棉蚜棉酚誘導(dǎo)型cyp6j1啟動(dòng)子及活性分析的制作方法
【專利摘要】棉蚜棉酚誘導(dǎo)型CYP6J1啟動(dòng)子及活性分析屬生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明提供了一種獲得的棉蚜棉酚誘導(dǎo)型CYP6J1啟動(dòng)子序列，所述啟動(dòng)子序列如SEQIDNO:1所示，其中SEQIDNO：1的-1bp至-848bp區(qū)為棉蚜棉酚誘導(dǎo)型CYP6J1啟動(dòng)子的DNA序列，SEQIDNO:1的+1bp至+297bp區(qū)為棉蚜P450基因CYP6J1的5’非翻譯區(qū)的DNA序列；本發(fā)明可用于真核基因的高效表達(dá)，用于獲得低豐度基因研究，使其獲得高水平、穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)于目的功能研究具有積極意義。
【專利說(shuō)明】棉蚜棉酚誘導(dǎo)型0丫?6」1啟動(dòng)子及活性分析
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一段0嫩序列，它可以作為啟動(dòng)子調(diào)控基因的表達(dá)。具體涉及一種來(lái)源于棉蚜？450基因^？6了1并在細(xì)胞中高度表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列。
【背景技術(shù)】
[0002]棉蚜(細(xì)1118 808871)11)是一種重要的世界性農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，通過(guò)取食和病毒傳播來(lái)危害農(nóng)作物。棉酚是棉屬植物特有的萜烯類化合物，也是在棉花體內(nèi)發(fā)現(xiàn)最早、抗蚜效果最明顯的一類次生物質(zhì)。前期研究結(jié)果表明，棉蚜細(xì)胞色素？450基因0^611表達(dá)量能被高劑量棉酚誘導(dǎo)。這可能是棉蚜利用棉酚作為化學(xué)感應(yīng)信號(hào)來(lái)啟動(dòng)其防御機(jī)制進(jìn)而應(yīng)對(duì)棉酚脅迫的重要生理機(jī)能。這也顯示出棉蚜^？6了1基因啟動(dòng)子極可能具有較高誘導(dǎo)活性，迄今為止，未有從棉蚜中分離的高活性啟動(dòng)子。目前能應(yīng)用于真核表達(dá)研究的棉蚜啟動(dòng)子還未有。因此，對(duì)于新的高活性的桃蚜相關(guān)啟動(dòng)子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉(zhuǎn)錄因子的研究具有重要意義，對(duì)深入研究害蟲(chóng)植物次生物質(zhì)耐受性機(jī)制及新型抗蟲(chóng)新品種的研制奠定基礎(chǔ)。`

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種棉酚誘導(dǎo)型^？6了1啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子序列能夠誘導(dǎo)目的基因高水平表達(dá)，而且該啟動(dòng)子來(lái)源于棉蚜？450基因
[0004]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的^？6了1啟動(dòng)子真核表達(dá)載體，該載體指導(dǎo)高水平表達(dá)目的基因^？6了1的啟動(dòng)子序列和5’非翻譯區(qū)。
[0005]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種所述真核細(xì)胞表達(dá)載體的表達(dá)，該載體的表達(dá)能反映啟動(dòng)子活性的高低。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明克隆了棉蚜？450基因(^^11的啟動(dòng)子區(qū)，并構(gòu)建了真核表達(dá)載體，所述載體包含帶有^？6了1基因的5’非翻譯區(qū)的上述啟動(dòng)子。隨后利用所述載體在對(duì)9細(xì)胞中表達(dá)，并檢測(cè)到該啟動(dòng)子的高水平活性。
[0007]本發(fā)明提供一種獲得的棉蚜棉酚誘導(dǎo)型^？6了1啟動(dòng)子序列，所述啟動(dòng)子序列如820 10勵(lì):1所示，其中3即10勵(lì):1的-1恥至-8481^區(qū)(見(jiàn)序列表)為棉蚜棉酚誘導(dǎo)型0^611啟動(dòng)子的0嫩序列，在真核細(xì)胞中本發(fā)明所述的啟動(dòng)子的具有高水平活性。
[0008]獲得的棉酚誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列源自棉蚜？450基因(^^了匕
[0009]820 10
的5’非翻譯區(qū)的0嫩序列，本發(fā)明所述的棉蚜基因的5’非翻譯區(qū)能在細(xì)胞中通過(guò)增強(qiáng)目標(biāo)外源基因的翻譯效力，而誘導(dǎo)目標(biāo)基因的高水平表達(dá)。
