一種黑莓細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種黑莓細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液的制備方法，該制備方法通過(guò)農(nóng)桿菌介將γ-TMT（γ-tocopherolmethyl-transferase，γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶）基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入黑莓外植體細(xì)胞中，經(jīng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)后提取得到懸浮培養(yǎng)液；其中γ-TMT基因表達(dá)載體中包含編碼γ-TMT的多核苷酸片段。本發(fā)明能有效獲得富含α-生育酚的懸浮培養(yǎng)液，為工廠化生產(chǎn)高活性天然維生素E開(kāi)辟一條生物工程新途徑。
【專利說(shuō)明】一種黑莓細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液的制備方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種黑莓細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液的制備方法，具體涉及一種富含a -生育酚的懸浮培養(yǎng)液的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]維生素E是一種脂溶性的強(qiáng)抗氧化劑，自然界中只在植物和其他光合生物中合成，是人體和動(dòng)物必須從食物中攝取的微量營(yíng)養(yǎng)素之一，缺乏時(shí)很容易出現(xiàn)生殖系統(tǒng)的萎縮和損害，故又稱之為“生育酚”(tocopherol)。維生素E具有多種生理功能，歷來(lái)倍受重視，被廣泛地應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和動(dòng)物飼料制品中。
[0003]維生素E由四種生育酚(a-，β-, Y-, δ-生育酚)和四種生育三烯酚(α-，β-，Y-, S-生育三烯酚)組成，其中a-生育酚活性最高，因?yàn)槿思皠?dòng)物組織中的a-生育酚結(jié)合蛋白(a-TTP)可優(yōu)先結(jié)合a-生育酚。然而，大多數(shù)作為天然維生素E來(lái)源的油料作物如油菜、花生、大豆的種子中，Ve的主要成分是Y-生育酚和δ-生育酚，而活性較高的a -生育酚含量較低，即便是合成維生素E中a -生育酚所占的比例也不大。
[0004]黑莓是一種小槳果類果樹(shù)，其果實(shí)中富含亞油酸、花青素、維生素E、Y-氨基丁酸、超氧化物歧化酶(SOD)等營(yíng)養(yǎng)保健成分，其種子中維生素E的含量(198.0 mg/100 g)遠(yuǎn)高于葵花籽(59.0 mg/100 g)和葡萄籽(55.4 g/100 g)，而且其維生素E中Y -生育酚含量為41-109 mg/100g, a -生育酚含量為9.7-37.8mg/100g，δ-生育酚較少。
[0005]通過(guò)植物特定組織的培養(yǎng)來(lái)獲取具有目標(biāo)活性的天然產(chǎn)物，已經(jīng)被證明是一種行之有效的獲取天然活性物質(zhì)的途徑。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是這一方法的核心技術(shù)，它具有代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)條件可控、可以通過(guò)改變培養(yǎng)條件和選擇優(yōu)良培養(yǎng)體系得到超整株植物產(chǎn)量的代謝產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)富含維生素E的紅花、小麥胚芽、向日葵細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)高活性的生育酚已有報(bào)道。Y-TMT基因主要是調(diào)控Y-生育酚轉(zhuǎn)化為a-生育酚，已有研究報(bào)道Y-TMT基因在擬南芥種子和大豆種子中的超量表達(dá)，使種子中維生素E的含量及其中a-生育酚的比例大幅度提聞。
[0006]利用黑莓種子中維生素E (尤其是a-生育酚)含量豐富的特點(diǎn)，外加轉(zhuǎn)Y-TMT基因調(diào)控，通過(guò)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)制備維生素E，可以為工廠化生產(chǎn)高活性天然維生素E開(kāi)辟一條新途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種富含a-生育酚的懸浮培養(yǎng)液的制備方法。
[0008]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因黑莓體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液的制備方法，該方法通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將Y-TMT ( Y -tocopherol methyl- transferase, Y -生育酌.甲基轉(zhuǎn)移酶)基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入黑莓外植體細(xì)胞中，經(jīng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)后提取得到懸浮培養(yǎng)液；其中Y-TMT基因表達(dá)載體中包含編碼Y-TMT的多核苷酸片段。[0009]上述細(xì)胞懸浮培養(yǎng)采用MS培養(yǎng)基，pH 6.0-7.0 (優(yōu)選6.0)，其中含蔗糖25_30g/L (優(yōu)選 30g/L)、2，4-D 1.0-1.5mg/L (優(yōu)選 1.0 mg/L)、水解酪蛋白 200_300mg/L (優(yōu)選 200mg/L);接種量為l-2g/50mL (優(yōu)選2g/50mL);暗培養(yǎng)15-25天；培養(yǎng)溫度及搖床轉(zhuǎn)速采取細(xì)胞懸浮培養(yǎng)常用條件，優(yōu)選培養(yǎng)溫度為25±0.2°C，優(yōu)選搖床轉(zhuǎn)速為110r/min。
