雞外周血單核淋巴細(xì)胞pd-l2重組質(zhì)粒的構(gòu)建、基因豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子病理學(xué)與免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及雞外周血單核淋巴細(xì)胞PD-L2重組質(zhì)粒的構(gòu)建、基因豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法及其應(yīng)用。通過采集雛雞淋巴細(xì)胞的總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；采用普通PCR擴(kuò)增PD-L2目的基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并回收純化；將PD-L2目的基因片段與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，提取重組質(zhì)粒；經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測(cè)序分析，選取與目的基因片段相同序列的陽(yáng)性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，按拷貝濃度繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)熒光信號(hào)變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出PD-L2的基因豐度；本發(fā)明的PD-L2基因豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法具有檢測(cè)通量高、敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、成本低及定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】雞外周血單核淋巴細(xì)胞PD-L2重組質(zhì)粒的構(gòu)建、基因豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子病理學(xué)與免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及雞外周血單核淋巴細(xì)胞PD-L2重組質(zhì)粒的構(gòu)建、基因豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】[0002]雞傳染性法氏囊病(infectious bursal disease, IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)引起雛雞的一種急性、高度接觸性傳染病。研究表明，IBDV感染后可引起機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)和持續(xù)性感染。病毒感染的靶器官為法氏囊，病毒在B細(xì)胞內(nèi)復(fù)制導(dǎo)致法氏囊淋巴濾泡損傷、破壞，B淋巴細(xì)胞溶解。同時(shí)，病毒在法氏囊單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)復(fù)制導(dǎo)致炎性介質(zhì)的大量分泌、病毒擴(kuò)散和損傷加劇，形成敗血性休克綜合征，導(dǎo)致嚴(yán)重的B細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制，并加劇了病雞的死亡。另外，IBDV感染后前B淋巴細(xì)胞增殖的抑制和凋亡的發(fā)生，也是造成體液免疫抑制的重要原因。
[0003]程序性死亡配體(PD-L2)及其程序性死亡受體-1 (PD-1)是⑶28 / B7超家族成員，其表達(dá)相對(duì)較局限，主要表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞上，如活化的巨噬細(xì)胞、DC等。有研究證明，人和鼠的TO-L2 mRNA在胎盤、肝癌細(xì)胞、乳癌細(xì)胞、和神經(jīng)母細(xì)胞中呈高表達(dá)。但在脾臟、淋巴結(jié)、胸腺和成纖維組織中呈低表達(dá)，這使得其和I3D-Ll與其他B7家族成員在表達(dá)譜上有很大的差異。在免疫調(diào)節(jié)方面，PD-L2與其受體TO-1共同介導(dǎo)ro-l:PD-L信號(hào)通路的激活，在中樞免疫和外周免疫反應(yīng)中傳遞免疫耐受和免疫抑制信號(hào)，對(duì)抗原特異性T、B細(xì)胞的功能、T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的分泌和殺傷能力都有抑制作用，阻斷該通路后可以恢復(fù)T細(xì)胞的大部分功能。經(jīng)相關(guān)研究證實(shí)，一些病毒的感染可以誘導(dǎo)ro-L2及其受體ro-1的表達(dá)，從而影響ro-1: PD-Ls通路，使病毒逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視與殺傷，引起機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制和持續(xù)性感染。因此，PD-L2及其受體ro-1近年來(lái)逐漸成為人們?cè)诼猿掷m(xù)性病毒感染、免疫耐受性疾病、腫瘤等免疫抑制性疾病研究中所關(guān)注的熱點(diǎn)，而在動(dòng)物免疫抑制性疾病或病毒持續(xù)性感染方面，T細(xì)胞免疫抑制通路ro-1=PD-Ls的研究才剛剛起步，特別是在家禽類方面的研究還少見報(bào)道。
[0004]近年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-Time PCR)技術(shù)為基因豐度檢測(cè)提供了全新的方法，和傳統(tǒng)的方法相比，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、成本低以及定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，它可以通過檢測(cè)目標(biāo)序列PCR擴(kuò)增的熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的。然而對(duì)雞外周血單核細(xì)胞中ro-L2基因的豐度的Real-Time PCR檢測(cè)體系建立及應(yīng)用的研究尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于:本發(fā)明提供了一種雞外周血單核淋巴細(xì)胞ro-L2實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法；
