一種大豆小RNA基因gma-miR1507a及在鹽堿調(diào)控中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大豆小RNA基因gma-miR1507a及前體基因，它來自于大豆品種吉育72，將前體基因插入經(jīng)改造的pCAMBIA1301載體中，獲得pCAMBIA-bar-miR1507a載體質(zhì)粒，將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，轉(zhuǎn)染擬南芥中，實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥提高了植物的耐鹽堿脅迫能力。
【專利說明】—種大豆小RNA基因gma-m i R1507a及在鹽堿調(diào)控中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體為大豆中一個小RNA基因gma_miR1507a及在鹽堿調(diào)控中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]microRNA是目前廣泛研究的一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，長度范圍在19-29nt，平均長22nt，miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與真核生物發(fā)育的各個時期及過程，靶向調(diào)控動植物的多個代謝調(diào)控機制。miRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控與植物抗逆調(diào)控的關(guān)聯(lián)十分密切，近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在逆境脅迫下可發(fā)生表達變化，通過miRNA的升高或降低表達，響應(yīng)外界環(huán)境刺激。擬南芥中miR393，miR319及miR397，水稻miR393在干旱脅迫下發(fā)現(xiàn)表達水平上調(diào)。擬南芥的 miR396, miR167, miR319, miR159, miR394, miR156, miR171, miR158 和 miR393 在鹽脅迫條件下表達上調(diào)。毛果楊中的miR1446、miR1444、miR1447、miR145等基因在水缺乏的條件下表達下調(diào)。另外毛果楊miR1446、miR1445、miR1447、miR530的在鹽堿脅迫下表達下調(diào)。
[0003]很多保守miRNA在植物的生長發(fā)育中有重要作用，該作用主要通過對靶基因的調(diào)控實現(xiàn)。例如 miR156，miR159, miR164, miR165/166, miR167, miR169, miR171, miR172,miR319 及 miR396 的靶基因分別為轉(zhuǎn)錄因子 SPLs，ARFs, MYBs, TCPs, NACs, HD-ZIPs, NFYA,AP2-like factors, SCLs及GRFs等，轉(zhuǎn)錄因子作為植物發(fā)育的調(diào)控因子直接參與植物生長及抗逆應(yīng)答等過程。根據(jù)Genevestigator數(shù)據(jù)庫顯示:在植物逆境應(yīng)答過程中,某些保守的miRNA表達產(chǎn)生變化，靶基因表達水平也呈相關(guān)調(diào)整。在植物對逆境的脅迫應(yīng)答過程中，miRNA通過對靶基因的調(diào)控，增強或改善植物對環(huán)境的適應(yīng)性。
`[0004]大豆(Glycine max)作為世界上重要的糧食作物和油料作物。逆境脅迫嚴(yán)重危害大豆產(chǎn)量，通過大豆逆境脅迫下基因表達水平變化，挖掘大豆耐鹽堿基因資源，通過基因工程手段培育耐鹽堿作物，對提高大豆產(chǎn)量有現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種大豆中一個小RNA基因gma_miR1507a及其前體基因。
[0006]個小RNA基因gma_miR1507a如體基因，其喊基序列如序列表SEQ ID N0.1所不。
[0007]一個小RNA基因gma-miR1507a,其堿基序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
[0008]一種小RNA基因gma_miR1507a的表達載體pCAMBIA-bar_miR1507a,它是由下述方法制備:
1)人工合成序列表SEQID N0.3所不的bar基因序列；
2)用XhoI 酶切 bar 基因序列和 pCAMBIA1301，將 bar 插入 pCAMBIA1301 (購自 pcambia公司)的兩個XhoI酶切位點間，替換潮霉素抗性基因；
3)用HindIII和BstE II分步酶切質(zhì)粒，Taq酶補平末端后，用T4連接酶連接平末端；最后，將克隆的兩端帶有EcoRI的35S啟動子基因與EcoRI單酶切后的質(zhì)粒連接，獲得質(zhì)粒pCAMBIA-bar ；
4)目的基因和pCAMBIA-bar用Bamm和歷/?dIII雙酶切，連接，得pCAMBIA-bar-miR1507a。
[0009]本發(fā)明又一個目的是一個小RNA基因gma_miR1507a在培育耐鹽堿植物品種中的應(yīng)用。
[0010]一種培育耐鹽堿植物品種的方法，它包括:
1)將pCAMBIA-bar-miR1507a載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞中；
