一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)及其制備和用于藥物篩選的方法
【專利摘要】一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)及其制備和用于藥物篩選的方法，涉及一種基于復(fù)合多噴頭三維打印技術(shù)的仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)及其制備。該仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)包括高分子外殼、分支血管支架、功能組織區(qū)、血管組織區(qū)和高分子隔離層。功能組織區(qū)為含組織細(xì)胞的水凝膠層；血管組織區(qū)為含血管種子細(xì)胞的水凝膠層；功能組織區(qū)和血管組織區(qū)在空間交替排列；高分子隔離層間隔排布在功能組織區(qū)和血管組織區(qū)內(nèi)，并將功能組織區(qū)和血管組織區(qū)分成多個(gè)小區(qū)域；分支血管支架包括動(dòng)脈血管和靜脈血管兩部分。本發(fā)明通過(guò)復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)制備帶分支血管的組織器官仿生結(jié)構(gòu)；水凝膠結(jié)構(gòu)不必交聯(lián)或聚合；最大限度的模擬了體內(nèi)血管化組織和血管的狀態(tài)，為血管化的器官組織提供了借鑒。
【專利說(shuō)明】一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)及其制備和用于藥物篩選的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體到生物或酶、其組合物領(lǐng)域，涉及一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)及其制備和用于藥物篩選的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，隨著學(xué)科間的交流聯(lián)系日益緊密，細(xì)胞排列技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，為組織工程、器官制造和藥物篩選奠定了工程基礎(chǔ)。其中突出的三維打印技術(shù)，也叫快速成形(Rapid Prototyping, RP)技術(shù)，利用計(jì)算機(jī)輔助建模和離散-堆積的原理加工材料[Fedorovich NE, et al.Trends in biotechnology, 2011; 29 (12):601-606] ? 該技術(shù)可將生物材料精確定位，在復(fù)雜器官的體外組裝領(lǐng)域受到高度重視。體外成形的組織或器官用途廣泛，可用于研究維持器官正常形態(tài)的基理[Griffith LG, et al.Nature ReviewsMolecular Cell Biology, 2006; 7 (3): 211-224]、癌細(xì)胞規(guī)避化療等治療措施[YamadaKM, et al.Cell, 2007; 130(4):601-610]、病變器官的移植[Griffith LG, et al.ScienceSignaling, 2002; 295 (5557): 1009]以及藥物篩選。國(guó)外許多科研組已完成多種RP技術(shù)的改造，以實(shí)現(xiàn)基于數(shù)控的含細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體的組裝或打印。國(guó)內(nèi)清華大學(xué)機(jī)械工程系器官制造中心(Center of Organ Manufacturing)在開(kāi)發(fā)出了一系列快速成型設(shè)備，并利用這些設(shè)備成功制備出了簡(jiǎn)單的血管網(wǎng)、肝臟組織和骨修復(fù)材料等[Wang XH, etal.Trends in Biotechnology, 2007;25:505; Wang XH, et al.Tissue Engineering PartB, 2010; 16:189; Wang XH.Artificial organs, 2012; 36:591] ? 組裝后的細(xì)胞 / 基質(zhì)材料三維結(jié)構(gòu)一般需要交聯(lián)或聚合天然高分子材料保持三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。
[0003]從上世紀(jì)90年代以來(lái)，新藥`的開(kāi)發(fā)主要通過(guò)基于分子和細(xì)胞水平的生物信息檢測(cè)平臺(tái)完成，主要利用體外平面二維培養(yǎng)的單種細(xì)胞。然而，二維平面培養(yǎng)不能完全模擬人體相應(yīng)多細(xì)胞(至少三種)組織的真實(shí)生活三維環(huán)境。采用二維培養(yǎng)細(xì)胞為靶細(xì)胞篩選出來(lái)的藥物絕大多數(shù)在動(dòng)物體內(nèi)沒(méi)有活性[Kang XH, et al.TissueEngineering, 2005; 11:456-458]。近年隨著生物研究的微尺度化，生物學(xué)家們?cè)絹?lái)越多的發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生存的各項(xiàng)指標(biāo)如氧氣濃度、生存溫度都對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)有著至關(guān)重要的影響，這也使得人體組織的體外模擬和培養(yǎng)格外具有挑戰(zhàn)性。組合化學(xué)、基因組學(xué)的發(fā)展使得可用于篩選的化合物或藥物種類急劇增長(zhǎng)，迫使藥物篩選的通量需要與時(shí)俱進(jìn)的發(fā)展，以往的驗(yàn)證性方法變得不再適用，高通量藥物篩選(High throughput Screening, HTS)因此被提出并迅速推廣[Rodrigues AD.Pharmaceutical research, 1997;4(11): 1504-1510]。但HTS技術(shù)采用單種細(xì)胞的二維培養(yǎng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能不完整，該技術(shù)確定的先導(dǎo)化合物并不具后續(xù)預(yù)期藥理活性。采用一種新的更符合人體結(jié)構(gòu)學(xué)的成功率高的藥物篩選模型——高內(nèi)涵篩選(High Content Screening, HCS)技術(shù)確定先導(dǎo)化合物成為藥物研究領(lǐng)域的共識(shí)。細(xì)胞需要整合來(lái)自DNA、RNA、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和離子等各種物質(zhì)的提供信息，并表現(xiàn)相應(yīng)特征；而離子、代謝產(chǎn)物、大分子和細(xì)胞器在時(shí)間和空間上的相互作用是生物體實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生命功能的基礎(chǔ)。因此，要想更加清晰的理解挑選出的靶點(diǎn)在細(xì)胞功能中所扮演的角色，就需要一個(gè)能夠自動(dòng)提取靶點(diǎn)在細(xì)胞中傳達(dá)出的信息的工具，而這個(gè)工具，便是HCS技術(shù)[Giuliano KA, et al.Assay and drug development technologies, 2003;I(4):565-577]。相對(duì)于HTS技術(shù)，HCS技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)選擇。HCS使用熒光標(biāo)記的抗體、DNA探針、生物配體或者生物反應(yīng)器等手段收集靶點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)的對(duì)細(xì)胞形態(tài)變化、生長(zhǎng)、分化、凋亡等各個(gè)環(huán)節(jié)的影響，可在一次試驗(yàn)中獲取關(guān)于細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)等各個(gè)組分的大量信息。相對(duì)于以孔板為單位的HCS技術(shù)，HTS篩選結(jié)果更準(zhǔn)確，更具生物學(xué)意義。
[0004]專利(申請(qǐng)?zhí)?00910079726.8)涉及一種基于分區(qū)的血管化脂肪組織及其構(gòu)建方法，將脂肪粒包裹在微囊中，得到具有貫通結(jié)構(gòu)的三維脂肪組織結(jié)構(gòu)體，結(jié)構(gòu)體主要為脂肪區(qū)和血管區(qū)域。但該方法需要大量的交聯(lián)劑(如CaCl2),會(huì)損害細(xì)胞活性；該方法的藥物主要通過(guò)微囊釋放，藥效不易作用到整個(gè)結(jié)構(gòu)體。專利(申請(qǐng)?zhí)?00910155794.8)涉及一種糖尿病治療藥物的高內(nèi)涵篩選方法，通過(guò)快速成形技術(shù)得到含細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)體，并對(duì)含胰島細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行藥物篩選。但該方法并未含血管分支系統(tǒng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞僅分布于水凝膠表面。該方法也需要大量的交聯(lián)劑來(lái)穩(wěn)定成形體。
