雞外周血單核淋巴細(xì)胞pd-1重組質(zhì)粒的構(gòu)建、基因豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子病理學(xué)與免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及雞外周血單核淋巴細(xì)胞PD-1重組質(zhì)粒的構(gòu)建、基因豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法及其應(yīng)用。通過(guò)采集雛雞淋巴細(xì)胞的總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；采用普通PCR擴(kuò)增PD-1目的基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并回收純化；將PD-1目的基因片段與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，提取重組質(zhì)粒；經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測(cè)序分析，選取與目的基因片段相同序列的陽(yáng)性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，按拷貝濃度繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)熒光信號(hào)變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出PD-1的基因豐度。本發(fā)明的PD-1基因豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法具有檢測(cè)通量高、敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、成本低及定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】雞外周血單核淋巴細(xì)胞PD-1重組質(zhì)粒的構(gòu)建、基因豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子病理學(xué)與免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及雞外周血單核淋巴細(xì)胞ro-1重組質(zhì)粒的構(gòu)建、基因豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]雞傳染性法氏囊病(infectious bursal disease, IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)引起雛雞的一種急性、高度接觸性傳染病。研究表明，IBDV感染后可引起機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)和持續(xù)性感染。病毒感染的靶器官為法氏囊，病毒在B細(xì)胞內(nèi)復(fù)制導(dǎo)致法氏囊淋巴濾泡損傷、破壞，B淋巴細(xì)胞溶解。同時(shí)，病毒在法氏囊單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)復(fù)制導(dǎo)致炎性介質(zhì)的大量分泌、病毒擴(kuò)散和損傷加劇，形成敗血性休克綜合征，導(dǎo)致嚴(yán)重的B細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制，并加劇了病雞的死亡。另外，IBDV感染后前B淋巴細(xì)胞增殖的抑制和凋亡的發(fā)生，也是造成體液免疫抑制的重要原因。
[0003]程序性死亡分子I (programmed death-1, F1D-1或0)279)是免疫球蛋白超家族成員之一，最早在T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)研究中發(fā)現(xiàn)，Ahmed及其同事在LCMV慢性感染小鼠模型中證實(shí)，PD-1是τ細(xì)胞表面的一種抑制性受體，阻斷ro-1與其配體的結(jié)合可以使病毒持續(xù)性感染時(shí)功能障礙或衰竭的CD8+ T細(xì)胞功能恢復(fù)。經(jīng)研究證實(shí)，當(dāng)T細(xì)胞受到一些激活因素刺激后，PD-1能夠被 誘導(dǎo)表達(dá)在⑶4+、⑶8+ T細(xì)胞、自然殺傷性T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞等表面。在免疫調(diào)節(jié)方面，PD-1與其配體ro-Ls共同介導(dǎo)ro-l = PD-Ls信號(hào)通路的激活，在中樞免疫和外周免疫反應(yīng)中傳遞免疫耐受和免疫抑制信號(hào)，對(duì)抗原特異性T、B細(xì)胞的功能、T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的分泌和殺傷能力都有抑制作用，阻斷該通路后可以恢復(fù)T細(xì)胞的大部分功能。經(jīng)相關(guān)研究證實(shí)，一些病毒的感染可以誘導(dǎo)ro-1及其配體ro-Ls的表達(dá)從而影響ro-l:PD-Ls通路，使病毒逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視與殺傷，引起機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制和持續(xù)性感染。因此，PD-1及其配體ro-Ls近年來(lái)逐漸成為人們?cè)诼猿掷m(xù)性病毒感染、免疫耐受性疾病、腫瘤等免疫抑制性疾病研究中所關(guān)注的熱點(diǎn)，而在動(dòng)物免疫抑制性疾病或病毒持續(xù)性感染方面，T細(xì)胞免疫抑制性受體ro-l = PD-Ls的研究才剛剛起步，特別是在家禽類該方面的研究還少見(jiàn)報(bào)道。