[0010]為實(shí)現(xiàn)另一個(gè)目的，本發(fā)明提供一種用于細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞表達(dá)載體，所述真核細(xì)胞表達(dá)載體包含棉蚜棉酚誘導(dǎo)型?^？6了1啟動(dòng)子序列。
[0011]上述用于對(duì)9細(xì)胞轉(zhuǎn)染的真核表達(dá)載體是指能夠在細(xì)胞中瞬時(shí)、高水平表達(dá)外源基因的載體，例如PGL3載體、pGL4載體。
[0012]一種用真核細(xì)胞表達(dá)載體的表達(dá)，所述真核細(xì)胞表達(dá)包含棉蚜棉酚誘導(dǎo)型CYP6J1啟動(dòng)子序列。
[0013]關(guān)于本發(fā)明所述的用于真核細(xì)胞的表達(dá)載體(pGL3)，所述的棉蚜CYP6J1基因的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)在表達(dá)載體中位于外源基因(Luc+)的前面。本發(fā)明提供通過(guò)插入本發(fā)明所述的棉蚜CYP6J1基因的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)至含有Luc+報(bào)告基因的載體中而構(gòu)建的pGL3-CYP6Jl (-848/+297)。但是，所述Luc+報(bào)告基因是外源基因，并預(yù)期可以用任意其它有用的外源基因來(lái)代替。
[0014]本發(fā)明提供來(lái)自棉蚜CYP6J1基因的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)，根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)使得能夠在真核細(xì)胞中進(jìn)行高水平的表達(dá)。
[0015]本發(fā)明的有益效果在于:可用于真核基因的高效表達(dá)，應(yīng)用于獲得低豐度基因研究，使其獲得聞水平、穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)于目的功能研究具有積極意義。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為桃蚜基因組電泳圖
[0017]圖2 為 Genomewal kerPCR 電泳圖
[0018]圖3為CYP6J1連T載酶切鑒定電泳圖
[0019]圖4為CYP6Jl連pGL3PCR鑒定電泳圖
[0020]圖5為CYP6J1連pGL3酶切鑒定電泳圖
[0021]圖6為pGL3-CYP6Jl (-848/+297)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后啟動(dòng)子活性檢測(cè)示意圖 圖7為pGL3-CYP6Jl (-848/+297)表達(dá)載體示意圖
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖介紹具體實(shí)施步驟，將能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地理解如何實(shí)施本發(fā)明。盡管已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本發(fā)明的范圍。
[0023]實(shí)施例1:棉蚜CYP6J1啟動(dòng)子的克隆
[0024]依據(jù)棉蚜CYP6JlmRNA序列(GenbankN0.JN989967)設(shè)計(jì)染色體步移引物GSPl (5-TCATCAAATACTATTCCACGGTTGGGA-3)和 GSP2 (5-GCTTTTGAAACTGATAGAAACCGACGAAC-3)。提取桃蚜基因組DNA (圖1 )，并用平切酶Afe1、EcoRV-HF、PvuI1、Sma1、Pme1、StuI進(jìn)行消化，純化DNA并連接接頭引物。按照設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并按照Genome walker(Clontech) PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增得到目的片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1202bp的條帶(圖2)，并進(jìn)行回收?；厥掌闻cpGEM-T載體連接得到重組質(zhì)粒，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切驗(yàn)證(圖3)，并測(cè)序。
[0025]棉蚜CYP6J1啟動(dòng)子(啟動(dòng)子序列如SEQIDN0:1所示，其中SEQIDN0:1的-1bp至-848bp區(qū)為棉蚜棉酚誘導(dǎo)型CYP6J1啟動(dòng)子的DNA核苷酸序列)，在棉蚜CYP6J1基因的5’區(qū)序列中得到鑒定。
