基于微流控微珠陣列芯片和dna聚合酶介導(dǎo)引物延伸技術(shù)的微小核糖核酸檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了基于微流控微珠陣列芯片和DNA聚合酶介導(dǎo)引物延伸技術(shù)的微小核糖核酸檢測(cè)方法。本發(fā)明是將生物素修飾的微小核糖核酸捕獲探針通過(guò)生物素-親合素結(jié)合方法固定于親合素修飾微球的表面形成功能化微球，該微球固定在微流控芯片檢測(cè)區(qū)的相應(yīng)微型小室中，形成微流控微珠陣列檢測(cè)芯片；然后將含有微小核糖核酸的樣品溶液流入微流控微珠陣列檢測(cè)芯片，再流入DNA聚合酶溶液及生物素化延伸底物，最后流入親合素標(biāo)記的量子點(diǎn)，然后計(jì)算流入微小核糖核酸后微球表面熒光進(jìn)行定性和定量。本發(fā)明高靈敏、高特異的檢測(cè)微小核糖核酸，實(shí)現(xiàn)了總RNA樣品中微小核糖核酸的特異及靈敏的定量分析。
【專利說(shuō)明】基于微流控微珠陣列芯片和DNA聚合酶介導(dǎo)引物延伸技術(shù)的微小核糖核酸檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微全分析系統(tǒng)的生物學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及的是基于微流控微珠陣列芯片和DNA聚合酶介導(dǎo)引物延伸技術(shù)的微小核糖核酸檢測(cè)方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]微小核糖核酸MicroRNA (miRNA)是一種小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，大約由21-25個(gè)核苷酸組成，通常靶向一個(gè)或者多個(gè)mRNA，通過(guò)翻譯水平的抑制或斷裂靶標(biāo)mRNAs而調(diào)芐基因的表達(dá)。至今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 3000多個(gè)miRNA，其中大部分在動(dòng)物體內(nèi)都起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用，是最主要的基因表達(dá)調(diào)控因子之一，據(jù)估計(jì)人體內(nèi)大約2 / 3的基因都受到某個(gè)或一組miRNA的調(diào)控。因此發(fā)展miRNA的新型檢測(cè)方法對(duì)于醫(yī)學(xué)臨床診斷具有重要意義。已發(fā)展的miRNA檢測(cè)方法主要有微陣列芯片雜交分析技術(shù)、基于miRNA的RT-PCR技術(shù)、酶促發(fā)光技術(shù)、深度測(cè)序技術(shù)、電化學(xué)方法、微流控微陣列技術(shù)、微陣列RNA引物延伸技術(shù)及微球酶標(biāo)記等技術(shù)，這類技術(shù)大都檢測(cè)靈敏度有限，而且需要較大體積的檢測(cè)溶液，使得在高靈敏微量分析領(lǐng)域的應(yīng)用受到局限。微流控微珠陣列芯片是微流控芯片研究領(lǐng)域中發(fā)展的一種新型芯片模式，其優(yōu)勢(shì)包括:傳感微球能夠提供較大的表面積用于識(shí)別分子的固定；微球均相識(shí)別過(guò)程減少了反應(yīng)時(shí)間；探針陣列形成過(guò)程和修飾過(guò)程的分離減少了成本；反應(yīng)在微流控芯片中進(jìn)行，極大減少了樣品量且提高了檢測(cè)靈敏度。該技術(shù)的發(fā)展較好解決了微量樣品條件下高通量、高靈敏檢測(cè)的難題，同時(shí)檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單，不需要昂貴的檢測(cè)儀器，為發(fā)展未來(lái)自動(dòng)化高性能生物分子檢測(cè)平臺(tái)技術(shù)提供了新的方向，該技術(shù)用于微小核糖核酸的分析未見報(bào)道。
[0003]利用去除外切酶活性的Klenow DNA聚合酶介導(dǎo)的引物延伸技術(shù)檢測(cè)miRNA，由于采用了常規(guī)雜交及酶促延伸雙重特異性，與其他技術(shù)比較，該技術(shù)特異性較好，同時(shí)雜交前miRNA不需要標(biāo)記，雜交后也不需要信號(hào)放大，極大簡(jiǎn)化了反應(yīng)流程，增加了結(jié)果的可靠性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了基于微流控微珠陣列芯片和DNA聚合酶介導(dǎo)引物延伸技術(shù)的微小核糖核酸檢測(cè)方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]基于微流控微珠陣列芯片和DNA聚合酶介導(dǎo)引物延伸技術(shù)的微小核糖核酸檢測(cè)方法，其步驟如下:
[0007](I)生物素修飾的微小核糖核酸捕獲探針通過(guò)生物素-親合素結(jié)合方法固定于親合素修飾微球的表面形成功能化微球，該微球固定在微流控芯片檢測(cè)區(qū)的相應(yīng)微型小室中，形成微流控微珠陣列檢測(cè)芯片；
[0008](2)將含有微小核糖核酸的樣品溶液流入步驟(1)中形成的微流控微珠陣列檢測(cè)芯片，微小核糖核酸與微球表面的捕獲探針雜交形成DNA / RNA 二聚體；[0009](3)流入DNA聚合酶溶液及生物素化延伸底物，以微小核糖核酸為引物，捕獲探針為模版，通過(guò)DNA聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)，將生物素化延伸底物增加在微小核糖核酸的3’末端；其中介導(dǎo)反應(yīng)時(shí)間為15~20min ；
[0010](4)流入親合素標(biāo)記的量子點(diǎn)，該量子點(diǎn)能與微小核糖核酸上結(jié)合的生物素識(shí)別并固定；
[0011](5)通過(guò)計(jì)算流入微小核糖核酸后微球表面熒光進(jìn)行定性和定量。
[0012]所述的微小核糖核酸檢測(cè)方法，步驟(1)中，所述的捕獲探針的3’末端包含由10個(gè)胸腺嘧啶和10個(gè)胞嘧啶構(gòu)成的伸展序列；5’末端包含由5個(gè)胸腺嘧啶構(gòu)成的模版序列。
[0013]所述的微小核糖核酸檢測(cè)方法，步驟(1)中，所述的微球是二氧化硅微球、聚苯乙烯類有機(jī)聚合物微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的一種。
[0014]所述的微小核糖核酸檢測(cè)方法，步驟(2)中，所述的微小核糖核酸與微球表面的捕獲探針雜交的時(shí)間為25~35min。
[0015]所述的微小核糖核酸檢測(cè)方法，步驟(3)中，所述的DNA聚合酶為去除外切酶活性的Klenow DNA聚合酶；生物素化延伸底物為biotin-11-dATP，其濃度為0.5~1.5 μ M。
[0016]所述的微小核糖核酸檢測(cè)方法，步驟(4)中，所述的量子點(diǎn)為CdSe、CdTe、CdS和復(fù)合型量子點(diǎn)中的一種；其發(fā)射范圍為400nm~700nm。
[0017]本發(fā)明微流控微珠陣列芯片具有微量檢測(cè)和高通靈敏檢測(cè)的雙重特性，能夠較好的解決微小核糖核酸分析方法中微量檢測(cè)、高靈敏檢測(cè)以及高通量分析等性能難以兼容的問(wèn)題，尤其適合顯微切割樣品和微創(chuàng)手術(shù)樣品檢測(cè)微小核糖核酸；本發(fā)明利用了常規(guī)雜交及酶促延伸技術(shù)的雙重特異性，能夠?qū)崿F(xiàn)具有少數(shù)幾個(gè)堿基差異的微小核糖核酸的識(shí)別，能夠識(shí)別miRNA-29家族中的miRNA-29a、miRNA_29b和miRNA_29c (2-3個(gè)堿基差異)，且靈敏度高，能夠檢測(cè)0.1pM的微小核糖核酸，而且實(shí)現(xiàn)了總RNA樣品中微小核糖核酸的特異及準(zhǔn)確的定量分析；本發(fā)明的建立為微小核糖核酸的微量及高靈敏檢測(cè)提供了一種有力的檢測(cè)手段。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為本發(fā)明的基于微流控微珠陣列芯片和DNA聚合酶介導(dǎo)引物延伸的微小核糖核酸檢測(cè)原理示意圖；
[0019]圖2為本發(fā)明實(shí)施例的微流控芯片內(nèi)外檢測(cè)微小核糖核酸的靈敏度對(duì)比曲線圖；
[0020]圖3為本發(fā)明實(shí)施例的總RNA樣品檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0022]參照?qǐng)D1，是本發(fā)明方法的原理示意圖。圖1所示的具體原理如下:
[0023]首先，將生物素修飾的微小核糖核酸捕獲探針2(3’末端包含由10個(gè)胸腺嘧啶和10個(gè)胞嘧啶構(gòu)成的伸展序列(TC tag)，5’末端包含由5個(gè)胸腺嘧啶構(gòu)成的模版序列(Poly (dT) 5)修飾到親和素修飾的微球表面1，制備出可用于微小核糖核酸檢測(cè)的功能化微球3 ;流入微小核糖核酸檢測(cè)目標(biāo)4，與芯片內(nèi)的功能化微球雜交，捕獲探針與微小核糖核酸通過(guò)雜交結(jié)合并固定在微球表面5 ;流入生物素修飾的延伸底物6和去除外切酶活性的Klenow DNA聚合酶7，通過(guò)延伸反應(yīng)將生物素修飾的底物6增加到微小核糖核酸4的3，末端，通過(guò)該方式將生物素基團(tuán)增加到微球表面8 ;然后流入親和素修飾的量子點(diǎn)9，量子點(diǎn)利用親和素與生物素的結(jié)合特性固定在微球表面形成了識(shí)別微球10 ;最后根據(jù)識(shí)別微球表面熒光信號(hào)獲取檢測(cè)信息。
[0024]實(shí)施例
