干擾素調(diào)節(jié)因子9(irf9)及其抑制劑在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種干擾素調(diào)節(jié)因子9（IRF9）在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的應(yīng)用，屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明以IRF9基因敲除小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，通過結(jié)扎小鼠心臟左冠狀動脈前降支（LAD）造成心肌缺血再灌注損傷模型，結(jié)果表明與WT小鼠對比，IRF9基因敲除小鼠心肌梗死面積明顯減少，心功能明顯改善。從而發(fā)現(xiàn)IRF9基因在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的功能，主要體現(xiàn)在IRF9基因能夠惡化冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的作用。針對IRF9的上述功能，提供IRF9作為藥物靶標(biāo)在研制冠狀動脈粥樣硬化性心臟病藥物中應(yīng)用，及IRF9的抑制劑在制備治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病藥物中應(yīng)用。
【專利說明】干擾素調(diào)節(jié)因子9(IRF9)及其抑制劑在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的應(yīng)用
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種IRF9(interferon regulatoryfactor 9)及其抑制劑在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的應(yīng)用。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]心肌梗死(myocardial infarction, Ml)是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，是缺血性心臟病的常見類型，在急性心肌梗死發(fā)作后的幾分鐘內(nèi)，缺血中央?yún)^(qū)的心肌細(xì)胞便會由于缺血而死亡，是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的常見病之一。如何干預(yù)心肌缺血引發(fā)的心肌梗死及保護(hù)心臟愈來愈受到重視。而最有效挽救心肌梗塞的方法是盡快恢復(fù)缺血心肌的血流，即再灌注。目前，常采用溶栓療法、經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈血管成型術(shù)、動脈搭橋術(shù)、心臟外科體外循環(huán)等干預(yù)手段。然而，有效的再灌注只能挽救大約I / 3人的生命。
[0005]無論在發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家，急性心肌梗死均是導(dǎo)致成年人病殘和死亡的主要原因之一。雖然恢復(fù)心肌缺血區(qū)支配血管的血流灌注是改善患者生存率的主要治療，但是血流灌注的恢復(fù)亦可導(dǎo)致“再灌注損傷”。心肌缺血/再灌注損傷(myocardialischemia / reperfusion i njury, MIRI)是指心肌在短時(shí)間內(nèi)血供中斷,恢復(fù)血供后一定時(shí)間內(nèi)，原缺血心肌發(fā)生較血供恢復(fù)前更為嚴(yán)重的損傷。一般認(rèn)為缺血的組織、器官在可逆損傷以前得到再灌注便可存活并恢復(fù)，但發(fā)現(xiàn)在有些情況下，經(jīng)過一定時(shí)間缺血的組織器官并未發(fā)生明顯的功能結(jié)構(gòu)改變，在得到血液再灌注時(shí)卻發(fā)生了不可逆性的損傷。有研究表明已經(jīng)發(fā)生嚴(yán)重的缺血性損傷的細(xì)胞，再灌注并不使其損傷減輕，反而會加速細(xì)胞的死亡。在缺血引起的心肌細(xì)胞損傷中，心肌細(xì)胞代謝率明顯降低，組織出現(xiàn)緩慢但較為明顯的損傷。如果在缺氧基礎(chǔ)上再復(fù)氧，這種損傷就會加快、加重。盡管再灌注重新提供給組織細(xì)胞氧及營養(yǎng)物質(zhì)，但這種再復(fù)氧反而加速機(jī)體損傷是因?yàn)樵購?fù)氧的同時(shí)也促進(jìn)氧自由基釋放。再灌注在機(jī)體多種病理、生理改變中發(fā)揮重要作用，缺血后再灌注將導(dǎo)致更嚴(yán)重的后果。研究發(fā)現(xiàn)，有多種因素在缺血再灌注損傷機(jī)制中發(fā)揮重要作用，包括炎癥過程、氧自由基損傷、鈣超載、氧化應(yīng)激等。