[0004]近年來(lái)，熒光定量PCR(Real-Time PCR)技術(shù)為基因豐度檢測(cè)提供了全新的方法，和傳統(tǒng)的方法相比，該方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、成本低以及定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，它可以通過(guò)檢測(cè)目標(biāo)序列PCR擴(kuò)增的熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的；然而對(duì)雞外周血單核細(xì)胞中ro-l基因豐度的Real-Time PCR檢測(cè)體系建立及應(yīng)用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于:本發(fā)明提供了一種雞外周血單核淋巴細(xì)胞ro-1實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法；在此基礎(chǔ)上本發(fā)明建立了一種ro-1基因豐度的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)；
本發(fā)明通過(guò)研究外周血單核細(xì)胞中ro-1的變化規(guī)律，為雞ro-1分子檢測(cè)的定量分析提供了技術(shù)平臺(tái)，并能用于分析雞感染免疫抑制性疾病如IBD后ro-1基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化規(guī)律。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:
雞外周血單核淋巴細(xì)胞ro-1實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
采集雛雞的外周血，分離出淋巴細(xì)胞，提取淋巴細(xì)胞的總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA保存于-20°C，備用；采用普通PCR方法擴(kuò)增ro-l目的基因片段，將該目的基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并回收純化，然后將ro-l目的基因純化片段與pMD 18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5 α中，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測(cè)序分析，得到與目的基因片段相同序列的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒；
普通PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系為25 μ L，反應(yīng)體系如下:2 μ L樣品cDNA模板，2.5 μ L10XPCR Buffer,2y L dNTP，濃度均為20μπιο1/1的正向引物和反向引物各0.5 μ L，0.5 μ L的TaqDNA聚合酶，其余為無(wú)菌三蒸水；
其中，正向引物 F 為:5' -GGACTACGGTGTGCTGGAGTT-3'，
反向引物 R 為:5' -TCTTTCC TCGCTCTGGTGTG-3'。
[0007]所述目的基因片段為序列表中的SEQ ID N0.1序列。
[0008]其中普通PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)程序?yàn)?95°C熱啟動(dòng)Imin ;94°C變性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s, 30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0
[0009]一種雞外周血單核淋巴細(xì)胞ro-1基因的豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，包括以下步驟:
(1)將回收純化的ro-l目的基因片段與pMD18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，提取重組質(zhì)粒；經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測(cè)序分析，選取與ro-l目的基因片段相同序列的陽(yáng)性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的DNA濃度，并換算成質(zhì)粒的拷貝濃度，按I: 10倍的濃度梯度稀釋陽(yáng)性質(zhì)粒；
(2)以稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)熒光信號(hào)的變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出樣品DNA中ro-1的基因豐度；
其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20 μ L，包括2 μ L質(zhì)粒模板，濃度均為20Mmol/L的正向引物F和反向引物R各0.2yL，SYBR Green I PreMix ΙΟμ?，三蒸水7.6μ L ；
其中，正向引物 F 為:5' -GGACTACGGTGTGCTGGAGTT-3'，
反向引物 R 為:5' -TCTTTCCTCGCTCTGGTGTG-3'。
[0010]所述目的基因片段為序列表中的SEQ ID N0.1序列。
[0011]其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C熱啟動(dòng)30s ;94°C變性5s ;60°C退火和延伸34s，60°C時(shí)收集熒光信號(hào)，再40個(gè)循環(huán)。
[0012]采用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為ABI 7500 Fast型熒光定量PCR儀。
[0013]所述稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒濃度范圍為4.36X 1010-4.36X IO1 copies/μ L ;所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=1.0，斜率為-3.484。