[0005]現(xiàn)有的組織工程細(xì)胞/支架復(fù)合結(jié)構(gòu)體能夠在體外一定維度上表示出組織或器官的特性，但并不能完全模擬含血管系統(tǒng)的多細(xì)胞的真實(shí)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所使用的水凝膠材料可不必交聯(lián)，因?yàn)楦叻肿痈綦x層和外殼已經(jīng)為結(jié)構(gòu)體提供力學(xué)支撐；隔離層和外殼在可為宏(微)觀多孔結(jié)構(gòu)，保證了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換；三維的血管化組織極大程度模擬了體內(nèi)環(huán)境；分支血管結(jié)構(gòu)可與體內(nèi)外循環(huán)系統(tǒng)連接，便于HCS藥物篩選。這些因素促使我們利用復(fù)合多噴頭三維打印技術(shù)制備含分支血管的個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)來(lái)模擬體內(nèi)器官的狀態(tài)并將其用于藥物篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)及其制備和用于藥物篩選的方法，使其更好模擬體內(nèi)的動(dòng)脈血管和靜脈血管狀態(tài)，結(jié)構(gòu)體不需交聯(lián)，結(jié)構(gòu)體內(nèi)的細(xì)胞密度能夠很高，本發(fā)明可作為仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)來(lái)模擬體內(nèi)血管化組織的狀態(tài)，進(jìn)而用于藥物篩選。
`[0007]一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)包括高分子外殼、分支血管支架、功能組織區(qū)、血管組織區(qū)和高分子隔離層；所述的功能組織區(qū)為含組織細(xì)胞的水凝膠層；所述的血管組織區(qū)為含血管種子細(xì)胞的水凝膠層；所述功能組織區(qū)和血管組織區(qū)在空間交替排列；所述的高分子隔離層間隔排布在功能組織區(qū)和血管組織區(qū)內(nèi)，并將功能組織區(qū)和血管組織區(qū)分成多個(gè)小區(qū)域；所述分支血管支架包括動(dòng)脈血管和靜脈血管兩部分，動(dòng)脈血管含至少一個(gè)入口和若干個(gè)分支，靜脈血管含至少一個(gè)出口和若干個(gè)分支；所述的分支血管支架采用合成高分子材料，分支血管支架貫穿于高分子外殼、功能組織區(qū)、血管組織區(qū)和高分子隔離層之間；所述的高分子外殼采用天然高分子或合成高分子材料。
[0008]上述技術(shù)方案中，所述分支血管支架的內(nèi)徑為10 μ m~IOmm,壁厚為100 μ m~2mm ;所述高分子隔離層及高分子外殼的層厚為0.1 μ m~2mm。
[0009]本發(fā)明所述功能組織區(qū)的含組織細(xì)胞的水凝膠層和血管組織區(qū)的含血管種子細(xì)胞的水凝膠層為天然高分子水凝膠，該天然高分子為明膠、海藻酸鈉、纖維蛋白原、膠原、基質(zhì)膠、卡拉膠、殼聚糖、瓊脂、透明質(zhì)酸、基質(zhì)膠、彈性蛋白和層粘素中的至少一種；所述天然高分子水凝膠中復(fù)合有細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝素、瘦素、紫杉醇和黃芪抗癌粉中的至少一種。
[0010]本發(fā)明所述天然聞分子水凝膠的質(zhì)量體積濃度為0.1~40% ;所述血管種子細(xì)胞和組織細(xì)胞的濃度為IXlO3~IXlO8個(gè)/mL;所述功能組織區(qū)的組織細(xì)胞為成體組織細(xì)胞、成體干細(xì)胞和癌細(xì)胞中的一種；所述血管組織區(qū)的血管種子細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的至少一種。
[0011]本發(fā)明提供的一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟:
[0012]I)設(shè)計(jì)分支血管支架三維模型，分兩組分別模仿動(dòng)脈血管和靜脈血管；
[0013]2)將合成高分子材料、配制好的含組織細(xì)胞的水凝膠、配制好的含血管種子細(xì)胞的水凝膠和配制好的合成高分子溶液裝載到復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備的不同噴頭中；
[0014]3)制備分支血管支架:依據(jù)步驟I)的三維模型，利用復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備擠出合成高分子溶液，并凍干去除有機(jī)溶劑，或熔融擠出合成高分子材料，得到分支血管支架；
[0015]4)制備功能組織區(qū):利用復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備逐層打印配制好的含組織細(xì)胞的水凝膠，打印路徑沿分支血管支架，間隔打印，得到初步三維結(jié)構(gòu)體；
[0016]5)制備血管組織區(qū):利用復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備逐層打印，將配制好的含血管種子細(xì)胞的水凝膠填充在初步三維結(jié)構(gòu)體的空隙中，得到中間三維結(jié)構(gòu)體；
[0017]6)制備高分子隔離層和高分子外殼:在步驟4)和步驟5)逐層打印過(guò)程中，在打印一層或若干層后利用復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備噴涂合成高分子溶液并萃取有機(jī)溶劑，或熔融擠出合成高分子材料，形成高分子隔離層，得到含細(xì)胞的水凝膠層和高分子隔離層的交替結(jié)構(gòu)體；在交替結(jié)構(gòu)體外圍噴涂合成高分子溶液并萃取有機(jī)溶劑，或熔融擠出合成高分子材料，形成高分子外殼，得到個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)前體；
[0018]7)對(duì)上述個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)前體提供生長(zhǎng)因子，實(shí)現(xiàn)血管組織區(qū)的血管化，使功能組織區(qū)形成組織，并使血管組織區(qū)和功能組織區(qū)的細(xì)胞產(chǎn)生聯(lián)系，最終得到所述的個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)。
[0019]本發(fā)明所述的制備方法中，所述復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備采用熔融擠出成形技術(shù)或低溫沉積成形技術(shù)來(lái)制備分支血管支架、高分子隔離層和高分子外殼；當(dāng)采用熔融擠出成形技術(shù)制備分支血管支架、高分子隔離層和高分子外殼時(shí)，所述的合成高分子材料為丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚氨酯、聚四氟乙烯和糖類中的至少一種；當(dāng)采用低溫沉積成形技術(shù)制備分支血管支架、高分子隔離層和高分子外殼時(shí)，所述的合成高分子溶液的溶質(zhì)為聚氨酯、聚碳酸酯、聚脲酯、聚乙交酯、聚丁二酸酯、聚醚酯、聚乙二醇、聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚酯和聚羥基酸酯中的至少一種，所述合成高分子溶液的溶劑為四乙二醇或1，4- 二氧六環(huán)。所述合成高分子溶液的質(zhì)量體積濃度為1%~30% ;所述合成高分子溶液中復(fù)合有抗凝血因子，該抗凝血因子為肝素或紫杉醇。
[0020]本發(fā)明提供的一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)用于藥物篩選的方法，其特征在于該方法包括如下步驟:
[0021]I)若功能組織區(qū)的組織細(xì)胞采用成體組織細(xì)胞或成體干細(xì)胞，則對(duì)個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)供給含致病性藥物的培養(yǎng)液，使上述個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)產(chǎn)生病理癥狀；若功能組織區(qū)的組織細(xì)胞采用癌細(xì)胞，則不做致病性處理；
[0022]2)對(duì)個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)供給含不同種類和不同劑量治療性藥物的培養(yǎng)液，實(shí)時(shí)或后續(xù)搜集培養(yǎng)液；
[0023]3)分析上述已收集培養(yǎng)液，得到治療性藥物的種類、劑量對(duì)所述個(gè)性化復(fù)合結(jié)構(gòu)的作用，通過(guò)檢測(cè)、對(duì)比生物學(xué)指標(biāo)，判斷藥物的作用。
[0024]本發(fā)明所述的藥物篩選的方法中，所述生物學(xué)指標(biāo)為糖類脂類代謝指標(biāo)、肝功能指標(biāo)、腎功能指標(biāo)、癌細(xì)胞指標(biāo)和血管化指標(biāo)中的至少一種。所述病理癥狀為糖尿病、器官炎癥、器官衰竭或腫瘤。
[0025]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有以下優(yōu)點(diǎn)及突出性的技術(shù)效果:①本發(fā)明的高分子隔離層將水凝膠層分為若干小區(qū)，形成水凝膠層和高分子隔離層交替排布的結(jié)構(gòu)；高分子隔離層為水凝膠結(jié)構(gòu)提供力學(xué)支撐和生化保護(hù)作用，能夠保證低濃度水凝膠的成形；水凝膠不必交聯(lián)，細(xì)胞密度可足夠大。②本發(fā)明的血管組織區(qū)和功能組織區(qū)的形成細(xì)胞聯(lián)系，間隔交替排布，模擬了體內(nèi)血管化組織和血管的狀態(tài)，為血管化的器官組織提供了借鑒。③本發(fā)明的高分子外殼為內(nèi)部結(jié)構(gòu)提供力學(xué)支撐和生化保護(hù)作用，有利與所述個(gè)性化仿生結(jié)構(gòu)的體內(nèi)體外培養(yǎng)。④本發(fā)明的分支血管支架出口和入口能與體外脈動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)或體內(nèi)血管系統(tǒng)連接。⑤本發(fā)明的藥物篩選的 方法能及時(shí)分析藥物對(duì)個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)的作用，利于對(duì)代謝疾病、器官疾病或癌癥腫瘤的藥物篩選工作。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0027]圖2為分支血管支架的示意圖。
[0028]圖3a和圖3b分別為打印的功能組織區(qū)和血管組織區(qū)的示意圖。
[0029]圖4a和圖4b分別為高分子隔離層與功能組織區(qū)和血管組織區(qū)的交替結(jié)構(gòu)及其爆炸視圖。