[0006]心肌缺血/再灌注損傷己引起廣大基礎(chǔ)和臨床工作者的高度重視，如何防治心肌缺血再灌注損傷的藥物已成為研究的熱點(diǎn)。然而，目前臨床所應(yīng)用的各種藥物均有一定的局限性，還不能滿足需要。尋找新的、安全有效的藥物用于防治心肌缺血再灌注損傷成為醫(yī)學(xué)研究的重要課題之一。
[0007]干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor, IRF)家族現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有10個成員，其組成為IRFl~IRF10?，F(xiàn)有的研究提示，IRF家族成員參與了廣泛的生物學(xué)過程，主要涉及天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞生長及生存、凋亡和增殖，參與造血，抗腫瘤形成等。IRF9又稱為P48,干擾素刺激基因因子(IFN-stimulated gene factor 3 y ,ISGF3 y)0目前有IRF-9的研究主要集中在抗病毒，IRF-9和HBV干擾素刺激應(yīng)答元件樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，其表達(dá)迅速上調(diào)可以增強(qiáng)IFN-α誘導(dǎo)的HBV mRNA水平的顯著抑制。最近有報(bào)道，小鼠在IRF9基因敲除(Knockout，KO)后，表現(xiàn)為增加小腸粘液和淋巴結(jié)里的T細(xì)胞及中性粒細(xì)胞數(shù)目，這提示IRF9與炎癥有著密切聯(lián)系。(Lohoff M等，Nature reviewsImmunology.2005;5 (2):125-35; Honda K等，Nature reviews Immunology.2006; 6(9):644-58.)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的首要目的在于提供IRF9作為藥物靶標(biāo)在篩選治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病藥物中應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供一種IRF9的抑制劑在制備治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病藥物中的應(yīng)用
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn): 本發(fā)明以IRF9基因敲除小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，通過結(jié)扎小鼠心臟左冠狀動脈前降支(LAD)造成心肌缺血再灌注損傷模型，結(jié)果表明與WT小鼠對比，IRF9基因敲除小鼠心臟梗死面積明顯減少，心功能明顯好轉(zhuǎn)。這提示IRF9基因具有惡化心臟功能的作用，能促進(jìn)心肌梗死的發(fā)展，IRF9基因發(fā)揮著促進(jìn)冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發(fā)生的作用。為研究防治冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的新靶點(diǎn)和新策略提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。
[0010]針對IRF9的上述功能，提供IRF9作為藥物靶標(biāo)在篩選治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病藥物中的應(yīng)用。
[0011]針對IRF9基因的上述功能，提供IRF9的抑制劑在制備治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病藥物中的應(yīng)用。
[0012]一種治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物，包含IRF9。
[0013]所述的IRF9的抑制劑優(yōu)選為IRF9基因的siRNA、IRF9基因的RNA干擾載體或IRF9的抗體中的一種。