[0010]本發(fā)明中用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的黑莓體細(xì)胞中導(dǎo)入了 Y-TMT基因，該基因的克隆、載體構(gòu)建和導(dǎo)入方法如下:
(I)擬南芥總RNA的提取。
[0011](2) Y-TMT基因克隆:以擬南芥總RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的第一條cDNA鏈為模板，利用引物(TMT-F:5’ -CTTGGATCCATGAAAGCAACTCTAGCAGC-3’ 和 TMT-R:5’ -CGGGATCCGAGTGGCTTCTGGCAAGTGAT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳，經(jīng)與Marker比對(duì)和測(cè)序確認(rèn)，得到Y(jié)-TMT基因全長(zhǎng)片段。
[0012](3)基因表達(dá)載體構(gòu)建:利用PMD19-T載體連接所述編碼Y -TMT的多核苷酸片段后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選出轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，提取得到含有編碼Y-TMT的基因的克隆載體pMD-TMT ；pMD-TMT載體及pBI121載體經(jīng)及I酶切后，以T4連接酶連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取得到重組質(zhì)粒PBI121-TMT，即為Y -TMT基因表達(dá)載體。
[0013](4)遺傳轉(zhuǎn)化:將pBI121-TMT導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，經(jīng)含卡那霉素(Kan)和利福平(Rif)的YEB平板篩選，獲得用于遺傳轉(zhuǎn)化的Y -TMT正義基因工程菌；在YEB固體平板上劃線培養(yǎng)Y-TMT正義基因轉(zhuǎn)化工程菌菌株，經(jīng)提取、鑒定后加到Y(jié)EB培養(yǎng)液中，28°C、250 rpm振蕩培養(yǎng)18_24h，無(wú)菌條件下收集菌體，重懸于MS液中，使其0D_=0.3-0.4，制備用于侵染轉(zhuǎn)化的工程菌液；將預(yù)培養(yǎng)的黑莓愈傷組織(胚性愈傷組織)浸入工程菌液，輕輕搖動(dòng)以使之與細(xì)菌充分接觸，浸泡5-10 min后，倒去菌液，轉(zhuǎn)接于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，對(duì)侵染后的愈傷組織樣品分別進(jìn)行PCR和RT-PCR分子鑒定，其中顯示為陽(yáng)性的愈傷組織表明已導(dǎo)入Y-TMT基因,可用于懸`浮培養(yǎng)。
[0014]本發(fā)明中細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法如下:
(I)懸浮培養(yǎng)體系的建立:采用MS培養(yǎng)液，以25-30g/L蔗糖作為碳源，pH 6.0-7.0,附加1.0-1.5mg/L 2，4-D和200-300mg/L水解酪蛋白；黑莓轉(zhuǎn)Y-TMT基因的愈傷組織接種量為l-2g/50mL ;培養(yǎng)溫度為25±2°C ;搖床轉(zhuǎn)速為110r/min ;暗培養(yǎng)15-25天。
[0015](2)細(xì)胞懸浮培養(yǎng):于無(wú)菌操作臺(tái)中挑取轉(zhuǎn)Y -TMT基因的愈傷組織，用鑷子夾碎后放入培養(yǎng)液中，在恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床上進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。
[0016]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明從擬南芥中克隆出催化低活性Y-生育酚生成高活性的α-生育酚的Y-TMT基因，構(gòu)建Y-TMT基因表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將該基因轉(zhuǎn)入適宜的黑莓外植體細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)篩選，得到α -生育酚含量高、性狀穩(wěn)定的細(xì)胞株系，通過(guò)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，從而獲得富含α -生育酚的懸浮培養(yǎng)液，為工廠化生產(chǎn)高活性天然維生素E開(kāi)辟一條生物工程新途徑。
[0017]本發(fā)明通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)Y-TMT基因的黑莓愈傷組織懸浮培養(yǎng)條件的篩選，獲得具有最大生物量的懸浮培養(yǎng)體系。黑莓種子中α-生育酚占總生育酚含量的24.3%左右，經(jīng)本發(fā)明制備得到的懸浮培養(yǎng)液中α -生育酚占總生育酚含量提高到85.7%。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0018]圖1為基因表達(dá)載體pBI121_TMT驗(yàn)證電泳圖；
圖2為轉(zhuǎn)Y -TMT基因黑莓愈傷組織的PCR檢測(cè)電泳圖；
圖3為轉(zhuǎn)Y -TMT基因黑莓愈傷組織的RT-PCR檢測(cè)電泳圖。
[0019]圖1中，泳道I:Mark DL 2000bp，泳道2:目的基因條帶1047bp，泳道3:35s正向引物和目的基因方向引物組合擴(kuò)增條帶；
圖2中，泳道1:Mark DL 2000bp，泳道2:空白樣品，泳道3_8:轉(zhuǎn)y-TMT基因黑莓愈傷組織樣品；
圖3中，泳道1:Mark DL 2000bp，泳道2:空白樣品，泳道3_8:轉(zhuǎn)y-TMT基因黑莓愈傷組織樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0020]I材料、試劑與儀器
