述的桃蚜CYP6CY3基因的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)至含有Luc+報(bào)告基因的載體中而構(gòu)建的PGL3-CYP6CY3 (-2230/+71)。但是，所述Luc+報(bào)告基因是外源基因，并預(yù)期可以用任意其它有用的外源基因來代替。
[0014]本發(fā)明提供來自桃蚜CYP6CY3基因的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)，根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)使得能夠在真核細(xì)胞中進(jìn)行高水平的表達(dá)。
[0015]本發(fā)明的有益效果在于:可用于真核基因的高效表達(dá)，應(yīng)用于獲得低豐度基因研究，使其獲得聞水平、穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)于目的功能研究具有積極意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為桃蚜基因組電泳圖
[0017]圖2 為 Genome walker PCR 電泳圖
[0018]圖3為CYP6CY3連T載酶切鑒定電泳圖
[0019]圖4為CYP6CY3連pGL3PCR鑒定電泳圖
[0020]圖5為CYP6CY3連pGL3酶切鑒定電泳圖
[0021]圖6為pGL3-CYP6CY`3 (-2230/+71)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后啟動(dòng)子活性檢測(cè) 圖7為pGL3-CYP6CY3(-2230/+71)表達(dá)載體示意圖
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖介紹具體實(shí)施步驟，將能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地理解如何實(shí)施本發(fā)明。盡管已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本發(fā)明的范圍。
[0023]實(shí)施例1:桃蚜CYP6CY3啟動(dòng)子的克隆
[0024]依據(jù)桃蚜CYP6CY3mRNA序列(Genbank N0.HM009309)設(shè)計(jì)染色體步移引物GSPl(5-GTCCTCATCTGGAACAGTCCTCCGTAT-3)和 GSP2 (5-CAGTCGGTGGTTGACGATGATAGATTC-3)。提取桃蚜基因組DNA (圖1 )，并用平切酶Afe1、EcoRV-HF、PvuI1、Sma1、Pme1、StuI進(jìn)行消化，純化DNA并連接接頭引物。按照設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并按照Genome walker(Clontech) PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增得到目的片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增出長(zhǎng)度為大約2300bp的條帶(圖2)，并進(jìn)行回收?；厥掌闻cpGEM-T載體連接得到重組質(zhì)粒，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切驗(yàn)證(圖3)，并測(cè)序。
[0025]桃蚜CYP6CY3啟動(dòng)子(啟動(dòng)子序列包含相對(duì)于SEQ ID NO:1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-1bp至-2230bp區(qū)的DNA核苷酸序列)，在桃蚜CYP6CY3基因的5’區(qū)序列中得到鑒定。
[0026]在本文件的啟動(dòng)子序列表中,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基用+1示出,ATG用紅色標(biāo)注。并用啟動(dòng)子分析網(wǎng)站分析了啟動(dòng)子的核心元件。
[0027]啟動(dòng)子分析網(wǎng)站 http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index, html[0028]實(shí)施例2:桃蚜CYP6CY3啟動(dòng)子表達(dá)載體pGL3_CYP6CY3 (-2230/+71)的構(gòu)建
[0029]將在實(shí)施例1中所克隆的桃蚜CYP6CY3啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)(見序列表)插入到pGL3 載體中，從而構(gòu)建 pGL3-CYP6CY3 (-2230/+71)載體。
[0030]更具體地說，利用引物(5-ACGCGTATTTATGACTATAACGAGG-3，5-CTCGAGCAGTCGGTGGTTGACGATGAT-3)擴(kuò)增并將該啟動(dòng)子序列克隆到pGL3載體MluI和XhoI位點(diǎn)上，構(gòu)建成pGL3-CYP6CY3 (-2230/+71)，用于驅(qū)動(dòng)Luc+的表達(dá)，經(jīng)PCR鑒定(圖4)和酶切鑒定(圖5)獲得啟動(dòng)子與載體的重組質(zhì)粒。
[0031]實(shí)施例3:鑒定本發(fā)明所述的桃蚜CYP6CY3啟動(dòng)子的活性
[0032]Sf9 細(xì)胞接種于 24 孔板中(4X IO5Cells/ 孔)，用 CellfectinII 試劑(Invitrogen; 2 μ L/ 每孔)瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染 pGL3_CYP6CY3 (-2230/+71)建體(2μ g/ 孔)和對(duì)照?qǐng)?bào)告基因質(zhì)粒phRL-TK (Promega; 0.2 μ g/孔)，。48小時(shí)后，收獲細(xì)胞，將所得裂解物用于測(cè)量螢光素酶活性(Promega)。如圖6所示，pGL3_CYP6CY3 (-2230/+71)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞具有很高熒光素酶活性。
[0033]實(shí)用性
[0034]如上所述，本發(fā)明提供桃蚜CYP6CY3基因啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)。
[0035]本發(fā)明提供分別將桃蚜CYP6CY3基因啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)插入至pGL3而獲得的真核細(xì)胞表達(dá)載體。
[0036]經(jīng)使用所述的真核細(xì)胞表達(dá)載體進(jìn)行鑒定，本發(fā)明所述的桃蚜CYP6CY3基因啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)能夠啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。因此，本發(fā)明可用于提高真核基因的高效表達(dá)，應(yīng)用于獲得低豐度基因研究使其獲得聞水平、穩(wěn)定表達(dá)。
[0037]`
【權(quán)利要求】
1.一種獲得的桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子序列，其特征在于所述啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO:1所示，其中SEQ ID NO:1的-1bp至_2230bp區(qū)為桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子DNA序列，SEQ ID NO:1的+Ibp至+71bp區(qū)為桃蚜P450基因CYP6CY3的5，非翻譯區(qū)的DNA序列。
2.一種用于細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞表達(dá)載體，其特征在于所述真核細(xì)胞表達(dá)載體包含權(quán)利要求1所述的桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP6CY3啟動(dòng)子序列。
3.一種用真核細(xì)胞表達(dá)載體的表達(dá),其特征在于所述真核細(xì)胞表達(dá)包含權(quán)利要求1所述的桃蚜吡蟲啉抗性相關(guān)CYP·6CY3啟動(dòng)子序列。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK103820448SQ201410020506
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】尚慶利, 楊晨, 潘怡歐, 席景會(huì), 畢銳, 楊巽, 辛雪成 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)