[0014]本發(fā)明的研究成果表明，IRF9 KO小鼠在結(jié)扎冠狀動脈引起的心肌缺血再灌注損傷中，小鼠的心臟梗死面積明顯變小，心臟功能明顯好轉(zhuǎn)。證明IRF9基因在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病模型中有著重要的惡化作用。
[0015]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
1.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)IRF9基因的新功能，即IRF9基因能夠惡化冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的作用。
[0016]2.本發(fā)明針對IRF9在惡化冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的作用，為研制冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物提供靶標(biāo)。
[0017]3.本發(fā)明針對IRF9在惡化冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的作用，提供IRF9的抑制劑在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的應(yīng)用。
[0018]
【專利附圖】

【附圖說明】[0019]圖1是小鼠在MI手術(shù)后的梗死染色圖。
[0020]A為WT和IRF9-K0小鼠I/R手術(shù)后24h的TTC染色圖；
B為AAR面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖；C為梗死面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖；
圖2是WT和IRF9-K0小鼠I/R模型后的超聲檢測心功能結(jié)果圖。
[0021]A為收縮期末壓(mmHg)；
B為射血分?jǐn)?shù)(%)；
C為左室內(nèi)壓最大上升速率(mmHg/sec)；
D為左室內(nèi)壓最小上升速率(mmHg/sec)；
圖3是WT和IRF9-K0小鼠I/R模型后的TUNEL染色及結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖。
[0022]
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0024]實(shí)驗(yàn)用動物及飼養(yǎng):
實(shí)驗(yàn)動物:8-10周齡、體重在23.5-27.5g，背景為雄性C57BL/6品系的野生型小鼠(WT，購自北京華阜康生物科技有限公司)、IRF9基因敲除小鼠(IRF9-K0，C57BL/6J背景，購買自 RIKEN BRC 公司(BRC 編號:RBRC00916))。
[0025]飼養(yǎng)環(huán)境:所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心血管病研究所SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心。小鼠專用飼料由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供。飼養(yǎng)條件:室溫在22-24°C之間，濕度在40-70%之間，明暗交替照明時(shí)間為12h，自由飲水?dāng)z食。
[0026]【實(shí)施例1】心肌缺血/再灌注損傷(MIRI)模型獲得
1.實(shí)驗(yàn)動物分組:雄性C57BL/6品系小鼠(WT)、IRF9基因敲除小鼠(KO)通過結(jié)扎小鼠心臟左冠狀動脈前降支(LAD)造成心肌缺血/再灌注損傷模型。隨機(jī)分為4組，每組:C57BL/6品系小鼠假手術(shù)組(WT SHAM)及I/R術(shù)組(WT MI )、IRF9基因敲除小鼠假手術(shù)組(K0 SHAM)及 I/R 術(shù)組(K0 MI )。
[0027]2.1/R模型采用結(jié)扎小鼠心臟左冠狀動脈前降支(LAD)造成心肌缺血/再灌注損傷，模型操作流程:
2.1稱重麻醉備皮:用電子天平于動態(tài)模式下準(zhǔn)確稱取小鼠體重(g)，用雙蒸水準(zhǔn)確配置3%戊巴比妥鈉溶液，輕輕搖動使其充分溶解，采用80mg/kg體重劑量，計(jì)算所需戊巴比妥鈉溶液體積后用ImL注射器準(zhǔn)確抽取相應(yīng)體積溶液，行腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠充分麻醉倒(約3min)后，用小鼠剃毛器剃除小鼠胸部及腋下毛發(fā)(充分暴露手術(shù)區(qū))。