1.1材料
擬南芥(Columbia型)、大腸桿菌{Escherichia coli) DH5a、表達(dá)載體pBI121質(zhì)粒(為改良過(guò)的高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體，該質(zhì)粒具有可以整合到植物基因組的T-DNA，CaMV 35S啟動(dòng)子，及新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nPt II )基因)。
[0021]黑莓品種‘Kiowa’種子產(chǎn)生的嫩黃色、顆粒狀、質(zhì)地疏松的胚性愈傷組織。
[0022]1.2 試劑
PUM-T simple vector、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、LA Taq DNA聚合酶、Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、各種限制性內(nèi)切酶，均購(gòu)自TaKaRa公司；Plant RNA Reagent kit和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購(gòu)自Tian Gen公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0023]1.3培養(yǎng)基
(I)基本培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L+酵母提取物10 g/L+NaC15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.2。
[0024]LB固體培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基+15 g/L瓊脂。
[0025]YEB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L+酵母提取物10 g/L+蔗糖5 g/L+MgS04 0.493 g/L，用NaOH 調(diào) pH 至 7.2。
[0026]YEB固體培養(yǎng)基:YEB培養(yǎng)基+15 g/L瓊脂。
[0027](2)大腸桿菌培養(yǎng)基
劃線固體培養(yǎng)基=LB固體培養(yǎng)基+100 μ L/1OOmL卡那霉素。
[0028]液體培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基+100 μ L/1OOmL卡那霉素。
[0029](3)農(nóng)桿菌培養(yǎng)基
劃線固體培養(yǎng)基:ΥΕΒ固體培養(yǎng)基+100 μ L/1OOmL卡那霉素+50 μ L/1OOmL利福平。
[0030]液體培養(yǎng)基:ΥΕΒ液體培養(yǎng)基+100 μ L/1OOmL卡那霉素+50 μ L/1OOmL利福平。
[0031](4)篩選培養(yǎng)基
固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基+100 μ L/1OOmL卡那霉素+50 μ L/1OOmL利福平。
[0032]1.4 儀器
主要儀器設(shè)備有 MultiGene Thermal Cycler (TC9600-G-230V) PCR 擴(kuò)增儀(Labnet，美國(guó))，Tanon-2500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖象分析系統(tǒng)(天能，上海)，HZ-2011KA微電腦恒溫振蕩器(華利達(dá)，江蘇太倉(cāng))，TGL-16LM型高速冷凍離心機(jī)(星科，湖南長(zhǎng)沙)，DYCP-31DN型水平電泳槽(六一，北京)，TU-1810紫外分光光度計(jì)(普析通用，北京)。
[0033]2 方法
2.1擬南芥Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(Y-TMT)基因的克隆
2.1.1 PCR引物設(shè)計(jì)
搜索 NCBI GenBank,查找到擬南芥 Y -TMT 基因 mRNA (GenBank 登陸號(hào) ΝΜ_105171.3)。依據(jù) mRNA 序列設(shè)計(jì)引物 TMT-F:5’ -CTTggatccATGAAAGCAACTCTAGCAGC_3’ ；TMT-R:5’ -CGggatccGAGTGGCT TCTGGCAAGTGAT-3’，上下游均含 BamHI 酶切位點(diǎn)。
[0034]2.1.2擬南芥RNA提取及cDNA合成
(I)總 RNA 的提取(Plant RNA Reagent kit 法)
I)取擬南芥全株切碎，用玻璃棒或強(qiáng)力勻漿器攪勻，于液氮中用研缽磨碎，每50-100mg組織加I mL裂解液RL和38μ?沉淀劑A后勻漿。組織樣品容積不能超過(guò)RL容積的10%。
[0035]2)將勻漿樣品劇烈震蕩混勻，在15_30°C下孵育5min以使核蛋白體完全分解。
[0036]3) 4°C下12，OOOrpm離心IOmin,小心取上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的RNase free的離心管中。
[0037]4)每ImL RL加0.2mL氯仿，蓋緊樣品管蓋，劇烈振蕩15 sec,并將其在室溫下孵育 3 min。
[0038]5) 4°C下12，OOOrpm離心10 min,樣品會(huì)分成三層，即下層有機(jī)相、中間層和上層的水相，RNA存在于水相中。水相層的容量大約為所加RL體積的60%，把水相轉(zhuǎn)移到新管中。
[0039]6)加入I倍體積70%乙醇，顛倒混勻，得到的溶液和可能沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管內(nèi))。
[0040]7) 10，OOOrpm離心45 sec，棄掉廢液，將吸附柱重新套回收集管。
[0041]8)加500μ?去蛋白液RE, 12，OOOrpm離心45 sec,棄掉廢液。
[0042]9)加 700μ? 漂洗液 RD, 10, OOOrpm 離心 15 sec,棄掉廢液。
[0043]10)加 700μ? 漂洗液 RW，12，OOOrpm 離心 60 sec，棄掉廢液。