2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化至植物中。
[0011 ] 本發(fā)明提供了一種大豆中一個小RNA基因gma_miR1507a及前體基因，它來自于大豆品種吉育72，將前體基因插入經(jīng)改造的pCAMBIA1301載體中，獲得pCAMBIA-bar-miR1507a載體質(zhì)粒，將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，轉(zhuǎn)染擬南芥中，實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥提高了植物的耐鹽堿脅迫能力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1吉育72大豆品種gma_miR1507a在逆境脅迫下基因表達分析圖；
圖2為gma-miR1507a前體基因克隆產(chǎn)物電泳圖；
圖3為pMD19-T simple-miRNA1507a質(zhì)粒進行雙酶切電泳圖；
圖4轉(zhuǎn)miR1507a基因的擬南芥PCR鑒定圖`；
圖5轉(zhuǎn)miR1507a基因擬南芥的高表達株系篩選；
圖6為轉(zhuǎn)基因擬南芥在各協(xié)迫條件下的發(fā)芽率照片，其中:A.空白對照；B.1OOmM NaCl脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥生長狀況；C.7.5mM NaHCO3脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥生長狀況；D.90mM NaCl+5mM NaHCO3脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥生長狀況；E.7%PEG脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥生長狀況；
圖7為轉(zhuǎn)基因擬南芥在各協(xié)迫條件下的發(fā)芽率柱狀圖；
圖8轉(zhuǎn)基因擬南芥4片葉齡時，各協(xié)迫條件下長勢照片。
【具體實施方式】
[0013]實施例1 gma_miR1507a基因及其前體基因的獲得
選吉育72(本驗室保存)大豆品種，通過I X Hoagland培養(yǎng)液水培獲得大豆幼苗，3天更換一次培養(yǎng)液，待幼苗長出兩葉一心時，使用含有20mM NaCl的培養(yǎng)基脅迫處理。24小時后采集葉片，液氮中固定半小時后放入_80°C冰箱中保存。提取葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0014]以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，使用引物 gma-miR1507aF-2，gma_miR1507aR-2，擴增兩端帶有漢3ΜΠ和酶切位點的gma-miR1507a前體基因序列(見圖2)。將含有g(shù)ma_miR1507a前體序列構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19_T simple-miR1507a并進行測序驗證。用限制性內(nèi)切酶漢.ΗΙ和歷/7dIII按照下列體系對pMD19-T simple-miR1507a進行雙酶切，然后回收目的基因(見圖3)。如體基因喊基序列如序列表SEQ ID N0.1所不。
【權(quán)利要求】
1.1v小RNA某因gmaniR1507a如體基因，其喊基序列如序列表SEQ ID N0.1所不。
2.一個小RNA基因gma-miR1507a，其堿基序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
3.一種小RNA基因gma-miR1507a的表達載體pCAMBIA-bar_miR1507a，它是由下述方法制備: 1)人工合成序列表SEQID N0.3所不的bar基因序列； 2)用XhoI 酶切 bar 基因序列和 pCAMBIA1301，將 bar 插入 pCAMBIA1301 (購自 pcambia公司)的兩個XhoI酶切位點間，替換潮霉素抗性基因； 3)用HindIII和BstE II分步酶切質(zhì)粒，Taq酶補平末端后，用T4連接酶連接平末端；將克隆的兩端帶有EcoRI的35S啟動子基因與EcoRI單酶切后的質(zhì)粒連接，獲得質(zhì)粒pCAMBIA-bar ； 4)序列表SEQID N0.1所示的基因和pCAMBIA-bar用漢.ΗΙ和歷雙酶切，連接，得 pCAMBIA-bar-miR1507a。
4.權(quán)利要求1或2所述的一個小RNA基因gma-miR1507a在培育耐鹽堿植物品種中的應(yīng)用。
5.一種培育耐鹽堿植物品種的方法，它包括: 1)將權(quán)利要求3所述的pCAMBIA-bar-miR1507a載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞中； 2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化至植物中。
【文檔編號】C12N15/11GK103757016SQ201410020732
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】李海燕, 董園園, 敬緩緩, 劉偉燦, 王南, 陳歡, 王法微, 周穎, 尹海龍, 周永剛, 趙利旦 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)