一種生物合成慶大霉素x2工程菌的構建及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬醫(yī)藥【技術領域】，涉及生物合成慶大霉素X2基因工程菌的構建及其應用。利用微生物分子遺傳學技術，使絳紅小單孢菌中慶大霉素的生物合成關鍵基因失活，阻斷慶大霉素生物合成代謝流，定向積累慶大霉素X2。本發(fā)明通過構建重組質粒pFU503，并將pFU503導入絳紅小單孢菌GK1101，借助框內(nèi)敲除技術，滅活genB3基因的功能，篩選雙交換菌株，發(fā)酵產(chǎn)物檢測，新組分鑒定，確認為慶大霉素X2產(chǎn)生菌。本發(fā)明所構建工程菌，遺傳性狀穩(wěn)定，可大量積累慶大霉素X2，填補了國內(nèi)外研究空白。所構建的工程菌生產(chǎn)工藝簡單，發(fā)酵調(diào)控容易，合成效率高，提取精制方便，產(chǎn)品質量穩(wěn)定，幾乎達到潔凈的生產(chǎn)境界，具有重要的產(chǎn)業(yè)化應用價值，可產(chǎn)生極大的經(jīng)濟效益。
【專利說明】一種生物合成慶大霉素X2工程菌的構建及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于抗生素制藥領域，涉及生物合成慶大霉素X2基因工程菌的構建及其應用。具體涉及利用分子遺傳學技術，敲除絳紅小單孢菌麗GKllOl中慶大霉素生物合成關鍵基因阻斷慶大霉素Χ2的后續(xù)修飾，積累慶大霉素Χ2，可應用于藥物開發(fā)研究。
【背景技術】
[0002]微生物是藥物的重要來源，是微生物制藥的基礎。小單孢菌能產(chǎn)生許多重要的抗生素和微生物酶，其合成的氨基糖苷類抗生素在臨床上具有重要的應用價值，自瓦克斯曼發(fā)現(xiàn)鏈霉素以來，氨基糖苷類抗生素已經(jīng)在臨床上應用了 70年，而且至今仍然是臨床上不可缺少的抗感染藥物。隨著科學家對藥用微生物研究的不斷深入，小單孢菌被認為是尋找新化合物、新型藥物或其他具有生理活性物質的重要資源。
[0003]慶大霉素是一類由小單孢菌產(chǎn)生的廣譜抗感染氨基糖苷類抗生素。幾十年的研究證明，慶大霉素經(jīng)過不同化學基團修飾，可有效對付_耐藥菌感染。慶大霉素的結構特征是:由2-脫氧鏈霉胺(2-D0S)，絳紅糖胺和加拉糖胺通過糖苷鍵連接而成。因絳紅糖胺取代基團和取代位置的不同，形成了慶大霉素Α、B、X和C族等化合物。慶大霉素Α、B、X是慶大霉素生物合成途徑的中間產(chǎn)物，是開發(fā)抗原蟲藥物的重要化合物。此外，慶大霉素類衍生物還具有抗HIV效果。因此利用分子遺傳學技術`定向改造慶大霉素生物合成途徑，對積累慶大霉素單組份中間代謝產(chǎn)物具有重要的科學意義和現(xiàn)實意義。
[0004]隨著分子生物學技術的發(fā)展，分子遺傳學技術已成為后基因組時代闡明基因功能及工程菌構建的重要手段。慶大霉素生物合成基因簇(GenBake accession nos.:JQ975418，AJ628149，AY524043，AJ575934)的構建與測序，為研究該類藥物的深度開發(fā)奠定了堅實基礎。生物信息學的發(fā)展，為慶大霉素生物合成基因功能的預測及其生物合成途徑的闡明創(chuàng)造了條件。根據(jù)生物信息學知識及已有研究成果推斷慶大霉素生物合成基因簇上的#?似基因可能編碼氨基轉移酶，有可能是催化絳紅糖胺C6'的氨基轉移。理論推測，敲除絳紅小單孢菌私purpurea GKllOl (專利:201110331534.9)中genB3基因，可能定向積累慶大霉素X2，得到主產(chǎn)慶大霉素X2的基因工程菌。