在此基礎(chǔ)上本發(fā)明建立了一種ro-L2基因豐度的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)；
本發(fā)明通過研究外周血單核細(xì)胞中PD-L2的變化規(guī)律，為雞H)-L2分子檢測(cè)的定量分析提供了技術(shù)平臺(tái)，并能用于分析雞感染免疫抑制性疾病如IBD后TO-L2基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化規(guī)律中。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:
雞外周血單核淋巴細(xì)胞PD-L2實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
采集雛雞的外周血，分離出淋巴細(xì)胞，提取淋巴細(xì)胞的總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA保存于-20°C，采用普通PCR方法擴(kuò)增TO-L2目的基因片段；
采用普通PCR方法擴(kuò)增PD-L2目的基因片段，將該目的基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并回收純化；然后將TO-L2目的基因純化片段與pMD 18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5 α中，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測(cè)序分析，得到與目的基因片段相同序列的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒；
其中普通PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系為25 μ L，反應(yīng)體系如下:2 μ L樣品cDNA模板，2.5 μ L10XPCR Buffer,2y L dNTP，濃度為20Mmol/L的正向引物和反向引物各0.5 μ L，0.5 μ L的TaqDNA聚合酶，其余為無(wú)菌三蒸水；
正向引物 F: 5' - CCGCAATGGGAAAGCAC -3'，
反向引物 R: 5' - TGACGCTGGTAATGTGAAGGA -3'。
[0007]所述目的基因片段為序列表的SEQ ID N0.1序列。
[0008]其中普通PCR反應(yīng)程序:95°C熱啟動(dòng)Imin ;94°C變性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s, 30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0009]一種雞外周血單核淋巴細(xì)胞H)-L2基因的豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，包括以下步驟:
(1)將回收純化的ro-L2目的基因片段與pMD 18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，提取重組質(zhì)粒；經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測(cè)序分析，選取與H)- L2目的基因片段相同序列的陽(yáng)性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的DNA濃度，并換算成質(zhì)粒的拷貝濃度，按I: 10倍的濃度梯度稀釋陽(yáng)性質(zhì)粒；
(2)以稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)熒光信號(hào)的變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出樣品DNA中H)- L2的基因豐度；
其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20 μ L，包括2 μ L質(zhì)粒模板，濃度為20Mmol/L的正向引物F和反向引物R各0.2 μ L，SYBR Green I PreMix ΙΟμ?，三蒸水7.6 μ L ；其中，正向引物 F: 5' - CCGCAATGGGAAAGCAC -3'，
反向引物 R: 5' - TGACGCTGGTAATGTGAAGGA -3'。
[0010]所述目的基因片段為序列表的SEQ ID N0.1序列。
[0011]其中熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C熱啟動(dòng)30s ;94°C變性5s ;60°C退火和延伸34s，60 V時(shí)收集熒光信號(hào)，再40個(gè)循環(huán)。
[0012]所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為ABI 7500 Fast型熒光定量PCR儀。
[0013]所述稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒濃度范圍為為4.95X 1010-4.95X 101 copies/μ L ;所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.995，斜率為-3.808。[0014]所述的檢測(cè)方法在分析雞感染免疫抑制性疾病后ro-L2基因的轉(zhuǎn)錄水平變化規(guī)律中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明的積極有益效果:
本發(fā)明建立了雞外周血單核細(xì)胞中PD-L2基因豐度的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，為更好的對(duì)雞免疫抑制狀態(tài)下H)-L2的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行準(zhǔn)確定量，進(jìn)而研究外周血單核細(xì)胞中PD- L2的變化規(guī)律，為雞TO-L2分子檢測(cè)的定量分析提供了技術(shù)平臺(tái)，并為TO-L2在雞免疫抑制性疾病中發(fā)揮的生物學(xué)功能及其應(yīng)用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
[0016]本發(fā)明所公開的技術(shù)方案與傳統(tǒng)技術(shù)相比，敏感性較高，利用所建立的方法對(duì)IO9~IO1 copies/yL的9組不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示:本發(fā)明中TO-L2的檢測(cè)下限為10 copies/μ L，其濃度與Ct值之間有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 ；利用建立的方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，變異系數(shù)均在3%以內(nèi)，本發(fā)明具有較好的重復(fù)性；從溶解曲線圖可知，PD-L2分子溶解曲線出現(xiàn)單一狹窄峰(圖4)，且瓊脂糖凝膠電泳分析表明，Real-time RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果為單一特異性目的片段(圖5)，說明本發(fā)明具有較好的特異性；另外本發(fā)明還具有檢測(cè)通量高、操作簡(jiǎn)便、成本低以及定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)。
[0017]本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，雞傳染性法氏囊病病毒IBDV感染后，隨著病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制ro- L2的表達(dá)量逐漸升高，說明IBDV的感染及病毒載量與雞ro-L2基因豐度的變化關(guān)系十分密切；并證實(shí)了雞IBDV感染后ro-L2表達(dá)變化與IFN-Y、IL-2細(xì)胞因子的表達(dá)變化之間存在一定關(guān)系，雞ro-L2表達(dá)升高后激活了 ro-1 =PD-Ls信號(hào)通路，引起了雞T細(xì)胞免疫功能和增殖活性的下降，導(dǎo)致康復(fù)雞或亞臨床感染雞免疫抑制反應(yīng)的持續(xù)存在。
[0018]本發(fā)明的雞ro-L2基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，為檢測(cè)雞感染免疫抑制性疾病(如雞傳染性法氏囊病IBD、雞馬立克氏病MD、雞傳染性貧血CIA，雞白血病ALD和雞網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病RE等)所導(dǎo)致的免疫抑制狀態(tài)中TO-L2的表達(dá)變化規(guī)律提供了一種技術(shù)平臺(tái)，從而進(jìn)一步豐富了雞免疫抑制性疾病`引起免疫抑制的機(jī)理。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為瓊脂糖凝膠檢測(cè)雞ro-L2基因擴(kuò)增結(jié)果；
圖2為雞ro-L2實(shí)時(shí)熒光定量分析擴(kuò)增曲線；
圖3為雞ro-L2實(shí)時(shí)熒光定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖4為雞ro-L2實(shí)時(shí)熒光定量分析標(biāo)準(zhǔn)品溶解曲線；
圖5為雞ro- L2實(shí)時(shí)熒光定量產(chǎn)物特異性分析結(jié)果；
圖6為雞感染IBDV不同時(shí)期T細(xì)胞中ro-L2基因的拷貝數(shù)；
圖7為雞感染IBDV不同時(shí)期體內(nèi)IBDV病毒載量半定量PCR檢測(cè)結(jié)果；
圖8為雞感染IBDV不同時(shí)期IFN-Y基因的拷貝數(shù)；
圖9為雞感染IBDV不同時(shí)期IL-2基因的拷貝數(shù)；
圖10為實(shí)驗(yàn)組雞感染IBDV康復(fù)后胸腺T細(xì)胞增殖活檢測(cè)；
圖11為對(duì)照組雞感染IBDV康復(fù)后胸腺T細(xì)胞增殖活檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】[0020]在本發(fā)明中，基因拷貝數(shù)、基因豐度代表同樣的概念；Real-time PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR表示同樣的概念；ddH20表示雙蒸水；IBDV表示雞傳染性法氏囊病病毒；CFSE為一種可以標(biāo)記活體細(xì)胞的熒光染料。
[0021]實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌種:1日齡健康雛雞，SPF隔離器中飼養(yǎng)至4周齡；IBDV，LD50IOV0.1 mL，為本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，為本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0022]主要試劑和儀器:淋巴細(xì)胞分離液，購(gòu)自天津?yàn)?yáng)生物制品科技有限公司；IBDV快速檢測(cè)試紙條，購(gòu)自河南百奧生物工程有限公司；PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD 18-T載體，均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；SYBR Green I,購(gòu)自Invitrogen公司。
[0023]實(shí)施例1:雞H)-L2實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
采集4周齡雛雞的外周血，參照淋巴細(xì)胞分離液的說明書分離外周血的淋巴細(xì)胞，參照Invitrogen公司TRIzol試劑盒說明書和相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行總RNA的提取。提取的總RNA參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20°C備用，用于擴(kuò)增TO-L2目的基因片段的模板。