[0030]圖中:101 -動(dòng)脈血入口 ； 102 -分支血管支架；103 -功能組織區(qū)；104 -血管組織區(qū)；105 -靜脈血出口； 106 -高分子外殼；401 -高分子隔離層。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
[0032]圖1為個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)示意圖，所述個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)包括高分子外殼106、分支血管支架102、功能組織區(qū)103、血管組織區(qū)104和高分子隔離層401 ;所述的功能組織區(qū)103為含組織細(xì)胞的水凝膠層；所述的血管組織區(qū)104為含血管種子細(xì)胞的水凝膠層；所述功能組織區(qū)103和血管組織區(qū)104在空間交替排列；所述的高分子隔離層401間隔排布在功能組織區(qū)103和血管組織區(qū)104內(nèi)，并將功能組織區(qū)103和血管組織區(qū)104分成多個(gè)小區(qū)域；所述分支血管支架102包括動(dòng)脈血管和靜脈血管兩部分，動(dòng)脈血管含至少一個(gè)入口和若干個(gè)分支，靜脈血管含至少一個(gè)出口和若干個(gè)分支；所述的分支血管支架102采用合成高分子材料，分支血管支架102貫穿于高分子外殼106、功能組織區(qū)103、血管組織區(qū)104和高分子隔離層401之間；所述的高分子外殼106采用天然高分子或合成高分子材料。[0033]所述分支血管支架的內(nèi)徑為10 μ m~IOmm,壁厚為100 μ m~2mm ;所述高分子隔離層及高分子外殼的層厚為0.1ym~2mm。圖2為分支血管支架示意圖，所述功能組織區(qū)的含組織細(xì)胞的水凝膠層和血管組織區(qū)的含血管種子細(xì)胞的水凝膠層為天然高分子水凝膠，該天然高分子為明膠、海藻酸鈉、纖維蛋白原、膠原、基質(zhì)膠、卡拉膠、殼聚糖、瓊脂、透明質(zhì)酸、基質(zhì)膠、彈性蛋白和層粘素中的至少一種；所述天然高分子水凝膠中復(fù)合有細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝素、瘦素、紫杉醇和黃芪抗癌粉中的至少一種。所述天然高分子水凝膠的質(zhì)量體積濃度為0.1~40% ;所述血管種子細(xì)胞和組織細(xì)胞的濃度為I X IO3~I X IO8個(gè)/mL ;所述功能組織區(qū)的組織細(xì)胞為成體組織細(xì)胞、成體干細(xì)胞和癌細(xì)胞中的一種；所述血管組織區(qū)的血管種子細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的至少一種。
[0034]本發(fā)明提供的一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)的制備方法包括以下步驟:1)設(shè)計(jì)分支血管支架三維模型，分兩組分別模仿動(dòng)脈血管和靜脈血管；2)將合成高分子材料、配制好的含組織細(xì)胞的水凝膠、配制好的含血管種子細(xì)胞的水凝膠和配制好的合成高分子溶液裝載到復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備的不同噴頭中；3)制備分支血管支架:依據(jù)步驟I)的三維模型，利用復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備擠出合成高分子溶液，并凍干去除有機(jī)溶劑，或熔融擠出合成高分子材料，得到分支血管支架；4)制備功能組織區(qū):利用復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備逐層打印配制好的含組織細(xì)胞的水凝膠，打印路徑沿分支血管支架，如圖3a所示，間隔打印，得到初步三維結(jié)構(gòu)體；5)制備血管組織區(qū):利用復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備逐層打印，如圖3b所示，將配制好的含血管種子細(xì)胞的水凝膠填充在初步三維結(jié)構(gòu)體的空隙中，得到中間三維結(jié)構(gòu)體；6)制備高分子隔離層和高分子外殼:在步驟4)和步驟5)逐層打印過(guò)程中，在打印一層或若干層后利用復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備噴涂合成高分子溶液并萃取有機(jī)溶劑，或熔融擠出合成高分子材料，形成高分子隔離層，得到含細(xì)胞的水凝膠層和高分子隔離層的交替結(jié)構(gòu)體；在交替結(jié)構(gòu)體外圍噴涂合成高分子溶液并萃取有機(jī)溶劑，或熔融擠出合成高分子材料，形成高分子外殼，得到個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)前體；7)對(duì)上述個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)前體提供生長(zhǎng)因子，實(shí)現(xiàn)血管組織區(qū)的血管化，使功能組織區(qū)形成組織，并使血管組織區(qū)和功能組織區(qū)的細(xì)胞產(chǎn)生聯(lián)系，最終得到所述的個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)。
[0035]本發(fā)所述的制備`方法，所述復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備采用熔融擠出成形技術(shù)或低溫沉積成形技術(shù)來(lái)制備分支血管支架、高分子隔離層和高分子外殼；當(dāng)采用熔融擠出成形技術(shù)制備分支血管支架、高分子隔離層和高分子外殼時(shí)，所述的合成高分子材料為丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚氨酯、聚四氟乙烯和糖類中的至少一種；當(dāng)采用低溫沉積成形技術(shù)制備分支血管支架、高分子隔離層和高分子外殼時(shí)，所述的合成高分子溶液的溶質(zhì)為聚氨酯、聚碳酸酯、聚脲酯、聚乙交酯、聚丁二酸酯、聚醚酯、聚乙二醇、聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚酯和聚羥基酸酯中的至少一種，所述合成高分子溶液的溶劑為四乙二醇或1，4- 二氧六環(huán)。所述合成高分子溶液的質(zhì)量體積濃度為1%~30% ;所述合成高分子溶液中復(fù)合有抗凝血因子，該抗凝血因子為肝素或紫杉醇。
[0036]本發(fā)明提供的一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)用于藥物篩選的方法包括如下步驟:1)若功能組織區(qū)的組織細(xì)胞采用成體組織細(xì)胞或成體干細(xì)胞，則對(duì)個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)供給含致病性藥物的培養(yǎng)液，使上述個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)產(chǎn)生病理癥狀；若功能組織區(qū)的組織細(xì)胞采用癌細(xì)胞，則不做致病性處理；2)對(duì)個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)供給含不同種類和不同劑量治療性藥物的培養(yǎng)液，實(shí)時(shí)或后續(xù)搜集培養(yǎng)液；3)分析上述已收集培養(yǎng)液，得到治療性藥物的種類、劑量對(duì)所述個(gè)性化復(fù)合結(jié)構(gòu)的作用，通過(guò)檢測(cè)、對(duì)比生物學(xué)指標(biāo)，判斷藥物的作用。
[0037]本發(fā)明所述的藥物篩選的方法，所述生物學(xué)指標(biāo)為糖類脂類代謝指標(biāo)、肝功能指標(biāo)、腎功能指標(biāo)、癌細(xì)胞指標(biāo)和血管化指標(biāo)中的至少一種。所述病理癥狀為糖尿病、器官炎癥、器官衰竭或腫瘤。
[0038]下面舉出幾個(gè)具體的實(shí)施例，以進(jìn)一步理解本發(fā)明。
[0039]實(shí)施例1:制備一種個(gè)性化仿生血管化肝組織并將其應(yīng)用于肝炎藥物篩選
[0040]I)含細(xì)胞的水凝膠的制備:提取大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSC)和肝細(xì)胞(Hep)，其中ADSC培養(yǎng)傳代后制備細(xì)胞懸浮液；將天然高分子粉末與(DMEM，dulbecco's modifiedeagle medium)培養(yǎng)液混合，得到質(zhì)量體積濃度為10%的明膠溶液、質(zhì)量體積濃度為2%的海藻酸鈉溶液和質(zhì)量體積濃度為1%的纖維蛋白原溶液，將上述明膠溶液、海藻酸鈉溶液和纖維蛋白原溶液體積比2:2:1混合后得到天然高分子溶液待用；將ADSC和Hep懸浮液離心，分別與天然高分子溶液混合，得到細(xì)胞濃度為I X IO6個(gè)/mL的含ADSC的天然高分子溶液，以及細(xì)胞濃度為3 X IO6個(gè)/mL的含H印的天然高分子溶液。
[0041]2)分支血管支架的制備=Solidworks軟件設(shè)計(jì)分支血管三維模型,經(jīng)分層軟件分析后，通過(guò)3D打印技術(shù)熔融擠壓熔融態(tài)聚四氟乙烯(TEFLON)，得到合成高分子分支血管支架。
[0042]3)高分子外殼及高分子隔離層的制備:同樣采用3D打印技術(shù)螺桿擠壓熔融態(tài)TEFLON制備外殼及隔離層；外殼10 μ m厚度，隔離層厚度0.5 μ m。
[0043]4)體外仿生模型的最終確立:利用復(fù)合多噴頭三維打印技術(shù)將含Hep天然高分子沿分支血管支架打印成形，間隔預(yù)留50%空間；利用復(fù)合多噴頭三維打印技術(shù)使含ADSC的天然高分子沿上述預(yù)留空間成形，成`形體內(nèi)部可預(yù)留孔道；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給毛細(xì)血管生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，誘導(dǎo)ADSC分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；將上述結(jié)構(gòu)進(jìn)行脈動(dòng)體外培養(yǎng)，交替更換含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM和一般DMEM，實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞的組織化的穩(wěn)定、血管化的發(fā)展以及二者之間的聯(lián)系。