[0005]氨基寡糖功能研究，特別是抗原蟲，抗病毒，抗腫瘤功能方面的研究，是當前國際研究的熱點。氨基寡糖被藥物學家看作是最有可能成為抗病毒和抗腫瘤藥物的一類化合物。慶大霉素B族、X族化合物早已被證明具有抗原蟲，抗病毒功效，是開發(fā)新型藥物的重要前體。慶大霉素生物合成過程，含有許多重要的氨基寡糖，但是它們僅僅是氨基寡糖生物合成的中間體，要獲得這些重要的化合物，十分困難，國內(nèi)外少見取得突破。本研究通過生物信息學技術，結合微生物分子遺傳學操作技術，在建立了系統(tǒng)的小單孢菌基因組改造的基礎上，成功地實現(xiàn)了對絳紅色小單孢菌該基因組的改良，在國際上首次得到了主產(chǎn)慶大霉素X2工程菌，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)慶大霉素X2奠定了堅實基礎，為進一步開發(fā)新型藥物奠定了創(chuàng)造了條件。本發(fā)明是在前一發(fā)明專利(201110331534.9)的基礎上，進一步拓展，是前一發(fā)明專利的深化，屬系列性專利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供生物合成慶大霉素X2基因工程菌的構建及其應用，通過構建重組質粒PFU503，并將pFU503導入絳紅小單孢菌GK1101，借助框內(nèi)敲除技術，滅活
基因的功能，篩選雙交換菌株，發(fā)酵產(chǎn)物檢測，新組分鑒定，確認為慶大霉素Χ2產(chǎn)生菌。本發(fā)明所構建工程菌，遺傳性狀穩(wěn)定，可大量積累慶大霉素Χ2，填補了國內(nèi)外研究空白。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
一種生物合成慶大霉素Χ2工程菌，所述的工程菌為絳紅色小單孢菌，該菌株被命名為Micromonospora purpurea 6----?,該菌株已于2013年12月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保蕆，其保藏編號為CGMCC N0.8597。
[0008]工程化慶大霉素生物合成菌株絳紅色小單孢菌(包括棘孢小單孢菌)，迫使慶大霉素生物合成停止在慶大霉素X2位點，不再進一步修飾，形成其它慶大霉素混合物，大量積累慶大霉素X2。
[0009]在已敲除基因的絳紅色小單孢菌GKl 101基礎上，進一步敲除genB3基因。
[0010]敲除genB3基因的關鍵序列，以達到喪失該基因功能為最終目的。
[0011]基因工程菌的構建方法，主要包括以下步驟:
A.同源重組質粒pFU503`的構建；
B.同源重組質粒pFU503導入絳紅色小單孢菌GKllOl；
C.接合子的篩選；
D.工程菌組分的鑒定。
[0012]利用所述的基因敲除方法，經(jīng)PCR分別獲得供《似基因上下游大約2000bp的兩個片段，作為交換臂，將兩者同時連接到PKC1139中，得到同源重組質粒pFU503。
[0013]轉化是以萬co7iET12657/pUZ8002介導的結合轉移方法。
[0014]借助抗性標記，篩選雙交換工程菌，刪除特定DNA序列，獲得經(jīng)生物合成且積累慶大霉素X2的工程菌。
[0015]所述的生物合成慶大霉素X2工程菌，在抗生素藥物制備中的應用。
[0016]基因敲除的方法是:借助PCR技術，擴增genB3上下游序列各2000 bp左右的片段，作為同源交換臂，兩個交換臂連接到穿梭載體PKC1139上，得到同源重組質粒pFU503，載體pKC1139上的安普霉素抗性基因作為后續(xù)研究的篩選標記。
[0017]重組質粒pFU503通過疋co7iET12657 (pUZ8002)介導，經(jīng)結合轉移進入絳紅小單孢菌GK1101。接合子能在含抗性(安普霉素AmK)篩選平板上萌發(fā)和生長，經(jīng)松弛培養(yǎng)數(shù)代，再從中篩選安普霉素敏感(Ams)菌株，通過PCR技術檢測，DNA測序驗證，確認得到主產(chǎn)慶大霉素X2的基因工程菌株GKB3226。
[0018]發(fā)酵液經(jīng)酸堿處理和離子交換樹脂提取，除雜精制后，代謝產(chǎn)物采用MS法檢測，進行最終確認。
