一種二化螟細胞的原代培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種二化螟細胞的原代培養(yǎng)方法。包括如下步驟：（1）將二化螟幼蟲浸沒在乙醇溶液中，表面消毒，清洗吹干蟲體；（2）將蟲體置于解剖蠟盤中，解剖二化螟，取出需要建立細胞系的組織或器官，清洗；（3）置于預(yù)先盛有細胞培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，過夜后，待組織或器官貼壁后，再加入細胞培養(yǎng)液；（4）每隔幾天吸出和換入細胞培養(yǎng)液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養(yǎng)瓶；（5）把含有新增殖出的單個細胞，連同全部的細胞培養(yǎng)液吸出放入新培養(yǎng)瓶中，將兩個培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞系建立初步成功。本發(fā)明有助于在離體條件下研究二化螟，為其防治途徑的研究和開發(fā)提供幫助。
【專利說明】一種二化螟細胞的原代培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及屬于昆蟲細胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種二化螟細胞的原代培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生命科學(xué)的迅猛發(fā)展，在生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】中，細胞工程已愈來愈受到重視。培養(yǎng)昆蟲細胞作為研究材料，一直是細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和生物化學(xué)以及昆蟲毒理學(xué)等科學(xué)研究的重要方面。
[0003]自從Grace在1962年首次建立天蠶蛾細胞系以來，昆蟲細胞培養(yǎng)技術(shù)得到了迅速發(fā)展，目前已建立了 800多株昆蟲細胞系，主要集中于鱗翅目、雙翅目(潘李珍等，1980，1989 ;曾慶韜等，1998)、鞘翅目(Lynn et al., 1995; Iwabuchi, 1999; Stiles,1992)、直翅目(Heinandez-Crespo et al., 2000)、膜翅目、同翅目和半翅目等,其中大部分來自鱗翅目和雙翅目，來源于其他目的昆蟲細胞系僅占1/10左右(張寰等，2007 )。昆蟲細胞系的建立，不但促進了昆蟲生物學(xué)方面的基礎(chǔ)研究，也大大促進了基于昆蟲細胞的應(yīng)用性研究。其中，昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)(BEVS)是當(dāng)今最具高效的真核表達系統(tǒng)，已廣泛應(yīng)用于干擾素等外源基因的表達。
[0004]在所建立的昆蟲細胞系中，研究和應(yīng)用最多的是黑腹果蠅iDrosophila
S2 細胞系、粉紋夜蛾/?i)的 BT1-Tn-5B1_4 (High Five)細胞系和草地貪夜蛾/r^§7>6?r￡/a)Sf21細胞系及其克隆株Sf9等。相對于已知的上百萬種昆蟲以及昆蟲細胞系的廣泛用途來`說，已經(jīng)建立的細胞系還遠遠不夠，仍需要建立更多的昆蟲細胞系以滿足實際需要。
[0005]二化螟suppressalis (Walker)屬鱗翅目，螟蛾科,是我國水稻上危害最為嚴(yán)重的常發(fā)性害蟲之一，在分蘗期受害造成枯鞘、枯心苗，在穗期受害造成蟲傷株和白穗，一般年份減產(chǎn)3%~5%，嚴(yán)重時減產(chǎn)在3成以上。除危害水稻外，二化螟還危害玉米、甘蔗、粟、蠶豆、茭白、高粱、油菜、小麥、紫云英等作物。二化螟有很強的適應(yīng)能力，能快速適應(yīng)不利環(huán)境(如抗性品種和殺蟲劑)，其致害性能快速變異。在二化螟的防治過程中，新型生物農(nóng)藥的篩選和鑒定日益成為研究重點。生物農(nóng)藥的活動生物測定需要大量發(fā)育一致的二化螟試蟲，對飼養(yǎng)場地要嚴(yán)格的要求，工作量大，而若有離體培養(yǎng)的二化螟細胞，則可以在離體條件下研究生物農(nóng)藥對二化螟的作用，從而有助于在細胞水平研究殺蟲劑對二化螟的作用機制，有助于當(dāng)前殺蟲劑的改進和新殺蟲劑的發(fā)明。目前，關(guān)于二化螟細胞的體外培養(yǎng)技術(shù)及二化螟細胞系，還未見報道。因此，通過本發(fā)明，建立二化螟細胞系，不僅能增加我國新昆蟲細胞系的數(shù)量及種類，還能為日后該類昆蟲細胞系的建立提供借鑒經(jīng)驗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種二化螟細胞的原代培養(yǎng)方法。