[0014]所述的檢測(cè)方法在分析雞感染免疫抑制性疾病后ro-1基因的轉(zhuǎn)錄水平變化規(guī)律中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明的積極有益效果:
本發(fā)明建立了雞外周血單核細(xì)胞中ro-1基因豐度的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，為更好地對(duì)雞免疫抑制狀態(tài)下ro-1的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行準(zhǔn)確定量，進(jìn)而研究外周血單核細(xì)胞中ro-1的變化規(guī)律，為雞ro-1分子檢測(cè)的定量分析提供了技術(shù)平臺(tái)，并為ro-1在雞免疫抑制性疾病中發(fā)揮的生物學(xué)功能及其應(yīng)用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
[0016]本發(fā)明所公開(kāi)的技術(shù)方案與傳統(tǒng)技術(shù)相比，PD-1檢測(cè)的敏感性較高，利用所建立的方法對(duì)IO9~lOkopies/y L的9組不同濃度標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示:本發(fā)明中ro-l的檢測(cè)下限為10 copies/μ L，其濃度與Ct值之間有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=I ;利用建立的方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明,變異系數(shù)均在3%以內(nèi)，具有較好的重復(fù)性；從溶解曲線圖可知，ro-Ι分子溶解曲線出現(xiàn)單一狹窄峰(圖4)，且瓊脂糖凝膠電泳分析表明，Real-time RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果為單一特異性目的片段(圖5)，說(shuō)明本發(fā)明具有較好的特異性；另外本技術(shù)方案還具有檢測(cè)通量高、操作簡(jiǎn)便、成本低以及定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)。
[0017]本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，雞傳染性法氏囊病病毒IBDV感染后，隨著病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制ro-Ι的表達(dá)量逐漸升高，說(shuō)明IBDV的感染及病毒載量與雞ro-1基因豐度的變化關(guān)系十分密切；并證實(shí)了雞IBDV感染后ro-l表達(dá)變化與IFN- y、IL-2細(xì)胞因子的表達(dá)變化之間存在一定關(guān)系，雞ro-Ι表達(dá)升高后激活了 ro-1 =PD-Ls信號(hào)通路，引起了雞τ細(xì)胞免疫功能和增殖活性的下降，導(dǎo)致康復(fù)雞或亞臨床感染雞免疫抑制反應(yīng)的持續(xù)存在。
[0018]本發(fā)明的雞ro-1基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，為檢測(cè)雞感染免疫抑制性疾病(如雞傳染性法氏囊病IBD、雞馬立克氏病MD、雞傳染性貧血CIA、雞白血病ALD和雞網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病RE等)所導(dǎo)致的免疫抑制狀態(tài)中ro-1的表達(dá)變化規(guī)律提供了技術(shù)平臺(tái)，進(jìn)一步豐富了雞免疫抑制性疾病引起免疫抑制的機(jī)理。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為瓊脂糖凝膠檢測(cè)雞ro-1基因擴(kuò)增結(jié)果；
圖2為雞ro-1實(shí)時(shí)熒光定量分析擴(kuò)增曲線；
圖3為雞ro-1實(shí)時(shí)熒光定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖4為雞ro-1實(shí)時(shí)熒光定量分析標(biāo)準(zhǔn)品溶解曲線；
圖5為雞ro-1實(shí)時(shí)熒光定量產(chǎn)物特異性分析結(jié)果；
圖6為雞感染IBDV不同時(shí)期τ細(xì)胞中ro-1基因的拷貝數(shù)；
圖7為雞感染IBDV不同時(shí)期體內(nèi)IBDV病毒載量半定量PCR檢測(cè)結(jié)果；
圖8為雞感染IBDV不同時(shí)期IFN-Y基因的拷貝數(shù)；
圖9為雞感染IBDV不同時(shí)期IL-2基因的拷貝數(shù)；
圖10為實(shí)驗(yàn)組雞感染IBDV康復(fù)后胸腺T細(xì)胞增殖活檢測(cè)；
圖11為對(duì)照組雞感染IBDV康復(fù)后胸腺T細(xì)胞增殖活檢測(cè)。 [0020]【具體實(shí)施方式】在本發(fā)明中，基因拷貝數(shù)、基因豐度代表同樣的概念；Real-time PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR表不同樣的概念；ddH20表不雙蒸水；IBDV表不雞傳染性法氏囊病病毒；CFSE為一種可以標(biāo)記活體細(xì)胞的突光染料。
[0021]實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌種:1日齡健康雛雞，SPF隔離器中飼養(yǎng)至4周齡；IBDV，LD50IOV0.1 mL，為本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，為本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0022]主要試劑和儀器:淋巴細(xì)胞分離液，購(gòu)自天津?yàn)?yáng)生物制品科技有限公司；IBDV快速檢測(cè)試紙條，購(gòu)自河南百奧生物工程有限公司；PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD 18-T載體，均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；SYBR Green I,購(gòu)自Invitrogen公司。