[0044]5)肝炎的誘發(fā)以及藥物篩選:利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給含致病性藥物(如雙醋酚汀、甲基多巴、呋喃坦啶等)的DMEM誘發(fā)藥物性肝炎，破壞肝細(xì)胞，檢測(cè)記錄生物學(xué)指標(biāo)(如白蛋白、葡萄糖-6-磷酸酶和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)化酶和血管化表達(dá)情況)；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給含治療性藥物(如維生素、還原型谷胱甘肽、甘草酸制劑或者新開(kāi)發(fā)的藥物)的DMEM進(jìn)行治療，記錄分析上述生物學(xué)指標(biāo)，得到藥物篩選結(jié)果。
[0045]實(shí)施例2:制備一種個(gè)性化仿生血管化肝組織并將其應(yīng)用于肝炎藥物篩選
[0046]I)含細(xì)胞的水凝膠的制備:提取大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSC)和胚胎干細(xì)胞(ESC)，培養(yǎng)傳代后，制備細(xì)胞懸浮液；將天然高分子粉末與DMEM培養(yǎng)液混合，得到質(zhì)量體積濃度為20%的明膠溶液、質(zhì)量體積濃度為4%的海藻酸鈉溶液和質(zhì)量體積濃度為2%的纖維蛋白原溶液，以上述明膠溶液、海藻酸鈉溶液和纖維蛋白原溶液體積比1:2:1混合后得到天然高分子溶液待用^fADSC和ESC懸浮液分別離心，分別與天然高分子溶液混合，得到細(xì)胞濃度為3X IO6個(gè)/mL的含ADSC的天然高分子溶液，以及細(xì)胞濃度為I X IO5個(gè)/mL的含ESC的天然高分子溶液。[0047]2)分支血管支架的制備:依照實(shí)施例1的步驟2)制備天然高分子膠原分支血管支架。
[0048]3)高分子外殼及高分子隔離層的制備:實(shí)施例1的步驟3)制備天然高分子膠原外殼及隔離層。
[0049]4)體外仿生模型的最終確立:利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含ESC的天然高分子沿預(yù)先設(shè)計(jì)的分支血管路徑或計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行三維打印，間隔留出50%的分支血管空間不予細(xì)胞組裝；之后利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含ADSC的天然高分子沿上述分支血管內(nèi)側(cè)預(yù)留路徑打印，并在打印層內(nèi)側(cè)預(yù)留孔道，將成形體用質(zhì)量體積濃度為5%的CaCl2溶液和100U/mL的凝血酶溶液交聯(lián)2min ;利用脈動(dòng)系統(tǒng)分階段供給誘導(dǎo)劑使ESC轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞，誘導(dǎo)劑含酸性FGF、HGF、0SM、地塞米松、轉(zhuǎn)鐵蛋白等；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給毛細(xì)血管生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，誘導(dǎo)ADSC分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；將上述結(jié)構(gòu)進(jìn)行脈動(dòng)體外培養(yǎng)，交替更換含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM、含分階段肝細(xì)胞誘導(dǎo)劑的DMEM和一般DMEM，實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞的組織化的穩(wěn)定、血管化的發(fā)展以及二者之間的聯(lián)系O
[0050]5)依照實(shí)施實(shí)例I的步驟4)進(jìn)行肝炎的誘導(dǎo)發(fā)生以及藥物篩選。
[0051]實(shí)施例3:制備一種個(gè)性化仿生血管化肝組織并將其應(yīng)用于肝炎藥物篩選
[0052]I)含細(xì)胞的水凝膠的制備:提取大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSC);將小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子(0ct3/4, Sox2, c-Myc和Klf4)重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotent stem cell, iPSC),培養(yǎng)傳代后,制備細(xì)胞懸浮液；將天然高分子粉末與DMEM培養(yǎng)液或(phosphate buffered saline)PBS溶液混合,得到質(zhì)量體積濃度為10%的明膠溶液、質(zhì)量體積濃度為2%的海藻酸鈉溶液和質(zhì)量體積濃度為1%的纖維蛋白原溶液，以明膠溶液、海藻酸鈉溶液和纖維蛋白原溶液體積比2:2:1混合后得到天然高分子待用；最終將ADSC和iPSC懸浮液分別離心，得到細(xì)胞濃度為2 X IO5個(gè)/mL的含ADSC的天然高分子溶液，以及細(xì)胞濃度為3 X IO6個(gè)/mL的含iPSC的天然高分子溶液。
[0053]2)分支血管支架的制備:實(shí)施例1的步驟2)制備合成高分子分支血管支架。
[0054]3)高分子外殼及高分子隔離層的制備:材料為質(zhì)量體積濃度為5%的PLGA的1，4-二氧六環(huán)溶液，利用多噴嘴噴涂噴頭組件，將該溶液噴涂至水凝膠層之間，得到水凝膠-PLGA層的交替結(jié)構(gòu)，即為隔離層；最終將該溶液噴涂至結(jié)構(gòu)體外圍，得到PLGA外殼。
[0055]4)體外仿生模型的最終確立:利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含iPSC的天然高分子沿預(yù)先設(shè)計(jì)的分支血管路徑或計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行三維打印，間隔留出50%的分支血管空間不予細(xì)胞組裝；之后利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含ADSC的天然高分子沿上述分支血管內(nèi)側(cè)預(yù)留路徑打印，并在打印層內(nèi)側(cè)預(yù)留孔道；將成形體浸入PBS溶液，萃取去除1，4-二氧六環(huán)有機(jī)溶劑；利用脈動(dòng)系統(tǒng)分階段供給誘導(dǎo)劑使iPSC轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞，誘導(dǎo)劑含激活素A、bFGF和HGF;利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給毛細(xì)血管生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，誘導(dǎo)ADSC分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；將上述結(jié)構(gòu)進(jìn)行脈動(dòng)體外培養(yǎng)，交替更換含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM、分階段肝細(xì)胞誘導(dǎo)劑的DMEM和一般DMEM，實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞的組織化的穩(wěn)定、血管化的發(fā)展以及二者之間的聯(lián)系。
[0056]5)依照實(shí)施實(shí)例I的步驟4)進(jìn)行肝炎的誘導(dǎo)發(fā)生以及藥物篩選。
[0057]實(shí)施例4:制備一種個(gè)性化仿生血管化肝癌組織并將其應(yīng)用于肝癌藥物篩選[0058]I)含細(xì)胞的水凝膠的制備:提取大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSC)，購(gòu)買(mǎi)肝癌細(xì)胞0fepG2)，培養(yǎng)傳代后，制備細(xì)胞懸浮液；將天然高分子粉末與PBS溶液混合，得到質(zhì)量體積濃度為10%的明膠溶液、質(zhì)量體積濃度為5%的海藻酸鈉溶液和質(zhì)量體積濃度為1%的纖維蛋白原溶液，以明膠溶液、海藻酸鈉溶液和纖維蛋白原溶液體積比3:2:1混合后得到天然高分子待用；最終將ADSC和HepG2分別離心，并分別混入天然高分子溶液中，得到細(xì)胞濃度為3 X IO5個(gè)/mL的含ADSC的天然高分子溶液，以及細(xì)胞濃度為3 X IO6個(gè)/mL的含H印G2的天然高分子溶液。
[0059]2)分支血管支架的制備=Solidworks軟件設(shè)計(jì)分支血管三維模型,經(jīng)分層軟件分析后，通過(guò)3D打印技術(shù)螺桿擠壓熔融態(tài)ABS，得到分支血管支架。
[0060]3)高分子隔離層和高分子外殼制備:材料為質(zhì)量體積濃度為5%的PU的四乙二醇溶液，利用多噴嘴噴涂噴頭組件，將該溶液噴涂至水凝膠層之間，得到水凝膠-PU層的交替結(jié)構(gòu)，即為保護(hù)層；最終將該溶液噴涂至結(jié)構(gòu)體外圍，得到PU外殼。