[0024]采用普通PCR方法擴(kuò)增TO-L2目的基因片段，將該目的基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并回收純化；然后將ro-L2目的基因純化片段與pMD 18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5ci中，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測(cè)序分析，得到與目的基因片段相同序列的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒；
所述目的基因片段為序列表中 的SEQ ID N0.1序列:
CCGCAATGGGAAAGCACTCACTTCATCCCAACATCATGATTACATGGGAAGAGCAGCACTGTTACGCAACGAA
TTGAAATTGGGACGTGCAATCCTTCACATTACCAGCGTCA。
[0025]用以構(gòu)建TO-L2實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的普通PCR反應(yīng)體系:
普通PCR反應(yīng)體系為25 μ L，反應(yīng)體系如下:2 μ L樣品DNA模板，陰性對(duì)照以無(wú)菌三蒸
水為模板，2.5μ L IOXPCR Buffer,2y L dNTP，正、反向引物各 0.5 μ L(20Mmol/L)，0.5 μ LTaqDNA聚合酶(大連寶生物工程公司)，其余體積以無(wú)菌三蒸水補(bǔ)足；反應(yīng)體系輕柔混合，于普通PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
[0026]普通PCR程序?yàn)?95°C熱啟動(dòng)Imin ;94°C變性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)。最后72°C延伸IOmin0
[0027]雞H)-L2實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物由某生物公司合成，引物序列如下:
正向引物 F: 5' - CCGCAATGGGAAAGCAC -3'，
反向引物 R: 5' - TGACGCTGGTAATGTGAAGGA -3'。
[0028]將普通PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖電泳分析，電壓100V，35min后在紫外燈下觀察產(chǎn)物，結(jié)果顯示擴(kuò)增出單一條帶，片段大小在IOObp左右。
[0029]擴(kuò)增結(jié)果見附圖1，圖中M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)，I為H)-L2基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增條帶教清晰，無(wú)引物二聚體影響。擴(kuò)增序列經(jīng)克隆、測(cè)序后，在GenBank中進(jìn)行核酸同源性的比對(duì)，結(jié)果顯示，獲得的序列SEQ ID N0.1與GenBank中雞PD- L2基因(XM424812)的序列同源性為100%，說明引物及擴(kuò)增產(chǎn)物都正確，可用于下一步實(shí)驗(yàn)研究。
[0030]將特異性片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后，進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化，將獲得的陽(yáng)性克隆交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。[0031]實(shí)施例2:雞PD-L2實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系的建立
(I)質(zhì)粒DNA模板的制備
利用實(shí)施例1瓊脂糖凝膠回收后的ro- L2目的基因片段與pMD 18-T載體(TaKaRa，大連)連接，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5ci中，提取重組質(zhì)粒；克隆篩選后進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果顯示與GenBank中PD-L2基因的序列100%同源，說明所獲得序列正確，陽(yáng)性質(zhì)粒可用于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制作。使用微量核酸蛋白分光光度儀測(cè)定該標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒DNA濃度為152.1 μ g/mL,將初始標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒溶液進(jìn)行1:10倍的倍比稀釋。
[0032](2)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度的計(jì)算和H)-L2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
提取經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，將獲得的質(zhì)粒DNA濃度換算成拷貝數(shù)。
[0033]質(zhì)?？截悢?shù)的計(jì)算方法為:拷貝數(shù)(copies/μ L)=濃度(μ g/μ L) X 6.02 X IO23 (copies/ μ L) / MW (g/mol)。
[0034]其中MW=(克隆載體長(zhǎng)度+目的片段長(zhǎng)度)(bp) X660 g/mol/ bp。
[0035]已知:cDNA=104.6 μ g/mL。質(zhì)粒PMD18-T序列長(zhǎng)度為2692bp，PD- L2基因插入片段長(zhǎng)度為113 bp，單個(gè)堿基的平均摩爾質(zhì)量為660 g/mol，計(jì)算公式為:
分子量(MW)= (2692+113) X660=1.85X IO6 g/mol。