[0044]11)可選步驟:加500μ?漂洗液RW, 12, OOOrpm離心60 sec,棄掉廢液。
[0045]12)將吸附柱RA放回空收集管中，12，OOOrpm離心2min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
[0046]13)取出吸附柱RA，放入RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加50-80μ? RNase free water (事先在65_70°C水浴中加熱效果更好)，室溫放置2min，12，OOOrpm離心lmin。如果需要較多RNA，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心Imin,或者另外再加30PL RNase free water,離心lmin,合并兩次洗脫液。
[0047]14)用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的擬南芥總RNA，條帶清晰、明亮，說(shuō)明此RNA純度和完整性較好，可以滿足RT-PCR的要求(如圖1所示)。
[0048](2)cDNA 合成
cDNA制備利用2yg RNA和01igol8⑴引物進(jìn)行cDNA第一鏈合成，步驟參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
[0049]I)按以下組分配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液:0.2_2Pg Total RNA or Poly⑷RNA，Ιμ?Oligo dT or Random Primer (50MM), IM-L dNTP Mixture (IOmM each),Up to 14M-L RnaseFree H2O。
[0050]2)在PCR儀上按以下條件進(jìn)行變性和退火反應(yīng):65°C，5min，然后置于冰上急冷。
[0051]3)在上述變性、退火的反應(yīng)液中加 4KL 5X first-strand Buffer, IM-L M-MuL VReverse Transcriptase (200U/M-L), IM-L Rnase Inhibitor, Total 20KL。
[0052]4)在PCR儀上按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):42-50°C，45-60min ;70°C，10min。之后隨即冰上冷卻，得到的cDNA可以直接用于后續(xù)的PCR等反應(yīng)，也可以-20 V冷凍以備以后使用。
[0053]2.1.3 Y-TMT cDNA 全長(zhǎng)的擴(kuò)增
以擬南芥cDNA為模板，用2.1.1中設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增采用20μ? 反應(yīng)體系，包括2μ? 10Xbuffer，0.2μ? 10 mmol/L dNTPs，2PL 10 pmol/^L引物，0.2μ?5 υ/μ? Taq 酶，?μ? cDNA 模板，ddH20 14.6μ?。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min，94°C變性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸60sec，35個(gè)循環(huán)后72°C延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物均用
1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，與Marker相比在1000bp左右均有一條特異性條帶(如圖2所示)。
[0054]2.1.4 Y -TMT cDNA全長(zhǎng)目的片段的回收、連接及轉(zhuǎn)化 (O目的片段回收
I)在長(zhǎng)波紫外燈下，用干凈刀片將所需回收的DNA條帶切下，盡量切除不含DNA的凝膠，得到的凝膠體積越小越好。
[0055]2)將切下含有DNA條帶凝膠放入1.5mL的離心管，稱重(先稱一個(gè)空1.5mL離心管的重量，然后放入凝膠塊后再稱一次，兩次重量相減，得到凝膠的重量)。
[0056]3)加入三倍體積溶膠/結(jié)合液DB (如果凝膠重為0.1g,其體積可視為100μ?，則加入300μ?溶膠液)。
[0057]4) 56°C水浴放置IOmin (或直至膠完全溶解)。每2_3min渦旋震蕩一次幫助加速溶解。
[0058]5)每IOOmg最初的凝膠重量加入150μ?異丙醇，震蕩混勻。
[0059]6)將上一步所得溶液加入吸附柱AC中(吸附柱套在收集管內(nèi))，12，OOOrpm離心30_60sec，倒掉收集管中的廢液。
[0060]7)加入700μ?漂洗液WB, 12，OOOrpm離心lmin,棄掉廢液。
[0061]8)加入500μ?漂洗液WB, 12，OOOrpm離心lmin,棄掉廢液。
[0062]9)將吸附柱AC放回空收集管中，12，OOOrpm離心2min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
[0063]10)取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50μ?洗脫緩沖液ΕΒ(事先在65-70°C水浴中加熱效果更好)，室溫放置2min，12，OOOrpm離心lmin。如果需要較多量DNA，可將得到的溶液重新加入離心管吸附柱中，離心lmin。
[0064](2)目的片段連接
I)將pUM-T simple vector載體在冰上融化,將裝有載體的離心管短暫離心,使粘在管壁的液體沉于管底部。
[0065]2)按照下面連接反應(yīng)體系的內(nèi)容在無(wú)菌的離心管中加入各種成分，載體與瓊脂糖膠回收的片段的摩爾比控制在1:3-1:8，以1000bp片段為例其濃度應(yīng)該在50-125ng的范圍內(nèi)，且隨著片段濃度的增加陽(yáng)性率隨之增加。連接反應(yīng)體系:Χμ L新鮮PCR片段，I ULpUM-T(約 40ng/^L)，5 μ L 2XT4DNA Rapid Ligation Buffer, I μ L T4DNA Ligase，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足到10 μ L。