[0026]在本文件的啟動(dòng)子序列表中,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基用+1示出,ATG用紅色標(biāo)注。并用啟動(dòng)子分析網(wǎng)站分析了啟動(dòng)子的核心元件。[0027]啟動(dòng)子分析網(wǎng)站
[0028]http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index, html
[0029]實(shí)施例2:棉蚜CYP6J1啟動(dòng)子表達(dá)載體pGL3_CYP6Jl (-848/+297)的構(gòu)建
[0030]將在實(shí)施例1中所克隆的棉蚜CYP6J1啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)(見(jiàn)序列表)插入到PGL3 載體中，從而構(gòu)建 pGL3-CYP6Jl (-848/+297)載體。
[0031 ]更具體地說(shuō)，利用引物(5-ACGCGTGACTTCTGCCTCAAAGAAG-3，5-CTCGAGTTTAGTTACCTCCTTAGTAT-3)擴(kuò)增并將該啟動(dòng)子序列克隆到pGL3載體MluI和XhoI位點(diǎn)上，構(gòu)建成pGL3-CYP6Jl (-848/+297)，用于驅(qū)動(dòng)Luc+的表達(dá)，經(jīng)PCR鑒定(圖4)和酶切鑒定(圖5)獲得啟動(dòng)子與載體的重組質(zhì)粒。
[0032]實(shí)施例3:鑒定本發(fā)明所述的棉蚜CYP6J1啟動(dòng)子的活性
[0033]Sf9 細(xì)胞接種于 24 孔板中(4X 105cells/孔)，用 CellfectinII 試劑(Invitrogen ；
2μ L/每孔)瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染pGL3-CYP6CY3(-2230/+71)建體(2μ g/孔)和對(duì)照?qǐng)?bào)告基因質(zhì)粒phRL-TK (Promega; 0.2 μ g/孔)，。48小時(shí)后，收獲細(xì)胞，將所得裂解物用于測(cè)量螢光素酶活性(Promega)。如圖6所示，pGL3_CYP6Jl (-848/+297)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞具有很高熒光素酶活性。
[0034]實(shí)用性
[0035]如上所述， 本發(fā)明提供棉蚜CYP6J1基因啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)。
[0036]本發(fā)明提供分別將棉蚜CYP6J1基因啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)插入至pGL3而獲得的真核細(xì)胞表達(dá)載體。
[0037]經(jīng)使用所述的真核細(xì)胞表達(dá)載體進(jìn)行鑒定，本發(fā)明所述的棉蚜CYP6J1基因啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)能夠啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。因此，本發(fā)明可用于提高真核基因的高效表達(dá)，應(yīng)用于獲得低豐度基因研究使其獲得聞水平、穩(wěn)定表達(dá)。
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種獲得的棉蚜棉酚誘導(dǎo)型^？6了1啟動(dòng)子序列，其特征在于所述啟動(dòng)子序列如82010^0: 1所示，其中3即10勵(lì):1的-1恥至-8481^區(qū)為棉蚜棉酚誘導(dǎo)型口？6了1啟動(dòng)子的0嫩序列，3即10勵(lì):1的+11^至+297恥區(qū)為棉蚜？450基因?^？6了1的5’非翻譯區(qū)的0嫩序列。
2.一種用于細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞表達(dá)載體，其特征在于所述真核細(xì)胞表達(dá)載體包含權(quán)利要求1所述的棉蚜棉酚誘導(dǎo)型^？6了1啟動(dòng)子序列。
3.一種用真核細(xì)胞表達(dá)載體的表達(dá)，其特征在于所述真核細(xì)胞表達(dá)包含權(quán)利要求1所述的棉蚜棉酚誘導(dǎo)型?^？6了1啟動(dòng)子序列。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103834658SQ201410020524
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】尚慶利, 潘怡歐, 楊晨, 席景會(huì), 楊巽, 畢銳, 辛雪成 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)