[0007]二化螟細胞的原代培養(yǎng)方法的步驟如下:(1)在無菌條件下，將二化螟幼蟲浸沒在70%或75%乙醇溶液中，進行表面消毒10~20分鐘，用無菌蒸餾水清洗二化螟幼蟲3~5次，用無菌濾紙吸干蟲體或用吹風(fēng)機吹干蟲體；
(2)將蟲體置于用70%或75%乙醇消毒過的解剖蠟盤中，用解剖針將頭尾固定，解剖二化螟，取出需要建立細胞系的組織或器官，將組織或器官放入盛有HBSS清洗液的培養(yǎng)皿中，清洗2~3次，然后再用細胞培養(yǎng)液清洗組織或器官；
(3)將清洗過的組織或器官置于預(yù)先盛有0.5mL~ImL細胞培養(yǎng)液的T-25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，放入27°C無光照的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，過夜后，待組織或器官貼壁后，再加入2mL細胞培養(yǎng)液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養(yǎng)液中；
(4)每隔7~10天吸出和換入50%~70%量的細胞培養(yǎng)液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養(yǎng)瓶；
(5)把含有新增殖出的單個細胞，連同全部的細胞培養(yǎng)液吸出放入新培養(yǎng)瓶中，加入新的細胞細胞培養(yǎng)液，而原含有組織塊的培養(yǎng)瓶中再加入同吸出量同樣多的新的細胞細胞培養(yǎng)液，將兩個培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞系建立初步成功。
[0008]所述的細胞培養(yǎng)液是昆蟲細胞培養(yǎng)液與青霉素、鏈霉素、兩性霉素B和動物血清的混合物，PH值為6.0-6.8。所述的昆蟲細胞培養(yǎng)液選自TNM-FH，所述的動物血清為胎牛血清。所述的青霉素含量為200U/ml,鏈霉素含量為0.2 μ g /ml,兩性霉素B含量為0.5 μ g/ml ο所述的動物血清體積比含量為10-20%。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:采用上述方案，對二化螟多種組織進行了原代培養(yǎng)，取得了較好的培養(yǎng)效果。本發(fā)明快速、有效、重復(fù)性強，是對鱗翅目昆蟲細胞培養(yǎng)的重要補充。二化螟為水稻重要害蟲，本發(fā)明有 助于在離體條件下研究二化螟，為其防治途徑的研究和新型生物農(nóng)藥的開發(fā)提供幫助。
[0010]【專利附圖】

【附圖說明】圖1是培養(yǎng)24小時后脂肪體細胞的培養(yǎng)形態(tài)圖；
圖2是培養(yǎng)15天后脂肪體細胞的培養(yǎng)形態(tài)圖；
圖3是培養(yǎng)30天后脂肪體細胞的培養(yǎng)形態(tài)圖；
圖4是培養(yǎng)2天后血淋巴細胞的培養(yǎng)形態(tài)圖；
圖5是培養(yǎng)16天后血淋巴細胞的培養(yǎng)形態(tài)圖；
圖6是培養(yǎng)30天后血淋巴細胞的培養(yǎng)形態(tài)圖。
【具體實施方式】
[0011]二化螟細胞的原代培養(yǎng)方法的步驟如下:
(1)在無菌條件下，將二化螟幼蟲浸沒在70%或75%乙醇溶液中，進行表面消毒10~20分鐘，用無菌蒸餾水清洗二化螟幼蟲3~5次，用無菌濾紙吸干蟲體或用吹風(fēng)機吹干蟲體；
(2)將蟲體置于用70%或75%乙醇消毒過的解剖蠟盤中，用解剖針將頭尾固定，解剖二化螟，取出需要建立細胞系的組織或器官，將組織或器官放入盛有HBSS清洗液的培養(yǎng)皿中，清洗2~3次，然后再用細胞培養(yǎng)液清洗組織或器官；