[0066]3)用無(wú)菌槍頭輕輕吹吸以混勻內(nèi)容物(如果產(chǎn)生氣泡可短暫離心)，將連接體系置于22-25°C下反應(yīng)10-15min，連接片段小于1.5kb時(shí)連接時(shí)間lOmin，連接片段大于1.5kb時(shí)連接時(shí)間15min。反應(yīng)結(jié)束后將離心管置于冰上轉(zhuǎn)化。
[0067](3)基因轉(zhuǎn)化
I)將萬(wàn).coli DH5a質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞置于冰水中融化，把上述連接產(chǎn)物加入到50-100μ?感受細(xì)胞中，快速輕柔混勻。冰水浴中靜置30min。
[0068]2)將感受態(tài)細(xì)胞放入42°C水浴中，熱激60_90sec，迅速取出后置于冰水中靜置l-2min。 [0069]3)向離心管中加入50(^L37°C預(yù)熱的(不含抗生素)LB培養(yǎng)基，150rpm、37°C振蕩培養(yǎng)45-60min，使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)。
[0070]4)將離心管中的菌液離心，棄部分上清，保留約200μ?，再與沉淀細(xì)胞混勻，加到已經(jīng)含有l(wèi)OOPL/lOOmL卡那霉素和lOOPL/lOOmL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上(由于本載體具有極高的白斑率，所以可以直接將菌液涂布氨芐抗性平板，不需要藍(lán)白斑篩選)，用無(wú)菌的彎頭玻棒輕輕地將細(xì)胞均勻涂開(kāi)，如果想得到更多的轉(zhuǎn)化子，可以將菌液低速離心后，去掉大部分上清，然后懸浮菌體全部涂布到氨芐抗性平板上。待平板表面干燥后，倒置平板，37°C培養(yǎng) 12-16hr。
[0071](4)質(zhì)粒提取
I)取1.5-4.5mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液,9，000 rpm離心30sec,棄上清,收集菌體,盡可能的倒干上清。處理超過(guò)1.5mL菌液可以棄上清后，在同一個(gè)1.5mL管內(nèi)加入更多的菌液，重復(fù)步驟I)，直到收集到足夠的菌體。
[0072]2)用250μ?溶液Pl重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至徹底懸浮。
[0073]3)加250μ?溶液Ρ2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6_10次使菌體充分裂解，直到溶液變得清売。
[0074]4)加400μ?溶液Ρ3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-10次，室溫放置5min。室溫13，OOOrpm離心IOmin,小心取上清。
[0075]5)將吸附柱安置于收集管上，將上一步所得上清液加入吸附柱AC中(吸附柱套在收集管內(nèi)，溶液太多可分兩次加入)，13, OOOrpm離心IOmin,棄濾液。
[0076]6)加入 500PL 漂洗液 WB, 13, OOOrpm 離心 30_60sec,棄濾液。
[0077]7)重復(fù)步驟 6), 13，OOOrpm 離心 30_60sec,棄濾液?？罩?13，OOOrpm 離心 2 min。室溫放置3-5min，除去殘留乙醇。
[0078]8)取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加60-100 μ?洗脫緩沖液EB (事先在65-70°C水浴中加熱效果更好)，室溫放置lmin，13，000 rpm離心Imin洗脫DNA，可立即用于下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)或_20°C保存。
[0079]經(jīng)抗性篩選及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)，選取陽(yáng)性克隆菌液測(cè)序，測(cè)序結(jié)果(SEQ IDNO:1)顯示，擴(kuò)增片段大小為1047bp，ORF區(qū)域推測(cè)編碼350個(gè)氨基酸，與GenBank登錄的Y-TMT基因序列的同源性為99.9%，在1047個(gè)堿基中只有I個(gè)(A-G)不同，且氨基酸序列幾乎完全相同(S-N)，不在其主要功能域。這說(shuō)明所克隆的基因?yàn)閅-TMT基因，可用于后續(xù)表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0080]2.2 Y-TMT cDNA植物表達(dá)載體的構(gòu)建
測(cè)序驗(yàn)證正確的菌樣繼續(xù)擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pUM-TMT用BanM I酶切，割膠回收酶切產(chǎn)物；同時(shí)一并用SaMl I酶切PBI121質(zhì)粒，并進(jìn)行割膠回收酶切產(chǎn)物。酶切反應(yīng)體系如下:5 μ L 質(zhì)粒，2.5 μ L Buffer, I μ L Bam^ I , 40.5 μ L ddH20，總體積 50 μ L。
[0081]兩種酶切產(chǎn)物用T4連接酶進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Ε.co7iDH5a。鋪平板，挑取白斑搖菌，菌樣做模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。能夠擴(kuò)出目的條帶的菌樣保留，即為陽(yáng)性。將上述陽(yáng)性菌搖菌，提取質(zhì)粒酶切鑒定，如圖3所示，結(jié)果出現(xiàn)了預(yù)期目的條帶，說(shuō)明獲得了 Y-TMT基因的植物融合表達(dá)載體。重組成功的載體命名為PBI121-TMT。
[0082]2.3 pBI121-TMT 的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
提取陽(yáng)性載體質(zhì)粒PBI121-TMT，凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，28°C過(guò)夜培養(yǎng)。挑取菌斑，搖菌，將菌樣作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將能夠擴(kuò)出目的條帶的菌樣保留，作為最終保留的菌樣，用于后續(xù)侵染愈傷組織。