[0061]4)利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含HepG2的天然高分子沿預(yù)先設(shè)計(jì)的分支血管路徑或計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行三維打印，間隔留出50%的分支血管空間不予細(xì)胞組裝；之后利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含ADSC的天然高分子沿上述分支血管內(nèi)側(cè)預(yù)留路徑打印，并在打印層內(nèi)側(cè)預(yù)留孔道；將成形體浸入PBS溶液，萃取去除四乙二醇有機(jī)溶劑；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給MEM (minimum essential medium)培養(yǎng)液養(yǎng)液穩(wěn)定肝癌細(xì)胞使其組織化；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給毛細(xì)血管生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，誘導(dǎo)ADSC分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；將上述結(jié)構(gòu)繼續(xù)進(jìn)行脈動(dòng)體外培養(yǎng)，交替更換含VEGF的MEM、含HGF的MEM和一般MEM，實(shí)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的組織化的穩(wěn)定、血管化的發(fā)展以及二者之間的聯(lián)系。
[0062]5)肝癌藥物篩選:檢測(cè)記錄成形體的生物學(xué)指標(biāo)(如黃疸水平、白蛋白水平、吲哚氰綠滯留率、葡萄糖-6-磷酸酶和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)化酶和血管化表達(dá)情況)；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給治療性藥物如維生素、化療性藥物、索拉非尼或者新開(kāi)發(fā)的藥物，記錄并分析生物學(xué)指標(biāo)，進(jìn)行藥物篩選。`
[0063]實(shí)施例5:制備一種個(gè)性化仿生血管化胰腺組織并將其應(yīng)用于糖尿病的藥物篩選
[0064]I)含細(xì)胞的水凝膠的制備:提取大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSC)和胰島β細(xì)胞(Pan β )，制備細(xì)胞懸浮液；將天然高分子粉末與DMEM培養(yǎng)液混合，得到質(zhì)量體積濃度為10%的明膠溶液待用；最終將ADSC和Panii懸浮液分別離心，分別混入天然高分子溶液中，得到3 X IO6個(gè)/mL的含ADSC的天然高分子溶液，以及3 X IO6個(gè)/mL的含Pan β的天然高分子溶液。
[0065]2)分支血管支架的制備:依照實(shí)施例1的步驟2)制備合成高分子I3U支架。
[0066]3)外殼及隔離層的制備:實(shí)施例4的步驟3)制備PU外殼及隔離層。
[0067]4)利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含Pan β的天然高分子沿預(yù)先設(shè)計(jì)的分支血管路徑或計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行三維打印，間隔留出50%的分支血管空間不予細(xì)胞組裝；之后利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含ADSC的天然高分子沿上述分支血管內(nèi)側(cè)預(yù)留路徑打印，并在打印層內(nèi)側(cè)預(yù)留孔道；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給培養(yǎng)液穩(wěn)定胰島β細(xì)胞使其組織化；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給毛細(xì)血管生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，誘導(dǎo)ADSC分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；將上述結(jié)構(gòu)繼續(xù)進(jìn)行脈動(dòng)體外培養(yǎng)，交替更換含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM和一般DMEM，實(shí)現(xiàn)胰島β細(xì)胞的組織化的穩(wěn)定、血管化的發(fā)展以及二者之間的聯(lián)系O[0068]5)糖尿病的誘導(dǎo)發(fā)生以及藥物篩選:利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)直接破壞胰島β細(xì)胞引發(fā)2型糖尿病，并檢測(cè)記錄此時(shí)生物學(xué)指標(biāo)(如葡萄糖消耗、胰島素釋放、C肽和血管化表達(dá)情況)；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給治療性藥物如磺脲類、雙胍類、格列奈類藥物或或者新開(kāi)發(fā)的藥物，記錄并分析生物學(xué)指標(biāo)，進(jìn)行藥物篩選。
[0069]實(shí)施例6:制備一種個(gè)性化仿生血管化胰腺組織并將其應(yīng)用于糖尿病的藥物篩選
[0070]I)含細(xì)胞的水凝膠的制備:提取大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSC)和胚胎干細(xì)胞(ESC)，培養(yǎng)傳代后，制備細(xì)胞懸浮液；將天然高分子與DMEM培養(yǎng)液混合，得到質(zhì)量體積濃度為10%的明膠溶液、質(zhì)量體積濃度為2%的海藻酸鈉溶液和質(zhì)量體積濃度為1%的纖維蛋白原溶液，以明膠溶液、海藻酸鈉溶液和纖維蛋白原溶液體積比2:2:1混合后得到天然高分子待用；最終將ADSC和ESC分別離心，并分別混入天然高分子溶液中，得到細(xì)胞濃度為3 X IO6個(gè)/mL的含ADSC的天然高分子溶液，以及細(xì)胞濃度為3 X IO6個(gè)/mL的含ESC的天然高分子溶液。
[0071]2)分支血管支架的制備:依照實(shí)施例1的步驟2)制備合成高分子PEG分支血管支架。
[0072]3)外殼及隔離層的制備:實(shí)施例4的步驟3)制備外殼及隔離層。
[0073]4)體外仿生模型的最終確立:利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含ESC的天然高分子沿預(yù)先設(shè)計(jì)的分支血管路徑或計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行三維打印，間隔留出50%的分支血管空間不予細(xì)胞組裝；之后利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含ADSC的天然高分子沿上述分支血管內(nèi)側(cè)預(yù)留路徑打印，并在打印層內(nèi)側(cè)預(yù)留孔道；利用脈動(dòng)系統(tǒng)分階段供給誘導(dǎo)劑使ESC轉(zhuǎn)化為膜島 β 細(xì)胞，誘導(dǎo)劑含Activin A、FGF、CYC、RA、CYC、Extendin_4、IGF和 Nicotinamide等；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給毛細(xì)血管生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，誘導(dǎo)ADSC分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；將上述結(jié)構(gòu)繼續(xù)進(jìn)行脈動(dòng)體外培養(yǎng)，交替更換含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM、含分階段胰島β細(xì)胞誘導(dǎo)劑的DMEM和一般DMEM，實(shí)現(xiàn)胰島β細(xì)胞的組織化的穩(wěn)定、血管化的發(fā)展以及二者之間的聯(lián)系。
[0074]5)依照實(shí)施實(shí)例5的步驟`4)進(jìn)行糖尿病的誘導(dǎo)發(fā)生以及藥物篩選。
[0075]實(shí)施例7:制備一種個(gè)性化仿生血管化胰腺組織并將其應(yīng)用于糖尿病的藥物篩選
[0076]I)含細(xì)胞的水凝膠的制備:提取大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSC);將小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子(0ct3/4, Sox2, c-Myc和Klf4)重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotent stem cell, iPSC),培養(yǎng)傳代后,制備細(xì)胞懸浮液；將天然高分子粉末與PBS溶液混合，得到質(zhì)量體積濃度為2%的海藻酸鈉溶液，最終將ADSC和iPSC懸浮液分別離心，得到細(xì)胞濃度為3 X IO6個(gè)/mL的含ADSC的天然高分子溶液，以及細(xì)胞濃度為3 X IO6個(gè)/mL的含iPSC的天然高分子溶液。
[0077]2)分支血管支架的制備:依照實(shí)施例1的步驟2)制備合成高分子PCL分支血管支架。
[0078]3)外殼及隔離層的制備:實(shí)施例1的步驟3)制備外殼及隔離層。
[0079]4)體外仿生模型的最終確立:利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含iPSC的天然高分子沿預(yù)先設(shè)計(jì)的分支血管路徑或計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行三維打印，間隔留出50%的分支血管空間不予細(xì)胞組裝；之后利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含ADSC的天然高分子沿上述分支血管內(nèi)側(cè)預(yù)留路徑打印，并在打印層內(nèi)側(cè)預(yù)留孔道；利用脈動(dòng)系統(tǒng)分階段供給誘導(dǎo)劑使iPSC轉(zhuǎn)化為膜島 β 細(xì)胞，誘導(dǎo)劑含Activin A、FGF、CYC、RA、CYC、Extendin_4、IGF和 Nicotinamide等；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給毛細(xì)血管生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，誘導(dǎo)ADSC分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；將上述結(jié)構(gòu)繼續(xù)進(jìn)行脈動(dòng)體外培養(yǎng)，交替更換含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM、含分階段胰島β細(xì)胞誘導(dǎo)劑的DMEM和一般DMEM，實(shí)現(xiàn)胰島β細(xì)胞的組織化的穩(wěn)定、血管化的發(fā)展以及二者之間的聯(lián)系。