[0028]2.2氣管插管:麻醉一定時(shí)間(約20_30min)后，夾趾檢測無反應(yīng)即可開始手術(shù)。打開外置光源、顯微鏡開關(guān)，打開呼吸機(jī)，設(shè)置好各參數(shù)(呼吸頻率lOObpm、恒壓16-17mmHg)，將小鼠門齒用橡皮經(jīng)固定在自制斜面上，外置光源照向小鼠頸部，眼科鑷?yán)鲂∈笊囝^調(diào)節(jié)光源亮度及位置，此時(shí)可見小鼠聲門隨呼吸呈開閉運(yùn)動，聲門開啟時(shí)將氣管插管沿聲門送入氣管，取下小鼠接上呼吸機(jī)，觀察小鼠呼吸狀況，胸廓起伏與呼吸機(jī)頻率一致表示插管成功， 即可進(jìn)行下步手術(shù)，整個手術(shù)過程用加熱墊維持小鼠體溫在37°C左右。
[0029]2.3開胸:小鼠采用右側(cè)臥位，用醫(yī)用膠帶固定好小鼠四肢(左前肢位于右前肢前以充分暴露手術(shù)區(qū))，用醫(yī)用碘酊及75%醫(yī)用酒精對手術(shù)區(qū)皮膚進(jìn)行消毒清潔處理，用眼科剪在左前肢下0.5cm處沿肋骨走向剪開皮膚，逐層分離筋膜、肌肉等組織(盡量避開較大血管，若不能避免則先行阻斷再剪斷血管)，用顯微剪于三、四肋間打開胸腔充分暴露心臟，用顯微直鑷輕輕夾起少量心包并于左心耳下撕開少許心包，充分暴露左冠狀動脈前降支(LAD)或所在區(qū)域。
[0030]2.4結(jié)扎冠狀動脈:于顯微鏡下找到LAD走向或可能所在位置(小鼠LAD走行于左心耳與肺動脈圓錐間，多發(fā)出于左心耳下緣處)，用無齒持針器持取7-0帶針縫合線，于左心耳下緣Imm處進(jìn)針,肺動脈圓錐旁出針,進(jìn)針深度0.5mm,寬度為1mm,縫線從LAD下方穿過，穩(wěn)定5s后,在心臟表面結(jié)扎處放置一長度2mm,大小為10號的聚乙烯塑料棒(要求表面光滑，大小為取出棒后結(jié)扎線不會壓迫血管)，后在其上打一活結(jié)，輕拉以結(jié)扎LAD (力度以能完全阻斷LAD血流為準(zhǔn)，寧輕勿重)，剪去線頭，結(jié)扎成功，則可見左室前壁明顯由鮮紅色變?yōu)樯n白而不再恢復(fù)。(Sham組不結(jié)扎LAD，直接關(guān)胸)。
[0031]2.5缺血再灌:自結(jié)扎LAD成功，心肌缺血60分鐘時(shí)，打開胸腔，松開結(jié)扎線，用顯微鑷迅速準(zhǔn)確的抽去聚乙烯塑料棒,使結(jié)扎的LAD再通，缺血心肌恢復(fù)血流，完成心肌缺血再灌注，再灌注成功，可見因缺血而變蒼白的心肌重新恢復(fù)至鮮紅色，維持再灌注24h。
[0032]2.6關(guān)胸:缺血再灌完成后，6-0縫線完全縫合胸腔開口(保證無縫隙、無錯位)關(guān)閉胸腔，5mL注射器接套管經(jīng)切口插入胸腔，抽取ImL氣體，6-0縫線由內(nèi)向外逐層縫合各層肌肉，后用5-0縫線將皮膚切口縫合完整。
[0033]2.7術(shù)后管理:術(shù)后密切關(guān)注小鼠狀態(tài)，有無呼吸異常等。待小鼠自然蘇醒后將小鼠從呼吸機(jī)上取下并取下氣管插管，放入干凈的飼養(yǎng)籠，填寫手術(shù)記錄卡片，放回IVC籠架飼養(yǎng)，密切關(guān)注小鼠術(shù)后狀態(tài)以及死亡情況并做好相應(yīng)記錄。
[0034]【實(shí)施例2】2，3，δ-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC)-伊文思藍(lán)(Evans blue)雙染色測心肌梗死面積
缺血再灌注24h后，80mg/kg戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉小鼠，剪開胸腔，分離出主動脈，連同主動脈一起切取心臟，心臟保存在4°C生理鹽水中，將23號針頭置入升主動脈根部，不穿過主動脈瓣，結(jié)扎固定。準(zhǔn)備37°C 3-4 mL的TTC磷酸緩沖液(PH=7.4)從主動脈緩慢灌注心臟，當(dāng)心肌變?yōu)榇u紅色時(shí)停止注射。重新結(jié)扎LAD，然后通過主動脈均勻緩慢灌注約2mL 2.5%的伊文思藍(lán)，并使心肌缺血區(qū)域面朝上，防止流出的伊文思藍(lán)污染心臟表面。待心臟變藍(lán)后停止灌注并用生理鹽水充分沖洗，清潔心臟表面并擠壓心臟以排除殘留于心腔中伊文思藍(lán)。充分吸干心臟表面和心腔中的生理鹽水，保存于_20°C冰箱中。待心臟冷凍固定后，將心臟直于切片器中，從心尖開始連續(xù)切厚度為1_的切片，一共5片。
[0035]梗死面積測量:采用高分辨率解剖顯微鏡對每片心肌組織兩面進(jìn)行拍照。采用圖像分析軟件(IPP軟件)對切片分析，TTC染色后梗死區(qū)為白色，未梗死區(qū)為磚紅色，伊凡思藍(lán)染色后整片切片面積減去藍(lán)色區(qū)域?yàn)槿毖ｋU(xiǎn)區(qū)(AAR)。以缺血危險(xiǎn)區(qū)(AAR) /左心室區(qū)域(LV)百分比表示AAR面積，梗死區(qū)/ AAR百分比表示梗死面積。