[0083]( I)根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
I)挑取_70°C保存的根癌 農(nóng)桿菌EHA105于YEB固體培養(yǎng)基(含利福平50mg/L)，平板劃線，28°C培養(yǎng)。
[0084]2)挑取單菌落接種于3mL的YEB液體培養(yǎng)基(含利福平50mg/L)中，220rpm 28°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
[0085]3)取過(guò)夜培養(yǎng)菌液ImL接種于50 mLYEB (含利福平50mg/L)液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至0D600為0.5。
[0086]4)取 2mL 菌液，I3OOOrpm 離心 3Osec,棄上清。
[0087]5)加入1000 μ? 20mM CaCl2，使農(nóng)桿菌細(xì)胞充分懸浮，冰浴30min。
[0088]6) 13000rpm離心30sec，棄上清，置于冰上，加入500μ?預(yù)冷的20mMCaCl2，充分懸浮細(xì)胞，冰浴中保存，24hr內(nèi)使用，或液氮中速凍lmin，置-70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0089](2)質(zhì)粒DNA導(dǎo)入農(nóng)桿菌
I)在200μ?感受態(tài)細(xì)胞中加入2~6μ?質(zhì)粒(pBI121 )DNA，冰浴5min，液氮中速凍5min。
[0090]2)迅速轉(zhuǎn)入37 °C水浴中，熱激5min。
[0091]3)加入ImL YEB液體培養(yǎng)基，28 °C慢速振蕩培養(yǎng)2~4hr。
[0092]4)3000rpm離心4min，去一部分上清，留取200μ?菌液涂布于含有5(^g/mL卡那霉素和5(^g/mL利福平的YEB平板。
[0093]5)放置約0.5hr，待水份干后，28°C培養(yǎng)約36_48hr至長(zhǎng)出菌落。
[0094]2.4黑莓愈傷組織的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
從_70°C冰柜中取實(shí)驗(yàn)所需菌株，在YEB固體平板上劃線培養(yǎng)，挑取在YEB固體平板上長(zhǎng)出的單菌落，進(jìn)行微量提取，并作鑒定。將鑒定正確的菌液加到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基中，28°C下250 rpm振蕩培養(yǎng)18_24h，無(wú)菌條件下收集菌體，重懸于MS液中，使其0D600=0.3-0.4，制備用于侵染轉(zhuǎn)化的工程菌液。
[0095]將預(yù)培養(yǎng)(MS+ 2,4-D 1.0 mg/L，25°C，7d)后的黑莓種子胚性愈傷組織(嫩黃色、顆粒狀、質(zhì)地疏松)浸入工程菌液，輕輕搖動(dòng)以使之與細(xì)菌充分接觸，浸泡5 -1Omin后，除去菌液，轉(zhuǎn)接于共培養(yǎng)基(MS+ 2,4-D 1.0 mg/L +AS 100 μ mol/L)上培養(yǎng)3d，之后轉(zhuǎn)接到抑菌培養(yǎng)基(MS+ 2, 4-D 1.0 mg/L +AS 100 μ mol/L+Cef 500 mg/L)上培養(yǎng) 7d，之后轉(zhuǎn)接到含有抗生素和抑菌素的選擇性培養(yǎng)基(MS+ 2,4-D 1.0 mg/L +Kan 10 mg/L+Cef 500 mg/L)上進(jìn)行抗性篩選，將表現(xiàn)陽(yáng)性的愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)接和鑒定。
[0096]對(duì)轉(zhuǎn)基因后的愈傷組織進(jìn)行分子鑒定。經(jīng)PCR和RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中有4個(gè)樣品表現(xiàn)為陽(yáng)性，如圖2和圖3所示，說(shuō)明成功獲得了可用于懸浮培養(yǎng)的轉(zhuǎn)Y-TMT基因的愈傷組織。
[0097]2.5轉(zhuǎn)基因愈傷組織的鑒定
(I)轉(zhuǎn)基因愈傷組織基因組DNA的小量提取(CTAB法)
I)在1.5 mL離心管中加入500 uL 2XCTAB, 65°C預(yù)熱，用前加入20 μ L β -琉基乙醇。
[0098]2)取幼嫩的愈傷組織1-2 g，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉(zhuǎn)移粉末至預(yù)熱的離心管中，總體積達(dá)lmL，混勻后置于65°C水浴中保溫45-60min，期間不時(shí)輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)試管。
[0099]3)加等體積的氯仿/異戊醇，輕輕地顛倒混勻，冰上放置5 min，室溫下10000 rpm離心10 min。
[0100]4)移上清至另一新管中。重復(fù)操作步驟3)，最好兩次。
`[0101]5)加入2倍體積的無(wú)水乙醇或0.7倍體積的異丙醇，出現(xiàn)絮狀沉淀，冰上放置IOmin,室溫 12000rpm 離心 10_15min,回收 DNA 沉淀。
[0102]6)用70%乙醇清洗沉淀兩次，1000 rpm離心I min，超凈臺(tái)中吹干后溶于適量的滅菌水中。
[0103]7 )瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。
[0104](2)轉(zhuǎn)基因愈傷組織的PCR鑒定 PCR鑒定的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件同2.1.2。
[0105](3)轉(zhuǎn)基因愈傷組織的RT-PCR鑒定
提取PCR鑒定成功的愈傷組織RM,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，依據(jù)2.1.2反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0106]2.6轉(zhuǎn)基因愈傷組織的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