[0080]5)依照實(shí)施實(shí)例5的步驟4)進(jìn)行糖尿病的誘導(dǎo)發(fā)生以及藥物篩選。
[0081]實(shí)施例8:制備一種個(gè)性化仿生血管化胰腺癌組織并將其應(yīng)用于胰腺癌的藥物篩選
[0082]1)含細(xì)胞的水凝膠的制備:提取大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSC)，購(gòu)買(mǎi)胰腺癌細(xì)胞(PANC-1)，培養(yǎng)傳代后，制備細(xì)胞懸浮液；將天然高分子粉末與PBS溶液混合，得到質(zhì)量體積濃度為1%的纖維蛋白原溶液，最終將ADSC和PANC-1分別離心，并分別混入天然高分子溶液中，得到細(xì)胞濃度為3X IO6個(gè)/mL的含ADSC的天然高分子溶液，以及細(xì)胞濃度為3 X IO6個(gè)/mL的含PANC-1的天然高分子溶液。
[0083]2)分支血管支架的制備:依照實(shí)施例1的步驟2)制備合成高分子PGA分支血管支架。
[0084]3)外殼及隔離層的制備:實(shí)施例4步驟3)制備外殼及隔離層。
[0085]4)體外仿生模型的最終確立:利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含PANC-1的天然高分子沿預(yù)先設(shè)計(jì)的分支血管路徑或計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行三維打印，間隔留出50%的分支血管空間不予細(xì)胞組裝；之后利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含ADSC的天然高分子沿上述分支血管內(nèi)側(cè)預(yù)留路徑打印，并在打印層內(nèi)側(cè)預(yù)留孔道，利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給MEM培養(yǎng)液穩(wěn)定胰腺癌細(xì)胞使其組織化；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給毛細(xì)血管生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，誘導(dǎo)ADSC分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；將上述結(jié)構(gòu)繼續(xù)進(jìn)行脈動(dòng)體外培養(yǎng)，交替更換含VEGF的MEM、含HGF的MEM和一般MEM，實(shí)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞的組織化的穩(wěn)定、血管化的發(fā)展以及二者之間的聯(lián)系。
[0086]5)胰腺癌藥物篩選:檢測(cè)記錄成形體的生物學(xué)指標(biāo)(如谷丙轉(zhuǎn)氨酶、葡萄糖、CEA、CA 19-9和血管化表達(dá)情況)；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給治療性藥物如吉西他濱、5-Fu、替吉奧等或者新開(kāi)發(fā)藥物，記錄并分析生物學(xué)指標(biāo)，進(jìn)行藥物篩選。
[0087]實(shí)施例9:制備一種個(gè)性化仿生血管化腎臟組織并將其應(yīng)用于腎炎的藥物篩選
[0088]1)含細(xì)胞的水凝膠的制備:提取大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSC)和新生鼠腎細(xì)胞(NKC)，培養(yǎng)傳代后，制備細(xì)胞懸浮液；將天然高分子粉末與DMEM培養(yǎng)液混合，得到質(zhì)量體積濃度為20%的明膠溶液，將ADSC和NKC懸浮液離心，分別與天然高分子溶液混合，得到細(xì)胞濃度為I X IO6個(gè)/mL的含ADSC的天然高分子溶液，以及細(xì)胞濃度為2 X 107/mL的含NKC的天然高分子溶液。個(gè)
[0089]2)分支血管支架的制備:依照實(shí)施例1的步驟2)制備合成高分子PHB分支血管支架。
[0090]3)外殼及隔離層的制備:實(shí)施例4步驟3)制備外殼及隔離層。
[0091]4)體外仿生模型的最終確立:利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含NKC的天然高分子沿預(yù)先設(shè)計(jì)的分支血管路徑或計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行三維打印，間隔留出50%的分支血管空間不予細(xì)胞組裝；之后利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含ADSC的天然高分子沿上述分支血管內(nèi)側(cè)預(yù)留路徑打印，并在打印層內(nèi)側(cè)預(yù)留孔道；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給培養(yǎng)液穩(wěn)定腎細(xì)胞使其組織化；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給毛細(xì)血管生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，誘導(dǎo)ADSC分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；組合連接合成高分子分支支架，將上述結(jié)構(gòu)繼續(xù)進(jìn)行脈動(dòng)體外培養(yǎng)，交替更換含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM和一般DMEM，實(shí)現(xiàn)腎細(xì)胞的組織化的穩(wěn)定、血管化的發(fā)展以及二者之間的聯(lián)系。
[0092]5)腎炎的誘導(dǎo)發(fā)生以及藥物篩選:利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給抗生素或非留體類消炎藥等破壞NKC，誘發(fā)急性間質(zhì)性腎炎，并檢測(cè)記錄此時(shí)生物學(xué)指標(biāo)(如葡萄糖、尿素、尿蛋白肌酐和血管化表達(dá)情況)；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給治療性藥物如雙氫氯噻嗪、呋塞米、激素或者新開(kāi)發(fā)的藥物，記錄并分析生物學(xué)指標(biāo)，進(jìn)行藥物篩選。
[0093]實(shí)施例10:制備一種個(gè)性化仿生血管化腎臟組織并將其應(yīng)用于腎炎的藥物篩選
[0094]I)含細(xì)胞的水凝膠的制備:提取大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSC)和胚胎干細(xì)胞(ESC)，培養(yǎng)傳代后，制備細(xì)胞懸浮液；將天然高分子粉末與DMEM培養(yǎng)液混合，得到質(zhì)量體積濃度為10%的明膠溶液、質(zhì)量體積濃度為2%的海藻酸鈉溶液和質(zhì)量體積濃度為1%的纖維蛋白原溶液，以上述明膠溶液、海藻酸鈉溶液和纖維蛋白原溶液體積比2:2:1混合后得到天然高分子溶液待用；將ADSC和ESC懸浮液離心，分別與天然高分子溶液混合，得到細(xì)胞濃度為I X IO5個(gè)/mL的含ADSC的天然高分子溶液，以及細(xì)胞濃度為I X IO5個(gè)/mL的含ESC的天然高分子溶液。
[0095]2)分支血管支架的制備 :依照實(shí)施例1的步驟2)制備合成高分子I3U分支血管支架。
[0096]3)高分子外殼及高分子隔離層的制備:實(shí)施例4步驟3)制備外殼及隔離層。
[0097]4)體外仿生模型的最終確立:利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含ESC的天然高分子沿預(yù)先設(shè)計(jì)的分支血管路徑或計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行三維打印，間隔留出50%的分支血管空間不予細(xì)胞組裝；之后利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含ADSC的天然高分子沿上述分支血管內(nèi)側(cè)預(yù)留路徑打印，并在打印層內(nèi)側(cè)預(yù)留孔道；利用脈動(dòng)系統(tǒng)分階段供給誘導(dǎo)劑使ESC轉(zhuǎn)化為腎細(xì)胞，誘導(dǎo)劑含F(xiàn)GF-2和LIF等；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給毛細(xì)血管生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，誘導(dǎo)ADSC分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；將上述結(jié)構(gòu)繼續(xù)進(jìn)行脈動(dòng)體外培養(yǎng)，交替更換含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM、含腎細(xì)胞誘導(dǎo)劑的DMEM和一般DMEM，實(shí)現(xiàn)腎細(xì)胞的組織化的穩(wěn)定、血管化的發(fā)展以及二者之間的聯(lián)系。
[0098]5)依照實(shí)施例9的步驟4)進(jìn)行腎炎的誘導(dǎo)發(fā)生以及腎炎藥物篩選。
[0099]實(shí)施例11:制備一種個(gè)性化仿生血管化腎臟組織并將其應(yīng)用于腎炎的藥物篩選