[0036]質(zhì)?？截悵舛?6.02X IO23X ( 152.1 X 10_9)+ (1.85X 106)=4.95X IO10 copies/μ L0
[0037]將上述已知拷 貝濃度的質(zhì)粒溶液作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，在進(jìn)行Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí)按1:10倍梯度稀釋(濃度范圍為4.95X 1010-4.95 X IO1 copies/μ L)。
[0038]將已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。
[0039]以稀釋好的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)采用Real-timePCR試劑盒SYBR PremixExTaqTM (Invitrogen公司)，反應(yīng)體系為20μ L:2μ L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板，F(xiàn)、R 引物(20Mmol/L)各 0.2μ L，SYBR Green I PreMix (Real-time PCR 試劑盒 SYBRPremixExTaqTM, Invitrogen 公司)10KL,三蒸水 7.6 μ L。每次 Real-time PCR 反應(yīng)中均設(shè)置陰性對(duì)照(模板為2 μ LddH2O), Real-time PCR程序?yàn)?95°C熱啟動(dòng)30s ；94°C變性5s;60°C退火和延伸34s，60°C時(shí)收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。其中的F、R引物與實(shí)施例1相同。
[0040]標(biāo)準(zhǔn)曲線及所有待測(cè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)。反應(yīng)在ABI 7500定量PCR儀(美國(guó)Life Technologies)中進(jìn)行，利用ABI 7500軟件檢測(cè)和收集熒光信號(hào)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
[0041]ABI 7500軟件實(shí)時(shí)熒光定量分析軟件自行繪制出反應(yīng)的擴(kuò)增曲線(見附圖2)。擴(kuò)增曲線顯示，從左至右6條曲線依次代表標(biāo)準(zhǔn)品107、106、105、104、IO3UO2的梯度稀釋液的擴(kuò)增曲線，6個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線較光滑，呈現(xiàn)典型的S型，且各循環(huán)閾值(Ct值)間隔均勻。
[0042]根據(jù)擴(kuò)增曲線提供的標(biāo)準(zhǔn)品各濃度梯度及反應(yīng)的循環(huán)閾值(Ct值)，ABI 7500軟件自行繪制出反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見附圖3)。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.995，斜率為-3.808，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-3.808Χ + 45.293，其中Y為熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的Ct值，X為PD-L2基因構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值。計(jì)算其擴(kuò)增效率Eff%=83.074%,符合ABI 7500熒光定量分析對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求。
[0043]測(cè)定各濃度稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品在熒光定量PCR過程中的溶解溫度并繪制溶解曲線(見附圖4)。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的溶解曲線型峰單一，且標(biāo)準(zhǔn)品溶解溫度相同(80.0±0.5°C)，表明擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物溶解溫度均一，特異性好且無(wú)引物二聚體。
[0044]根據(jù)熒光信號(hào)的變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線即可測(cè)出樣品DNA中H)- L2的基因豐度。
[0045]實(shí)施例3:雞TO-L2實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系敏感性、特異性及重復(fù)性分析
采用實(shí)施例1構(gòu)建的雞ro-L2重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，采用實(shí)施例2所建立的雞ro-L2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀采用Life Technologies公司(美國(guó))生產(chǎn)的ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行。
[0046]用10倍系列稀釋的IO1~IO9 copies/μ L雞TO-L2陽(yáng)性重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明Η)-?2的檢測(cè)下限為10 copies/ μ L。
[0047]對(duì)雞H)-L2分子Real-time -PCR溶解曲線(見附圖4)及產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳做特異性分析，結(jié)果表明，溶解曲線出現(xiàn)單一狹窄峰，能夠擴(kuò)增到與預(yù)期目的片段同樣大小的特異性片段，沒有生成非特異性產(chǎn)物和引物二聚體(見附圖5)。
[0048]用建立的方法分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測(cè)，結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)小于3%，重復(fù)性良好(見附表1)。