[0036]TTC是脂溶性光敏感復(fù)合物，它是呼吸鏈 中吡啶一核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色，而缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降，不能反應(yīng)，故不會產(chǎn)生變化呈蒼白色。在體染色梗死區(qū)、缺血區(qū)和非缺血區(qū)的邊界較離體染色清晰，以心肌橫截面能清晰區(qū)分白色為梗死區(qū)，紅色為缺血區(qū)，藍(lán)色為非缺血區(qū)。[0037]小鼠TTC染色及梗死面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖1。經(jīng)過I/R缺血60min再灌注24小時(shí)后，IRF9-K0小鼠梗死面積較野生型小鼠降低。
[0038]【實(shí)施例3】心肌缺血再灌注模型小鼠心功能檢測 I PV檢測血流動力學(xué)
1.1前期準(zhǔn)備
(I)麻醉機(jī)準(zhǔn)備:先連接氧氣瓶和麻醉機(jī)上的進(jìn)氣接口，再擰開麻醉機(jī)上加藥口密封蓋，迅速加入異氟烷至安全刻度后擰緊密封蓋。擰開氧氣瓶上總閥門，調(diào)整流量控制閥的旋鈕，出氣壓力維持在0.2-0.3mPa。
[0039](2)待測小鼠準(zhǔn)備:待檢測小鼠用異氟烷迅速麻醉后，左胸前區(qū)剃毛，將處理好的小鼠頭部伸入麻醉劑導(dǎo)管套頭內(nèi)，以1.5-2.0%異氟烷維持小鼠穩(wěn)定的麻醉狀態(tài)。
[0040]1.2 PV 檢測
碘酒及75%酒精消毒后，剪開小鼠頸部皮膚，依次分離肌肉和軟組織，并游離出右頸總動脈，于血管下穿過雙線并結(jié)扎遠(yuǎn)心端，同時(shí)活結(jié)結(jié)扎近心端。用血管剪在遠(yuǎn)心端剪一切口(1/3-1/2管徑)，于體視顯微鏡下將Millarl.4F超微導(dǎo)管迅速插入右頸總動脈，同時(shí)穿一縫線將導(dǎo)管和血管結(jié)扎。打開近心端活結(jié)，將導(dǎo)管沿右頸總動脈-升主動脈插入左心室內(nèi)，連接Powerlab生物信號采集處理系統(tǒng)。觀察記錄儀上波形情況，調(diào)節(jié)導(dǎo)管的位置使波形圖清晰且穩(wěn)定。監(jiān)測小鼠心功能指標(biāo)。測量小鼠收縮期末壓(End-systolic Pressure)、射血分?jǐn)?shù)(Ejection Fraction)、左室內(nèi)壓最大上升速率(dP/dt max)及左室內(nèi)壓最小上升速率(dP/dt mi η)等指 標(biāo)。
[0041]由Laplace定理可知:S=Pr/2h,P為心室內(nèi)壓，r為心腔內(nèi)徑，h為心壁厚度。在心臟壓力負(fù)荷過重的情況下，為適應(yīng)心臟做功增加，室壁厚度增加，左室室壁應(yīng)力增加，提高心臟收縮功能起到早期代償?shù)臋C(jī)制；但持續(xù)的壓力超負(fù)荷，可促進(jìn)心肌肥厚，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的壞死及凋亡，心臟的收縮和/或舒張功能受到損害，最終發(fā)展為慢性心力衰竭甚或心源性猝死。本研究運(yùn)用心臟血流動力學(xué)檢測評價(jià)心功能。
[0042]圖2是WT和IRF9-K0小鼠I/R模型后的血流動力學(xué)檢測結(jié)果。與WT SHAM組相t匕，WT小鼠I/R術(shù)后24h表現(xiàn)出心功能減弱。通過血流動力學(xué)指標(biāo)的檢測，我們觀察到術(shù)后 24h WT 小鼠收縮期末壓(End-systolic Pressure)、射血分?jǐn)?shù)(Ejection Fraction)、左室內(nèi)壓最大上升速率(dP/dt max)及左室內(nèi)壓最小上升速率(dP/dt min)均比其SHAM組降低，KO小鼠術(shù)后Ejection Fraction, dp/dt max和dp/dt min則比WT組要高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0043]【實(shí)施例4】小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況測定檢測
1.取材
(I)前期工作:預(yù)先準(zhǔn)備裝有20mL的10%甲醛的尿杯，并貼好標(biāo)簽(小鼠編號、組別、手術(shù)類型及取材日期)。將倒?jié)M10%KC1溶液的培養(yǎng)皿置于取材處。打開分析天平，調(diào)零備用，再稱重處死小鼠。