[0100]I)含細(xì)胞的水凝膠的制備:提取大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSC);將小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子(0ct3/4, Sox2, c-Myc和Klf4)重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotent stem cell, iPSC),培養(yǎng)傳代后，制備細(xì)胞懸浮液；將天然高分子粉末與PBS溶液混合，得到質(zhì)量體積濃度為10%的明膠溶液、質(zhì)量體積濃度為2%的海藻酸鈉溶液和質(zhì)量體積濃度為1%的纖維蛋白原溶液，以明膠溶液、海藻酸鈉溶液和纖維蛋白原溶液體積比1:2:2混合后得到天然高分子待用；最終將ADSC和iPSC懸浮液分別離心，得到細(xì)胞濃度為I X IO7個(gè)/mL的含ADSC的天然高分子溶液，以及細(xì)胞濃度為3 X IO7個(gè)/mL的含iPSC的天然高分子溶液。
[0101]2)分支血管支架的制備:依照實(shí)施例1的步驟2)制備合成高分子PLGA分支血管支架。[0102]3)高分子外殼及高分子隔離層的制備:實(shí)施例1的步驟3)制備外殼及隔離層。
[0103]4)體外仿生模型的最終確立:利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含iPSC的天然高分子沿預(yù)先設(shè)計(jì)的分支血管路徑或計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行三維打印，間隔留出50%的分支血管空間不予細(xì)胞組裝；之后利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含ADSC的天然高分子沿上述分支血管內(nèi)側(cè)預(yù)留路徑打印，并在打印層內(nèi)側(cè)預(yù)留孔道；利用脈動(dòng)系統(tǒng)分階段供給誘導(dǎo)劑使iPSC轉(zhuǎn)化為腎細(xì)胞，誘導(dǎo)劑含F(xiàn)GF-2和LIF等；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給毛細(xì)血管生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，誘導(dǎo)ADSC分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；組合連接合成高分子分支支架，將上述結(jié)構(gòu)繼續(xù)進(jìn)行脈動(dòng)體外培養(yǎng)，交替更換含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM、含腎細(xì)胞誘導(dǎo)劑的DMEM和一般DMEM，實(shí)現(xiàn)腎細(xì)胞的組織化的穩(wěn)定、血管化的發(fā)展以及二者之間的聯(lián)系。
[0104]5)依照實(shí)施例9的步驟4)進(jìn)行腎炎的誘導(dǎo)發(fā)生以及腎炎藥物篩選。
[0105]實(shí)施例12:制備一種個(gè)性化仿生血管化腎癌組織并將其應(yīng)用于腎癌的藥物篩選
[0106]I)含細(xì)胞的水凝膠的制備:提取大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSC)，購(gòu)買(mǎi)腎癌細(xì)胞(RCC)，培養(yǎng)傳代后，制備細(xì)胞懸浮液；將天然高分子粉末與PBS溶液混合，得到質(zhì)量體積濃度為10%的明膠溶液和質(zhì)量體積濃度為1%的纖維蛋白原溶液，以明膠溶液和纖維蛋白原溶液體積比1:1混合后得到天然高分子待用；最終將ADSC和RCC分別離心，并分別混入天然高分子溶液中，得到細(xì)胞濃度為3X IO6個(gè)/mL的含ADSC的天然高分子溶液，以及細(xì)胞濃度為3 X IO6個(gè)/mL的含RCC的天然高分子溶液。
[0107]2)分支血管支架的制備:依照實(shí)施例1的步驟2)制備天然高分子海藻酸鈉分支血管支架，用CaC12 交聯(lián)。
[0108]3)高分子外殼及高分子隔離層的制備:實(shí)施例1的步驟3)制備天然高分子海藻酸鈉外殼及隔離層，用CaC12交聯(lián)。
[0109]4)體外仿生模型的最終確立:利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含RCC的天然高分子沿預(yù)先設(shè)計(jì)的分支血管路徑或計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行三維打印，間隔留出50%的分支血管空間不予細(xì)胞組裝；之后利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含ADSC的天然高分子沿上述分支血管內(nèi)側(cè)預(yù)留路徑打印，并在打印層內(nèi)側(cè)預(yù)留孔道；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給MEM培養(yǎng)液穩(wěn)定腎癌細(xì)胞使其組織化；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給毛細(xì)血管生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，誘導(dǎo)ADSC分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；將上述結(jié)構(gòu)繼續(xù)進(jìn)行脈動(dòng)體外培養(yǎng)，交替更換含VEGF的MEM、含HGF的MEM和一般MEM，實(shí)現(xiàn)腎癌細(xì)胞的組織化的穩(wěn)定、血管化的發(fā)展以及二者之間的聯(lián)系。
[0110]5)腎癌藥物篩選:檢測(cè)記錄成形體的生物學(xué)指標(biāo)(如尿素氮、肌酐、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶和血管化表達(dá)情況)；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給治療性藥物如索拉非尼、貝伐株單抗或者新開(kāi)發(fā)的藥物，記錄并分析生物學(xué)指標(biāo)，進(jìn)行藥物篩選。
[0111]實(shí)施例13制備一種個(gè)性化仿生血管化淋巴癌組織并將其應(yīng)用于淋巴癌的藥物篩選
[0112]I)含細(xì)胞的水凝膠的制備:提取大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSC)，購(gòu)買(mǎi)淋巴癌細(xì)胞(EL4)，培養(yǎng)傳代后，制備細(xì)胞懸浮液；將天然高分子粉末與PBS溶液混合，得到質(zhì)量體積濃度為1%的纖維蛋白原溶液，最終將ADSC和EL4分別離心，并分別混入天然高分子溶液中，得到細(xì)胞濃度為2 X IO5個(gè)/mL的含ADSC的天然高分子溶液，以及細(xì)胞濃度為2 X IO5個(gè)/mL的含EL4的天然高分子溶液。
[0113]2)分支血管支架的制備:依照實(shí)施例1的步驟2)制備合成天然高分子纖維蛋白原分支血管支架，用100U/mL的凝血酶聚合。
[0114]3)高分子外殼及高分子隔離層的制備:實(shí)施例1的步驟3)制備天然高分子纖維蛋白原外殼及隔離層，用100U/mL的凝血酶聚合。
[0115]4)利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含EL4的天然高分子沿預(yù)先設(shè)計(jì)的分支血管路徑或計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行三維打印，間隔留出50%的分支血管空間不予細(xì)胞組裝；之后利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含ADSC的天然高分子沿上述分支血管內(nèi)側(cè)預(yù)留路徑打印，并在打印層內(nèi)側(cè)預(yù)留孔道；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給培MEM養(yǎng)液穩(wěn)定淋巴癌細(xì)胞使其組織化；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給毛細(xì)血管生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，誘導(dǎo)ADSC分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；將上述結(jié)構(gòu)繼續(xù)進(jìn)行脈動(dòng)體外培養(yǎng)，交替更換含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM和一般DMEM，實(shí)現(xiàn)淋巴癌細(xì)胞的組織化的穩(wěn)定、血管化的發(fā)展以及二者之間的聯(lián)系。
[0116]5)淋巴癌藥物篩選:檢測(cè)記錄成形體的生物學(xué)指標(biāo)(如乳酸鹽脫氫酶、堿性磷酸酶、瘤巨細(xì)胞和血管化表達(dá)情況)；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給治療性藥物如阿霉素、博萊霉素、長(zhǎng)春花堿、甲氮咪氨或者新開(kāi)發(fā)的藥物，記錄并分析生物學(xué)指標(biāo)，進(jìn)行藥物篩選。
[0117]實(shí)施例14:制備一種個(gè)性化仿生血管化小耳組織
[0118]I)含細(xì)胞的水凝膠的制備:提取大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSC)和軟骨細(xì)胞(CHO)，制備細(xì)胞懸浮液；將天然高分子粉末與DMEM培養(yǎng)液混合，得到質(zhì)量體積濃度為5%的明膠溶液，最終將ADSC和CHO懸浮液分別離心，分別混入天然高分子溶液中，得到3 X IO6個(gè)/mL的含ADSC的天然高分子溶液，以及3 X IO6個(gè)/mL的含CHO的天然高分子溶液。
[0119]2)分支血管支架`的制備:依照實(shí)施例1的步驟2)制備合成高分子ABS分支血管支架。
[0120]3)高分子外殼及高分子隔離層的制備:材料為質(zhì)量體積濃度為3%的PU的1，4-二氧六環(huán)溶液，溶液內(nèi)混入肝素和瘦素，利用多噴嘴噴涂噴頭組件，將該溶液噴涂至水凝膠層之間；利用噴霧噴嘴噴涂PBS溶液，萃取、去除四乙二醇，得到多孔隔離層；得到水凝膠-PU層的交替結(jié)構(gòu)，即為保護(hù)層；最終將該溶液噴涂至結(jié)構(gòu)體外圍，得到PU外殼。