[0023]實(shí)施例1雞ro-l實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
采集4周齡雛雞外周血，參照淋巴細(xì)胞分離液的說(shuō)明書(shū)分離外周血的淋巴細(xì)胞，參照Invitrogen公司TRIzoI試劑盒說(shuō)明書(shū)和相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行總RNA的提取，將提取的總RNA參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于_20°C，用于擴(kuò)增ro-l目的基因片段的模板。
[0024]采用普通PCR方法擴(kuò)增ro-1目的基因片段，將該目的基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并回收純化，然后將ro-l目的基因純化片段與pMD 18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5 α中，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測(cè)序分析，得到與目的基因片段相同序列的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒；
所述目的基因片段為序列SEQ ID N0.1:
GGACTACGGTGTGCTGGAGTTCCAACGGGACCCACACAGCCAGGTGCCCCTCGAGACCTGCCCAGCCGAGCAGACCGAGTATGCCACCATCGTCTTCCCTGAGGAGAAACCCATCACACCAGAGCGAGGA AAGA。
[0025]用以構(gòu)建ro-l實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的普通PCR反應(yīng)體系:
普通PCR反應(yīng)體系為25 μ L，反應(yīng)體系如下:2 μ L樣品cDNA模板，陰性對(duì)照以無(wú)菌三
蒸水為模板，2.5μ L 的 IOXPCR Buffer,2y L dNTP，正、反向引物各 0.5 μ L (20Mmol/L),
0.5yL Taq DNA聚合酶(大連寶生物工程公司)，以無(wú)菌三蒸水補(bǔ)足25 μ L ;將反應(yīng)體系輕柔混合，于普通PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
[0026]普通PCR程序?yàn)?95°C熱啟動(dòng)Imin ;94 °C變性30s ;55 °C退火30s ;72 °C延伸30s, 30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0027]雞ro-l實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物由某生物公司合成，引物序列如下:
正向引物 F: 5' -GGACTACGGTGTGCTGGAGTT-3'；
反向引物-TCTTTCCTCGCTCTGGTGTG-3'。
[0028]將普通PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖電泳分析，電壓100V，35min后在紫外燈下觀察產(chǎn)物，結(jié)果顯示擴(kuò)增出單一條帶，片段大小在IOObp左右。
[0029]擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)附圖1，圖中M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)，I為H)_l基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增條帶較清晰，無(wú)引物二聚體影響。擴(kuò)增序列經(jīng)克隆、測(cè)序后，在GenBank中進(jìn)行核酸同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，獲得的序列SEQ ID N0.1與GenBank中雞I3D-1基因(XM422723)的序列同源性為100%，說(shuō)明引物及擴(kuò)增產(chǎn)物都正確，可用于下一步實(shí)驗(yàn)研究。
[0030]將特異性片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后，進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化，將獲得的陽(yáng)性克隆交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。
[0031]實(shí)施例2雞ro-1實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系的建立(I)質(zhì)粒DNA模板的制備
利用實(shí)施例1瓊脂糖凝膠回收后的ro-l目的基因片段與pMD 18-T載體(TaKaRa，大連)連接，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5ci中，提取重組質(zhì)粒；經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果顯示與GenBank中I3D-1基因的序列100%同源，說(shuō)明所獲得序列正確，陽(yáng)性質(zhì)?？捎糜谫|(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制作。使用微量核酸蛋白分光光度儀測(cè)定該標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的DNA濃度為135.5 μ g/mL,將初始標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒溶液進(jìn)行1:10倍的倍比稀釋。
[0032](2)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度計(jì)算和雞ro-1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