于無(wú)菌操作臺(tái)中挑取胚性愈傷組織(選自黑莓品種‘Kiowa’無(wú)菌苗種子產(chǎn)生的嫩黃色、顆粒狀、質(zhì)地疏松的胚性愈傷組織)，用鑷子夾碎后取一定質(zhì)量的胚性愈傷組織放入預(yù)盛50mL培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，在恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式DKY-1I型搖床上進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。
[0107]2.6.1培養(yǎng)基種類對(duì)‘Kiowa’愈傷組織懸浮培養(yǎng)的影響
將‘Kiowa’的愈傷組織分別接種于不同種類的液體培養(yǎng)基(MS、B5、N6)中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)基中均添加激素2，4-D 1.0 mg/L，每隔7 d進(jìn)行一次觀察、統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理接種6瓶，各重復(fù)3次。
[0108]2.6.2糖種類對(duì)‘Kiowa’愈傷組織懸浮培養(yǎng)的影響
將‘Kiowa’的愈傷組織分別接種于附加25g/L蔗糖、麥芽糖、葡萄糖的MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)基中均添加激素2，4-D 1.0 mg/L，每隔7 d進(jìn)行一次觀察、統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理接種6瓶，各重復(fù)3次。
[0109]2.6.3蔗糖濃度對(duì)‘Kiowa’愈傷組織懸浮培養(yǎng)的影響
將‘Kiowa’的愈傷組織分別接種于附加不同濃度鹿糖(1(^/1、2(^/1、258/1、3(^/1、40g/L、50g/L、60g/L)的MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)基中均添加激素2，4-D 1.0mg/L，每隔7 d進(jìn)行一次觀察、統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理接種7瓶，各重復(fù)3次。
[0110]2.6.4 pH值對(duì)‘Kiowa’愈傷組織懸浮培養(yǎng)的影響
將‘Kiowa’的愈傷組織分別接種于不同pH值(5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0)的MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)基中均添加激素2，4-D 1.0 mg/L，每隔7 d進(jìn)行一次觀察、統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理接種6瓶，各重復(fù)3次。
[0111]2.6.5激素種類對(duì)‘Kiowa’愈傷組織懸浮培養(yǎng)的影響
將‘Kiowa’的愈傷組織分別接種于附加1.0 mg/L濃度2，4_D、NAA、6_BA、KT、TDZ的MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，每隔7 d進(jìn)行一次觀察、統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理接種6瓶，各重復(fù)3次。
[0112]2.6.6 2，4-D濃度對(duì)‘Kiowa’愈傷組織懸浮培養(yǎng)的影響
將‘Kiowa’的愈傷組織分別接種于附加不同濃度2，4-D (0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L)的MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，每隔7 d進(jìn)行一次觀察、統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理接種6瓶，各重復(fù)3次。
[0113]2.6.7接種量對(duì)‘Kiowa’愈傷組織懸浮培養(yǎng)的影響` 將‘Kiowa’的愈傷組織按接種量(0.5g、lg、2g、3g、5g、10g)的不同接種于MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)基中均添加激素2，4-D 1.0 mg/L，每隔7 d進(jìn)行一次觀察、統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理接種6瓶，各重復(fù)3次。
[0114]2.6.8水解酪蛋白濃度對(duì)‘Kiowa’愈傷組織懸浮培養(yǎng)的影響
將‘Kiowa’的愈傷組織分別接種于附加不同濃度水解酪蛋白(CH) (O mg/L、200mg/L、300mg/L、400 mg/L、500mg/L、600mg/L)的MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)基中均添加激素2，4-D 1.0 mg/L，每隔7 d進(jìn)行一次觀察、統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理接種6瓶，各重復(fù)3次。
[0115]2.6.9光照時(shí)間對(duì)‘Kiowa’愈傷組織懸浮培養(yǎng)的影響
將‘Kiowa’的愈傷組織接種于附加1.0 mg/L 2，4_D的MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，光照處理時(shí)間分別為Oh和12h。每隔7 d進(jìn)行一次觀察、統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理接種6瓶，各重復(fù)3次。
[0116]除實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目以外，以上所有實(shí)驗(yàn)的基本培養(yǎng)條件是:MS液體培養(yǎng)基中蔗糖濃度為25g/L，pH 5.8-6.0，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照和黑暗培養(yǎng)各12h，轉(zhuǎn)速110r/min ;接種量為2g/50mL。