[0044](2)取材:眼科彎鑷夾住心耳下方的血管蒂，剪下心臟，迅速置于10%KC1溶液中。待心臟停跳在舒張期后，置于滅菌紗布上，輕輕擠壓心腔內(nèi)液體，蘸干表面液體后，稱重并記錄，將心臟放入相應(yīng)的尿杯中，固定48h后用于病理學(xué)檢測。
[0045]2.病理學(xué)檢測2.1制備石臘標(biāo)本切片
制備石蠟標(biāo)本切片，主要操作程序包括修剪心臟一包埋框處理一流水沖洗一脫水一透明一浸蠟一包埋一切片一攤片一晾干或烘烤后備用。
[0046]2.2 TUNEL 染色
用 TUNEL 試劑盒染色檢測凋亡。(TUNEL 試劑盒:ApopTag? Plus In Situ ApoptosisFluorescein Detection Kit (S7111, Chemicon)):
1)將石蠟切片置于烤箱中，60°C烤片30分鐘；
2)二甲苯，5分鐘X3次；
3)100%乙醇，5分鐘X 2次；95%乙醇，5分鐘；70%乙醇，5分鐘；
4)ddH20漂洗，5分鐘X2次；
5)蛋白酶K37°C孵育15分鐘；
6)PBS 漂洗 5minX2 次；
7)直接滴加EquilibrationBuffer于組織上(13 μ L/cm2),室溫孵育至少IOs ；
8)棄去Equilibration Buffer,滴加 TdT Enzyme 工作液(77ulReaction Buffer+33ulTdT Enzyme)于 組織上(11 μ 1/cm2),于濕盒于 37°C孵育 Ih ；
9)將切片置于盛有Stop/Wash Buffer 工作液(lml Stop/Wash Buffer+34ml ddH20)的染色缸中振蕩15s后室溫孵育IOmin (等待過程中，將適當(dāng)量的Ant1-DigoxigeninConjugate吸出，至于EP管中，避光放置在室溫下，使其平衡至室溫)；
10)PBS 漂洗 IminX3 次；
11)輕輕甩去組織多余殘留的液體，將組織周圍液體吸3滴加Ant1-DigoxigeninFluorescein 工作液(53%Blocking Solution+47%Anti_Digoxigenin Conjugate))于組織上(13 μ L/cm2),于濕盒中室溫避光孵育30min ；
12)PBS漂洗2minX4次(每次換新的PBS)；
13)SlowFadeGold antifade reagent with DAPI (Invitrogen ,S36939)封片；突光鏡下觀察，拍照。若需保存，于暗濕盒中4°C保存。
[0047]心肌組織由心肌細(xì)胞和間質(zhì)組織組成，心臟是一終末分化器官，心肌細(xì)胞失去增殖能力，各種生理或病理性刺激引起的心肌細(xì)胞反應(yīng)，只能是單個細(xì)胞的體積增大而不能
在數(shù)量上增殖。
[0048]心肌組織細(xì)胞凋亡情況測定結(jié)果見圖3所示，我們檢測了 IRF9-K0小鼠和野生型小鼠術(shù)后24小時(shí)心肌細(xì)胞凋亡情況。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測顯示，IRF9-K0小鼠肝細(xì)胞凋亡明顯比野生型小鼠降低，這提示IRF9與心肌細(xì)胞缺血/再灌注時(shí)死亡相關(guān)。這些結(jié)果表明，抑制IRF9表達(dá)可以改善心肌組織缺血/再灌注損傷，且可能與心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。
[0049]我們的研究成果表明，IRF9基因敲除小鼠在結(jié)扎心臟左冠狀動脈前降支(LAD)造成心肌缺血/再灌注損傷中，我們發(fā)現(xiàn)IRF9基因敲除后，小鼠心臟梗死面積明顯減少，心功能明顯好轉(zhuǎn)。證明IRF9基因在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病模型中有著重要的惡化作用。
[0050]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種IRF9作為藥物靶標(biāo)在篩選治療腦卒中疾病藥物中的應(yīng)用。
2.—種IRF9的抑制劑在制備治療腦卒中疾病藥物中的應(yīng)用。
3.一種治療腦卒中疾病的藥物，其特征在于:包含IRF9。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用或權(quán)利要求3所述的藥物，其特征在于:所述的IRF9的抑制劑為IRF9基因的siRNA、IRF9基因的RNA干 擾載體或IRF9的抗體中的一種。
【文檔編號】C12Q1/68GK103784972SQ201410031556
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】李紅良, 張曉東, 蔣丁勝, 張艷, 萬埝, 劉小熊 申請人:武漢大學(xué)