[0019]其中基因genB3的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，基因genB3的氨基酸序列如SEQID NO:2 所示。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點在于:利用分子遺傳學技術，通過基因敲除法，構建&?似和基因缺失的工程菌。該基因工程菌阻斷慶大霉素生物合成途徑中的關鍵步驟，迫使代謝過程停留在特定位點，積累慶大霉素X2，填補了國內(nèi)外工業(yè)生產(chǎn)慶大霉素X2的技術空白。同時闡明了基因的功能，對慶大霉素生物合成途徑的研究，具有重要的生物學意義。對開發(fā)氨基寡糖藥物，具有現(xiàn)實意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是慶大霉素X2的化學結構。
[0022]圖2是genB3敲除方案示意圖。
[0023]圖3是穿梭質粒pFU503及其酶切電泳驗證圖。(M1:DL5000 DNA Marker、1:EcoR
I/Xba I 酶切結果、2 =EcoR I /XhoI 酶切結果、3:XhoI/Xba I 酶切結果、M2: λ -EcoT14 Idigest DNA Marker)。
[0024]圖4是供》似基因同源重組及雙交換原理圖。(1:雙交換菌株GKB3226 PCR產(chǎn)物、2:出發(fā)菌株GKlOl PCR產(chǎn)物、M1:DL5000 DNA Marker)。1:質粒游離存在；I1:染色體片段；II1:染色體回復突變；IV:染色體雙交換
圖5出發(fā)菌株GKllOl與工程菌GKB3226代謝產(chǎn)物的MS圖譜(GK1101為出發(fā)菌株，450.2為慶大霉素Cla，464.3為慶大霉素C2b ；GKB3226為工程菌，483.2為慶大霉素X2。 【具體實施方式】
[0025]實施例1:
1.穿梭質粒PFU503的構建
根據(jù)本實驗室構建的慶大霉素生物合成基因簇序列(GenBank Accession NumberJQ975418)，利用Verctor NTI 11.5軟件，分別在供》似基因上下游擴增交換臂，設計兩對引物，分別命名 P21/P22、P23/P24。P21 (5' - GAATTC CGTGTACGTCCCCTGAATCC-3'，EcoRO, P22 (5 ; - CTCGAGGGGAGATCCTGACCAGTGAG -3 ; , XholO, P23 (5 ; - CTCGAGTACAACAGCTCCGGCGAGAT-3 ; , XholO ,?2A (5 ; - TCTAGA TACGTCAACGTGCACGGGGT-3 ;，Xba I )。提取絳紅色小單孢菌染色體DNA，以染色體DNA為模板，利用引物P21/P22，擴增上游交換臂JHB1，長度為2141bp。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA試劑盒回收，克隆至pMD19-T，得到陽性克隆子，命名為PFU501 ;利用引物P23/P24，擴增下游交換臂JHB2，長度為2289bp。PCR擴增產(chǎn)物同樣經(jīng)DNA試劑盒回收，克隆至pMD19-T，得到陽性克隆子，命名為pFU502。質粒PFU501 (需提供來源)通過I /Xhol I )雙酶(需提供來源)切，回收2141bp片段；質粒pFU502 (需提供來源)經(jīng)OXo7 I /Xba I )雙酶切，回收2289bp片段；與此同時，pKC1139經(jīng)(&01? I /Xba I)雙酶切，回收大片段；將交換臂JHB1、JHB2和pKC1139三個片段混合，酶連。將酶產(chǎn)物轉化大腸桿菌toplO感受態(tài)細胞，挑取抗性菌落于LB培養(yǎng)液中過夜擴增培養(yǎng)，提取得到陽性克隆子，命名為PFU503。PFU503通過三種不同的限制性內(nèi)切酶酶切:BcoR I /Xba I 雙酶切得到 6446bp 和 4442bp，&oR I /ZAoI 雙酶切得到 2147bp、1669bp、7072bp，油a I/Xhol雙酶切得到4777bp、3816bp、2295bp，其酶切電泳驗證結果見圖3，證明質粒pFU503與預測吻合。穿梭質粒PFU503上含有敲除了供》似基因中998個堿基對的AgenB3序列和安普霉素抗性基因(圖3)。穿梭載體pFU503構建完畢。