[0121]4)利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含CHO的天然高分子沿預(yù)先設(shè)計(jì)的分支血管路徑或計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行三維打印，間隔留出50%的分支血管空間不予細(xì)胞組裝；之后利用復(fù)合多噴頭3D打印技術(shù)將含ADSC的天然高分子沿上述分支血管內(nèi)側(cè)預(yù)留路徑打印，并在打印層內(nèi)側(cè)預(yù)留孔道；將成形體浸入PBS溶液，萃取去除四乙二醇有機(jī)溶劑；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給培養(yǎng)液穩(wěn)定軟骨細(xì)胞CHO使其組織化；利用脈動(dòng)系統(tǒng)供給毛細(xì)血管生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，誘導(dǎo)ADSC分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；將上述結(jié)構(gòu)繼續(xù)進(jìn)行脈動(dòng)體外培養(yǎng)，交替更換含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM和一般DMEM，實(shí)現(xiàn)CHO細(xì)胞的組織化的穩(wěn)定、血管化的發(fā)展以及二者之間的聯(lián)系。
【權(quán)利要求】
1.一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)包括高分子外殼(106)、分支血管支架(102)、功能組織區(qū)(103)、血管組織區(qū)(104)和高分子隔離層(401)；所述的功能組織區(qū)(103)為含組織細(xì)胞的水凝膠層；所述的血管組織區(qū)(104)為含血管種子細(xì)胞的水凝膠層；所述功能組織區(qū)(103)和血管組織區(qū)(104)在空間交替排列；所述的高分子隔離層(401)間隔排布在功能組織區(qū)(103)和血管組織區(qū)(104)內(nèi)，并將功能組織區(qū)(103)和血管組織區(qū)(104)分成多個(gè)小區(qū)域；所述分支血管支架(102)包括動(dòng)脈血管和靜脈血管兩部分，動(dòng)脈血管含至少一個(gè)入口和若干個(gè)分支，靜脈血管含至少一個(gè)出口和若干個(gè)分支；所述的分支血管支架(102)采用合成高分子材料，分支血管支架(102)貫穿于高分子外殼(106)、功能組織區(qū)(103)、血管組織區(qū)(104)和高分子隔離層(401)之間；所述的高分子外殼(106)采用天然高分子或合成高分子材料。
2.如權(quán)利要求1所述的一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述分支血管支架的內(nèi)徑為10 μ m~IOmm,壁厚為100 μ m~2mm ;所述高分子隔離層及高分子外殼的層厚為0.1 μ m ~2mm。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述功能組織區(qū)的含組織細(xì)胞的水凝膠層和血管組織區(qū)的含血管種子細(xì)胞的水凝膠層為天然高分子水凝膠，該天然高分子為明膠、海藻酸鈉、纖維蛋白原、膠原、基質(zhì)膠、卡拉膠、殼聚糖、瓊脂、透明質(zhì)酸、基質(zhì)膠、彈性蛋白和層粘素中的至少一種；所述天然高分子水凝膠中復(fù)合有細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝素、瘦素、紫杉醇和黃芪抗癌粉中的至少一種。
4.如權(quán)利要求3所述的一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述天然高分子水凝膠的質(zhì)量體積濃度為0.1 ~40% ;所述血管種子細(xì)胞和組織細(xì)胞的濃度為I X IO3~I X IO8個(gè)/mL ;所述功能組織區(qū)的組織細(xì)胞為成體組織細(xì)胞、成體干細(xì)胞和癌細(xì)胞中的一種；所述血管組織區(qū)的血管種子細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的至少一種。
5.—種如權(quán)利要求1所述個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟: 1)設(shè)計(jì)分支血管支架三維模型，分兩組分別模仿動(dòng)脈血管和靜脈血管； 2)將合成高分子材料、配制好的含組織細(xì)胞的水凝膠、配制好的含血管種子細(xì)胞的水凝膠和配制好的合成高分子溶液裝載到復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備的不同噴頭中； 3)制備分支血管支架:依據(jù)步驟I)的三維模型，利用復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備擠出合成高分子溶液，并凍干去除有機(jī)溶劑，或熔融擠出合成高分子材料，得到分支血管支架； 4)制備功能組織區(qū):利用復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備逐層打印配制好的含組織細(xì)胞的水凝膠，打印路徑沿分支血管支架，間隔打印，得到初步三維結(jié)構(gòu)體； 5)制備血管組織區(qū):利用復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備逐層打印，將配制好的含血管種子細(xì)胞的水凝膠填充在初步三維結(jié)構(gòu)體的空隙中，得到中間三維結(jié)構(gòu)體； 6)制備高分子隔離層和高分子外殼:在步驟4)和步驟5)逐層打印過(guò)程中，在打印一層或若干層后利用復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備噴涂合成高分子溶液并萃取有機(jī)溶劑，或熔融擠出合成高分子材料，形成高分子隔離層，得到含細(xì)胞的水凝膠層和高分子隔離層的交替結(jié)構(gòu)體；在交替結(jié)構(gòu)體外圍噴涂合成高分子溶液并萃取有機(jī)溶劑，或熔融擠出合成高分子材料，形成高分子外殼，得到個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)前體；7)對(duì)上述個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)前體提供生長(zhǎng)因子，實(shí)現(xiàn)血管組織區(qū)的血管化，使功能組織區(qū)形成組織，并使血管組織區(qū)和功能組織區(qū)的細(xì)胞產(chǎn)生聯(lián)系，最終得到所述的個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)。
6.如權(quán)利要求5所述的一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于:所述復(fù)合多噴頭三維打印設(shè)備采用熔融擠出成形技術(shù)或低溫沉積成形技術(shù)來(lái)制備分支血管支架、高分子隔離層和高分子外殼；當(dāng)采用熔融擠出成形技術(shù)制備分支血管支架、高分子隔離層和高分子外殼時(shí)，所述的合成高分子材料為丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚氨酯、聚四氟乙烯和糖類中的至少一種；當(dāng)采用低溫沉積成形技術(shù)制備分支血管支架、高分子隔離層和高分子外殼時(shí)，所述的合成高分子溶液的溶質(zhì)為聚氨酯、聚碳酸酯、聚脲酯、聚乙交酯、聚丁二酸酯、聚醚酯、聚乙二醇、聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚酯和聚羥基酸酯中的至少一種，所述合成高分子溶液的溶劑為四乙二醇或1，4- 二氧六環(huán)。
7.如權(quán)利要求5所述的一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于:所述合成高分子溶液的質(zhì)量體積濃度為1%~30% ;所述合成高分子溶液中復(fù)合有抗凝血因子，該抗凝血因子為肝素或紫杉醇。
8.—種如權(quán)利要求1所述個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)用于藥物篩選的方法，其特征在于該方法包括如下步驟: 1)若功能組織區(qū)的組織細(xì)胞采用成體組織細(xì)胞或成體干細(xì)胞，則對(duì)個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)供給含致病性藥物的培養(yǎng)液，使上述個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)產(chǎn)生病理癥狀；若功能組織區(qū)的組織細(xì)胞采用癌細(xì)胞，則不做致病性處理； 2)對(duì)個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)供給含不同種類和不同劑量治療性藥物的培養(yǎng)液，實(shí)時(shí)或后續(xù)搜集培養(yǎng)液； 3)分析上述已收集培養(yǎng)液，得到治療性藥物的種類、劑量對(duì)所述個(gè)性化復(fù)合結(jié)構(gòu)的作用，通過(guò)檢測(cè)、對(duì)比生物學(xué)指 標(biāo)，判斷藥物的作用。
9.如權(quán)利要求8所述的一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)用于藥物篩選的方法，其特征在于:所述生物學(xué)指標(biāo)為糖類脂類代謝指標(biāo)、肝功能指標(biāo)、腎功能指標(biāo)、癌細(xì)胞指標(biāo)和血管化指標(biāo)中的至少一種。
10.如權(quán)利要求8所述的一種個(gè)性化仿生復(fù)合結(jié)構(gòu)用于藥物篩選的方法，其特征在于:所述病理癥狀為糖尿病、器官炎癥、器官衰竭或腫瘤。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK103756955SQ201410030653
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】王小紅, 許雨帆 申請(qǐng)人:清華大學(xué)