[0117]2.6.10懸浮培養(yǎng)體系的建立
綜合考慮各種因素，黑莓‘Kiowa’轉(zhuǎn)基因愈傷組織懸浮培養(yǎng)較佳條件為:以MS作為基本液體培養(yǎng)基，25-30g/L蔗糖作為碳源，pH 6.0-7.0,附加1.0-1.5mg/L 2，4-D和200-300mg/L水解酪蛋白，接種量為l_2g/50mL，暗培養(yǎng)。最佳培養(yǎng)體系為:以MS作為基本液體培養(yǎng)基，30g/L蔗糖作為碳源，pH 6.0，附加1.0 mg/L 2，4-D和200 mg/L水解酪蛋白，接種量為2g/50mL，溫度25.2°C，搖床轉(zhuǎn)速為110r/min，暗培養(yǎng)25天，培養(yǎng)中注意觀察和檢測(cè)懸浮細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目。[0118] 3 結(jié)果
以黑莓品種‘Kiowa’無(wú)菌苗種子產(chǎn)生的胚性愈傷組織為例，其未轉(zhuǎn)基因的野生樣品中總生育酚中α -生育酚含量為24.3%，采用上述最佳培養(yǎng)體系得到的轉(zhuǎn)基因愈傷組織懸浮培養(yǎng)液中總生育酚的α -生育酚含量為85.7%?！?10〉江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所〈120〉一種黑莓細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液的制備方法〈160〉 I
〈170〉PatentIn Version 3.3〈210〉 I〈211〉 1047〈212〉 PRT
〈213〉擬南芥(Arabidopsis thaliana)
〈
【權(quán)利要求】
1.一種黑莓細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于:該制備方法通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將Y-TMT基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入黑莓外植體細(xì)胞中，經(jīng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)后得到所述懸浮培養(yǎng)液；所述Y-TMT基因表達(dá)載體中包含編碼Y-TMT的多核苷酸片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述細(xì)胞懸浮培養(yǎng)采用MS培養(yǎng)液，pH 6.0-7.0，其中含蔗糖 25-30g/L、2，4-D 1.0-1.5mg/L、水解酪蛋白 200_300mg/L ;接種量為l-2g/50mL ;暗培養(yǎng)15-25天。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述細(xì)胞懸浮培養(yǎng)采用MS培養(yǎng)基，pH 6.0，其中含蔗糖30g/L、2，4-D 1.0mg/L、水解酪蛋白200mg/L ;接種量為2g/50mL ;培養(yǎng)溫度為25 ±0.2V ;搖床轉(zhuǎn)速為110r/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的制備方法，其特征在于:所述Y-TMT基因表達(dá)載體采用植物表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于:所述Y-TMT基因表達(dá)載體采用PBI121 載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的制備方法，其特征在于:所述Y-TMT基因表達(dá)載體中包含的編碼Y-TMT的多核苷酸片段通過(guò)以下方法制備: (1)提取擬南芥總RNA; (2 )以擬南芥總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，利用引物TMT-F:5，-CTTGGATCCATGAAAGCAACTCTAGCAGC-3’、TMT-R:5’ -CGGGATCCGAGTGGCTTCTGGCAAGTGAT-3’ 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，即得所述編碼Y-TMT的多核苷酸片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于:所述Y-TMT基因表達(dá)載體通過(guò)以下步驟制備: (O利用PMD19-T載體連接所述編碼Y-TMT的多核苷酸片段后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選出轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，提取得到含有編碼Y-TMT的基因的克隆載體pMD-TMT ； (2)取步驟(1)得到的克隆載體pMD-TMT及pBI121載體采用及I酶切后，經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取得到重組質(zhì)粒PBI121-TMT ;所述重組質(zhì)粒PBI121-TMT即為所述Y-TMT基因表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的制備方法，其特征在于:所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)采用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的制備方法，其特征在于:所述黑莓外植體細(xì)胞采用黑莓種子產(chǎn)生的胚性愈傷組織。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103756971SQ201410021769
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】方亮, 張春紅, 李維林, 湯飛云, 吳文龍, 胡淑英 申請(qǐng)人:江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所