(3)將清洗過的組織或器官置于預(yù)先盛有0.5mL~ImL細胞培養(yǎng)液的T-25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，放入27°C無光照的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，過夜后，待組織或器官貼壁后，再加入2mL細胞培養(yǎng)液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養(yǎng)液中；
(4)每隔7~10天吸出和換入50%~70%量的細胞培養(yǎng)液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養(yǎng)瓶；
(5)把含有新增殖出的單個細胞，連同全部的細胞培養(yǎng)液吸出放入新培養(yǎng)瓶中，加入新的細胞細胞培養(yǎng)液，而原含有組織塊的培養(yǎng)瓶中再加入同吸出量同樣多的新的細胞細胞培養(yǎng)液，將兩個培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞系建立初步成功。
[0012]所述的細胞培養(yǎng)液是昆蟲細胞培養(yǎng)液與青霉素、鏈霉素、兩性霉素B和動物血清的混合物，PH值為6.0-6.8。所述的昆蟲細胞培養(yǎng)液選自TNM-FH，所述的動物血清為胎牛血清。所述的青霉素含量為200U/ml,鏈霉素含量為0.2 μ g /ml,兩性霉素B含量為0.5 μ g/ml ο所述的動物血清體積比含量為10-20%。
[0013]以下結(jié)合實例對本發(fā)明作進一步的詳細說明:
實施例1
二化螟幼蟲脂肪體細胞的原代培養(yǎng) 經(jīng)過下列步驟:
(1)在無菌操作臺內(nèi)(以下操作都在無菌條件下，所使用器具都要經(jīng)過滅菌或消毒處理)將二化螟老熟幼蟲I頭浸沒在70%的乙醇溶液中10分鐘，進行表面消毒，用無菌蒸餾水清洗二化螟老熟幼蟲3次，用無菌濾紙吸干二化螟老熟幼蟲體或用吹風(fēng)機吹干二化螟老熟幼蟲體；
(2)將吹干二化螟老熟幼蟲體置于用70%消毒過的解剖蠟盤中，用解剖針將頭尾固定，用消毒解剖剪從背部剪開二化螟，再用解剖針將蟲體固定住，用彎頭鑷子取出脂肪體組織，操作時盡量保持其完整，注意不能觸破昆蟲的消化道等同體外直接相連的部分；` (3)將脂肪體放入盛有HBSS清洗液(含200U/ml的青霉素，0.2 μ g /ml的鏈霉素，
0.5 μ g /ml的兩性霉素B)的培養(yǎng)皿中，用HBSS清洗液清洗脂肪體2次，然后再用細胞培養(yǎng)液清洗脂肪體I次；
(4)將清洗過的脂肪體置于預(yù)先盛有0.5mL細胞培養(yǎng)液的T-25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，放入27°C無光照的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，過夜后，待脂肪體貼壁后，再加入2mL細胞培養(yǎng)液，使脂肪體大部分浸沒在該培養(yǎng)液中，注意在加液的時候勿使脂肪體懸浮在細胞培養(yǎng)液中；
(5)每隔7天吸出50%量的細胞培養(yǎng)液，并同時換入吸出量的新的培養(yǎng)液，在上述操作后24小時后可觀察到組織塊在離體并在上述培養(yǎng)條件下，很快從其周圍游離出大量單個的細胞(見圖1);第15天后見到細胞不斷增值并逐漸充滿整個培養(yǎng)瓶(見圖2);第30天后，增殖細胞充滿整個培養(yǎng)瓶(見圖3)，把含有新增值的細胞，連同全部的細胞培養(yǎng)液吸出放入新培養(yǎng)瓶中，并加入2mL新的細胞培養(yǎng)液，而原含有組織塊的培養(yǎng)瓶中再加入同吸出量同樣多的新的細胞培養(yǎng)液。兩個培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，標(biāo)志著原代培養(yǎng)成功，細胞開始傳代。二化螟幼蟲脂肪體細胞系初步建立成功。
[0014]實施例2
二化螟幼蟲血淋巴細胞的原代培養(yǎng)
(1)在無菌操作臺內(nèi)(以下操作都在無菌條件下，所使用器具都要經(jīng)過滅菌或消毒處理)將二化螟老熟幼蟲I頭浸沒在75%的乙醇溶液中20分鐘，進行表面，用無菌蒸餾水清洗二化螟老熟幼蟲5次，用無菌濾紙吸干二化螟老熟幼蟲體或用吹風(fēng)機吹干二化螟老熟幼蟲體；