[0026]2.穿梭質粒pFU503導入絳紅小單孢菌GKllOl將穿梭質粒PFU503轉入萬.co7i ET12567 (pUZ8002)中，得到供體菌^:co7i ET12567(PUZ8002，pDB303)。然后通過結合轉移的方法，轉化絳紅小單孢菌GK1101，37°C培養(yǎng)IOh后，用安普霉素和萘啶酸(終濃度分別為50 μ g / mL和25yg / mL)水溶液覆蓋，37°C繼續(xù)培養(yǎng)，直至長出轉化子；將所獲得的安普霉素抗性轉化子，在含有安普霉素(50μ g / mL)的斜面培養(yǎng)基上，于37°C條件下反復培養(yǎng)，直至徹底消除游離質粒。隨機挑取一株命名為絳紅小單孢菌GKB32。經(jīng)提取染色體DNA，PCR檢測，DNA測序，確定為單交換突變株。
[0027]3.篩選雙交換菌株
將表型為安普霉素抗性的單交換突變株:絳紅小單孢菌GKB32，轉接到不添加安普霉素的平板上，連續(xù)松弛培養(yǎng)三代以上，分離單菌落，挑取單菌落分別影印到不含安普霉素和含安普霉素(安普霉素50 μ g/mL)的平板上，進行敏感性鑒別培養(yǎng)，結果從2660多株中，篩選到6個安普霉素敏感菌株。設計雙交換驗證引物P25/P26(P25:GCCTCCTTGGTCGGGTTGAA，P26:TTCTCGGCGATGATCGAGTC)，對安普霉素敏感型菌株進行檢測，從中得到I株表型符合雙交換菌株的突變株，命名為絳紅小單孢菌GKB3226，雙交換菌株原理見圖4。雙交換檢測的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測和DNA序列，與預測的雙交換突變結果相吻合，證明絳紅小單孢菌GKB3226為敲除了職/7似基因的雙交換工程菌。
[0028]對雙交換菌株GKB3226進行發(fā)酵，去除菌絲渣，收集發(fā)酵液。提取濾液中的代謝產(chǎn)物，通過MS定性檢測，結果顯示:產(chǎn)物的主峰為483 [M+H]+，其分子量與慶大霉素X2的482吻合，而161.75,242.13,322.19為其II級和III級離子碎片峰，質譜圖見圖5。
[0029]實施例2:
絳紅色小單孢菌GKB3226代謝產(chǎn)物的制備
1.絳紅色小單孢菌GKB3226菌株的發(fā)酵培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基:葡萄糖0.1%，玉米`淀粉1.0%，玉米粉1.5%，蛋白胨0.2%，黃豆餅粉1.0%，KNO3 0.05%, CaCO3 0.5%, ρΗ7.0。
[0030]發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米淀粉6.0%，玉米粉1.0%，蛋白胨0.4%，黃豆餅粉2.0 %，KNO3
0.01%, (NH4)2SO4 0.1%，CaCO3 0.5%,淀粉酶 0.025%, ρΗ7.5。
[0031]將實例I中步驟3獲得的絳紅色小單孢菌GKB3226，發(fā)酵前先用稀釋平板法分離出產(chǎn)孢豐富的單菌落，轉接于斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)10天，挖塊接種于種子培養(yǎng)基(裝量為50mL / 250mL三角瓶)，37°C搖床培養(yǎng)36 h (轉速為250rpm)。按10%接種量轉種于發(fā)酵培養(yǎng)基(裝量為50mL/250mL三角瓶)，37°C發(fā)酵培養(yǎng)120 h(轉速為250rpm)。
[0032]20000升發(fā)酵罐培養(yǎng)，攪拌轉速180轉/分鐘，通氣量1:0.5~1.0 (M3 /M3 *min)，培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度，接種量比例，發(fā)酵時間等類同于搖瓶發(fā)酵。
[0033]2代謝產(chǎn)物提取精制 A、粗提
發(fā)酵液稀釋后分別酸化、堿化，過濾除蛋白和菌絲渣后，用732樹脂靜態(tài)吸附61小時。收集吸附飽和樹脂，用0.5M HCl溶液酸洗飽和樹脂，再用無離子水洗滌至中性，而后用
0.01%氨水進行堿洗，當流出液達pH 9.0以上時，串聯(lián)到等體積的711樹脂柱上，收集樹脫液。