[0025](I)用于微小核糖核酸檢測(cè)的功能化聚苯乙烯微珠的制備:采用10-30 μ m親和素修飾聚苯乙烯微球作為微小核糖核酸捕獲探針固定的固相界面，取100 μ L質(zhì)量百分濃度為1% -3%的親和素修飾微球于離心管中，用100 μ L親和洗脫液(20mM Tris pH7.5，IMNaCl, ImM EDTA, 0.0005% wt Triton X-100)洗漆兩次，離心條件為 3500rpm, 5min,去上清；然后加入44 μ L的親和洗脫液、3 μ L0.1-0.3 μ M如表1所示的微小核糖核酸捕獲探針，常溫孵育15-30min ;通過(guò)離心洗滌方法去除未結(jié)合的分子并將功能化微球懸浮于100 μ L親和洗脫液。捕獲探針通過(guò)修飾的生物素與微球表面的親和素特異性結(jié)合并固定在微球表面，從而形成了具有微小核糖核酸檢測(cè)能力的功能化聚苯乙烯微球。
[0026](2)微流控微珠陣列芯片的制備:首先將設(shè)計(jì)的芯片結(jié)構(gòu)圖樣通過(guò)繪圖軟件(CorelDRAW9.0)繪制出來(lái)，并以2400dpi的分辨率打印在Kodak的菲林膠片上制備出芯片的光掩膜；然后將光掩膜的圖案通過(guò)紫外曝光的方法轉(zhuǎn)移到覆蓋有光刻膠的PCB板上，并用化學(xué)刻蝕方法在曝光PCB板上制備出芯片的陽(yáng)模板；最后將聚二甲基硅氧烷前聚體與固化劑按質(zhì)量比10: I比例混合后于真空泵中除去氣泡，然后平鋪在芯片陽(yáng)模板上(厚約1mm)。直于65 C供箱中3h,待固化后取出，將聚二甲基硅氧烷(PDMS)片基從陽(yáng)I旲板上剝尚下來(lái)。功能化微球通過(guò)微珠裝載片基固定在以微型小室為單位構(gòu)成的陣列中；功能化微珠固定后，剝離微珠裝載片基并將微球固定陣列片基和試劑傳送片基貼合構(gòu)建檢測(cè)芯片。
[0027]表1合成的寡核苷酸探針(5’ -3’端)
[0028]
【權(quán)利要求】
1.基于微流控微珠陣列芯片和DNA聚合酶介導(dǎo)引物延伸技術(shù)的微小核糖核酸檢測(cè)方法，其特征是，其步驟如下: (1)生物素修飾的微小核糖核酸捕獲探針通過(guò)生物素-親合素結(jié)合方法固定于親合素修飾微球的表面形成功能化微球，該微球固定在微流控芯片檢測(cè)區(qū)的相應(yīng)微型小室中，形成微流控微珠陣列檢測(cè)芯片； (2)將含有微小核糖核酸的樣品溶液流入步驟(1)中形成的微流控微珠陣列檢測(cè)芯片，微小核糖核酸與微球表面的捕獲探針雜交形成DNA / RNA 二聚體； (3)流入DNA聚合酶溶液及生物素化延伸底物，以微小核糖核酸為引物，捕獲探針為模版，通過(guò)DNA聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)，將生物素化延伸底物增加在微小核糖核酸的3’末端；其中介導(dǎo)反應(yīng)時(shí)間為15~20min ； (4)流入親合素標(biāo)記的量子點(diǎn)，該量子點(diǎn)能與微小核糖核酸上結(jié)合的生物素識(shí)別并固定; (5)通過(guò)計(jì)算流入微小核糖核酸后微球表面熒光進(jìn)行定性和定量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小核糖核酸檢測(cè)方法，其特征是，步驟(1)中，所述的捕獲探針的3’末端包含由10個(gè)胸腺嘧啶和10個(gè)胞嘧啶構(gòu)成的伸展序列；5’末端包含由5個(gè)胸腺嘧啶構(gòu)成的模版序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小核糖核酸檢測(cè)方法，其特征是，步驟(1)中，所述的微球是二氧化硅微球、聚苯乙烯類有機(jī)聚合物微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小核糖核酸檢測(cè)方法，其特征是，步驟(2)中，所述的微小核糖核酸與微球表面的捕獲探針雜交的時(shí)間為25~35min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小核糖核酸檢測(cè)方法，其特征是，步驟(3)中，所述的DNA聚合酶為去除外切酶活性的Klenow DNA聚合酶；生物素化延伸底物為biotin-11-dATP，其濃度為0.5~1.5 μ M。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小核糖核酸檢測(cè)方法，其特征是，步驟(4)中，所述的量子點(diǎn)為CdSe、CdTe, CdS和復(fù)合型量子點(diǎn)中的一種；其發(fā)射范圍為400nm~700nm。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103834726SQ201410032429
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月24日
【發(fā)明者】張何, 傅昕, 劉媛, 朱振軍 申請(qǐng)人:湖南工程學(xué)院