[0049]表1雞H)-L2實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法批內(nèi)與批間重復(fù)性評(píng)價(jià)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.雞外周血單核淋巴細(xì)胞ro-L2實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: 采集雛雞的外周血，分離出淋巴細(xì)胞，提取淋巴細(xì)胞的總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA保存于-20°C，采用普通PCR方法擴(kuò)增TO-L2目的基因片段； 采用普通PCR方法擴(kuò)增TO-L2目的基因片段，將該目的基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并回收純化；然后將TO-L2目的基因純化片段與pMD 18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測(cè)序分析，得到與目的基因片段相同序列的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒； 其中普通PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系為25 μ L，反應(yīng)體系如下'2 μ L樣品cDNA模板，2.5 μ LIOXPCR Buffer,2y L dNTP，濃度為20Mmol/L的正向引物和反向引物各0.5 μ L，0.5 μ L的TaqDNA聚合酶，其余為無(wú)菌三蒸水； 其中，正向引物 F: 5' - CCGCAATGGGAAAGCAC -3'， 反向引物 R: 5' - TGACGCTGGTAATGTGAAGGA -3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于:所述目的基因片段為序列表的SEQID N0.1 序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法，其特征在于:其中普通PCR反應(yīng)程序:95°C熱啟動(dòng)Imin ;94°C變性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s, 30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。
4.一種雞外周血單核淋巴細(xì)胞TO-L2基因的豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: (1)將回收純化的H)-L2目的基因片段與pMD 18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，提取重組質(zhì)粒；經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測(cè)序分析，選取與H)- L2目的基因片段相同序列的陽(yáng)性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的DNA濃度，并換算成質(zhì)粒的拷貝濃度，按I: 10倍的濃度梯度稀釋陽(yáng)性質(zhì)粒； (2)以稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)熒光信號(hào)的變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出樣品DNA中H)- L2的基因豐度； 其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20 μ L，包括2 μ L質(zhì)粒模板，濃度為20Mmol/L的正向引物F和反向引物R各0.2 μ L，SYBR Green I PreMix 10μl，三蒸水7.6 μ L ； 其中，正向引物 F: 5' - CCGCAATGGGAAAGCAC -3'， 反向引物 R: 5' - TGACGCTGGTAATGTGAAGGA -3'。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，其特征在于:所述目的基因片段為序列表的SEQ ID N0.1序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，其特征在于:其中熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C熱啟動(dòng)30s ;94°C變性5s ;60°C退火和延伸34s，60°C時(shí)收集熒光信號(hào)，再40個(gè)循環(huán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，其特征在于:所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為ABI 7500 Fast型熒光定量PCR儀。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，其特征在于:所述稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒濃度范圍為為4.95Χ1010Χ101 copies/μ L ;所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.995，斜率為-3.808。
9.權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法在分析雞感染免疫抑制性疾病后TO-L2基因的轉(zhuǎn)錄水平變化規(guī)律中的應(yīng)用。`
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103820481SQ201410037328
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月26日
【發(fā)明者】王選年, 孫國(guó)鵬, 王愛國(guó), 張艷芳, 朱艷平, 李鵬, 岳鋒, 張萬(wàn)方, 李博文, 楊媛, 阮濤, 王軍 申請(qǐng)人:新鄉(xiāng)學(xué)院