(2)將吹干二化螟老熟幼蟲體置于用75%消毒過的解剖蠟盤中，用解剖針將頭尾固定，用消毒解剖剪從背部剪開二化螟，用20 μ L移液器吸取血淋巴放入裝有HBSS清洗液(含200U/ml的青霉素，0.2 μ g /ml的鏈霉素，0.5 μ g /ml的兩性霉素B)的培養(yǎng)瓶中，擰緊蓋子，靜止放置15分鐘。注意不能觸破昆蟲的消化道等同體外直接相連的部分；
(3)待血淋巴細胞貼壁后，用移液器吸除HBSS清洗液，加入新鮮的HBSS清洗液，重復(fù)3次，以防止黑化現(xiàn)象的發(fā)生，在第3次吸除HBSS清洗液后，加入2mL細胞培養(yǎng)液，擰緊瓶蓋，將培養(yǎng)瓶放入27°C無光照的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(4)每隔10天吸出70%量的細胞培養(yǎng)液，并同時換入吸出量的新的培養(yǎng)液。
[0015](5)在上述操作后2天后可觀察到大量增殖的單個細胞(見圖4)并逐漸向外圍擴展；第16天后見到細胞不斷拉絲生長，增值并充滿整個培養(yǎng)瓶(見圖5);第30天后見到增殖細胞充滿整個培養(yǎng)瓶(見圖6);把含有新增值的細胞，連同全部的細胞培養(yǎng)液吸出放入新培養(yǎng)瓶中，按照1:5 (細胞體積:最后培養(yǎng)液體積)進行傳代培養(yǎng)。二化螟幼蟲血淋巴細胞系初步建 立成功。
【權(quán)利要求】
1.一種二化螟細胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)在無菌條件下，將二化螟幼蟲浸沒在70%或75%乙醇溶液中，進行表面消毒10~20分鐘，用無菌蒸餾水清洗二化螟幼蟲3~5次，用無菌濾紙吸干蟲體或用吹風(fēng)機吹干蟲體； (2)將蟲體置于用70%或75%乙醇消毒過的解剖蠟盤中，用解剖針將頭尾固定，解剖二化螟，取出需要建立細胞系的組織或器官，將組織或器官放入盛有HBSS清洗液的培養(yǎng)皿中，清洗2~3次，然后再用細胞培養(yǎng)液清洗組織或器官； (3)將清洗過的組織或器官置于預(yù)先盛有0.5mL~ImL細胞培養(yǎng)液的T-25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，放入27°C無光照的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，過夜后，待組織或器官貼壁后，再加入2mL細胞培養(yǎng)液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養(yǎng)液中； (4)每隔7~10天吸出和換入50%~70%量的細胞培養(yǎng)液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養(yǎng)瓶； (5)把含有新增殖出的單個細胞，連同全部的細胞培養(yǎng)液吸出放入新培養(yǎng)瓶中，加入新的細胞細胞培養(yǎng)液，而原含有組織塊的培養(yǎng)瓶中再加入同吸出量同樣多的新的細胞細胞培養(yǎng)液，將兩個培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞系建立初步成功。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細胞培養(yǎng)液是昆蟲細胞培養(yǎng)液與青霉素、鏈霉素、兩性霉素B和動物血清的混合物，pH值為6.0-6.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的昆蟲細胞培養(yǎng)液選自TNM-FH，所述的動物血清為胎牛血清。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的青霉素含量為200U/ml，鏈霉素含量為0.2 μ g /ml,兩性霉素B含量為0.5 μ g /ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法``，其特征在于，所述的動物血清體積比含量為10-20%。
【文檔編號】C12N5/07GK103820381SQ201410030210
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】俞曉平, 劉光富, 許益鵬 申請人:中國計量學(xué)院