[0034]B、精制、結晶
洗脫液經(jīng)薄膜濃縮到約300000ug/mL，用12當量濃硫酸調(diào)至pH5.5飛.0.活性炭脫色到透光度達92%以上，在攪拌下，緩慢向濃縮液中滴加入95%以上乙醇，進行結晶，時間3—4小時，之后經(jīng)液固分離，85%乙醇溶液淋洗，得濕成品。濕成品真空干燥(真空度500mmHg以上，溫度60°C，干燥6小時)，即得慶大霉素X2成品，收率80%以上。
[0035]C、代謝產(chǎn)物質譜分析
絳紅色小單孢菌GKB3226的代謝產(chǎn)物經(jīng)安捷倫質譜儀分析，結果見圖5。圖5-GK1101中450.3和464.3的峰，對應的組分依次是慶大霉素Cla和C2b ；圖5-GB3226中483.2的峰，對應的是慶大霉素X2，而161.75,242.13,322.19的峰，是慶大霉素X2的II級和III級離子碎片峰。因此，從圖5中的GKllOl (上)和GB3226 (下)比較可以看出，工程菌絳紅色小單孢菌GKB3226主要合成慶大霉素X2，是一株生物合成組分高度單一的工程菌，非常適合于產(chǎn)業(yè)化。
[0036]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋`范圍。
【權利要求】
1.一種生物合成慶大霉素X2工程菌，其特征在于:所述的工程菌為絳紅色小單孢菌，該菌株被命名為絳紅色小單抱菌purpurea) GKB3226,已于2013年12月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保蕆，其保藏編號為CGMCCN0.8597。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種生物合成慶大霉素X2工程菌，其特征在于:工程化慶大霉素生物合成菌株絳紅色小單孢菌，包括棘孢小單孢菌，迫使慶大霉素生物合成停止在慶大霉素X2位點，不再進一步修飾，形成其它慶大霉素混合物，大量積累慶大霉素X2。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種生物合成慶大霉素X2工程菌，其特征在于:在已敲除職af基因的絳紅色小單孢菌GKl 101基礎上，進一步敲除genB3基因。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種生物合成慶大霉素X2工程菌，其特征在于:敲除genB3基因的關鍵序列，以達到喪失該基因功能為最終目的。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種生物合成慶大霉素X2工程菌，其特征在于:基因工程菌的構建方法，主要包括以下步驟: A.同源重組質粒pFU503的構建； B.同源重組質粒pFU503導入絳紅色小單孢菌GKllOl； C.接合子的篩選； D.工程菌組分的鑒定。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種生物合成慶大霉素X2工程菌，其特征在于:利用所述的基因敲除方法，經(jīng)PCR分別獲得供《似基`因上下游大約2000bp的兩個片段，作為交換臂，將兩者同時連接到PKC1139中，得到同源重組質粒PFU503。
7.根據(jù)權利要求5所述的一種生物合成慶大霉素X2工程菌，其特征在于:轉化是以萬co7iET12657/pUZ8002介導的結合轉移方法。
8.根據(jù)權利要求5所述的一種生物合成慶大霉素X2工程菌，其特征在于:借助抗性標記，篩選雙交換工程菌，刪除特定DNA序列，獲得經(jīng)生物合成且積累慶大霉素X2的工程菌。
9.一種如權利要求1所述的生物合成慶大霉素X2工程菌，在抗生素藥物制備中的應用。
【文檔編號】C12P19/50GK103820362SQ201410030147
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權日:2014年1月23日
【發(fā)明者】洪文榮, 張熠, 林強 申請人:福州大學, 福州市鼓樓區(qū)榮德生物科技有限公司