提取經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，將獲得的質(zhì)粒DNA濃度換算成拷貝數(shù)。
[0033]質(zhì)?？截悢?shù)的計(jì)算方法:拷貝數(shù)(copies/μ L)=濃度(μ g/μ L) X 6.02 X IO23 (copies/ μ L) / MW (g/mol)。
[0034]其中MW=(克隆載體長(zhǎng)度+目的片段長(zhǎng)度)(bp) X660 g/mol/ bp。
[0035]已知:cDNA=135.5μ g/mL，質(zhì)粒PMD18-T序列長(zhǎng)度為2692bp，PD-l基因插入片段長(zhǎng)度為134bp ;單個(gè)堿基的平均摩爾質(zhì)量為660 g/mol，計(jì)算公式為:
分子量(MW)= (2692+134) X 660=1.87 X IO6 g/mol。
[0036]質(zhì)?？截悵舛?6.02X IO23X ( 135.5X 10_9)+ (1.87X 106)=4.36X IO10 copies/μ L0
[0037]將上述已知拷貝濃度的質(zhì)粒溶液作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，在進(jìn)行Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí)按1:10倍梯度稀釋(濃度范圍為4.36X IO1c1UexiO1 copies/μ L)。將已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒進(jìn)行1:10倍梯度稀釋，獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。
[0038]以稀釋好的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)采用Real-timePCR試劑盒SYBR PremixExTaqTM (Invitrogen公司)。反應(yīng)體系為20 μ L:包括2 μ L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板，F(xiàn)、R 引物(20Mmol/L)各 0.2μ L，SYBR Green I PreMix (Real-time PCR 試劑盒SYBR PremixExTaqTM, Invitrogen 公司)IOKL,三蒸水 7.6 μ L。每次 Real-time PCR 反應(yīng)中均設(shè)置陰性對(duì)照(模板為2 μ LddH2OX
[0039]Real-time PCR程序?yàn)?95°C熱啟動(dòng)30s ;94°C變性5s ;60°C退火和延伸34s，60°C時(shí)收集熒光信號(hào)，再40個(gè)循環(huán)。其中的F、R引物與實(shí)施例1相同。
[0040]標(biāo)準(zhǔn)曲線及所有待測(cè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)。反應(yīng)在ABI 7500定量PCR儀(美國(guó)Life Technologies)中進(jìn)行，利用ABI 7500軟件檢測(cè)和收集熒光信號(hào)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。ABI 7500軟件實(shí)時(shí)熒光定量分析軟件自行繪制出反應(yīng)的擴(kuò)增曲線(見(jiàn)附圖2)。
[0041]擴(kuò)增曲線顯示從左至右6條曲線，依次代表標(biāo)準(zhǔn)品107、106、105、104、103、102的梯度稀釋液的擴(kuò)增曲線，6個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線較光滑，呈現(xiàn)典型的S型曲線，且各循環(huán)閾值(Ct值)間隔均勻。
[0042]根據(jù)擴(kuò)增曲線提供的標(biāo)準(zhǔn)品各濃度梯度及反應(yīng)的循環(huán)閾值(Ct值)，利用ABI7500軟件自行繪制出反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)附圖3)。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=1.0，斜率為-3.484，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Υ=_3.484Χ + 41.381，其中Y為實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的Ct值，X為PD-1基因構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)數(shù)值。計(jì)算其擴(kuò)增效率為Eff%=93.643%，符合ABI 7500熒光定量分析對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求。
[0043]測(cè)定各濃度稀 釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)時(shí)熒光定量PCR過(guò)程中的溶解溫度，并繪制溶解曲線(見(jiàn)附圖4)。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的溶解曲線型峰單一，且標(biāo)準(zhǔn)品溶解溫度相同(87.5±0.5°C)，表明擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的溶解溫度均一，特異性好，且無(wú)引物二聚體。
[0044]根據(jù)熒光信號(hào)的變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線即可測(cè)出樣品DNA中ro-l的基因豐度。
[0045]實(shí)施例3:雞ro-l實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系的敏感性、特異性及重復(fù)性分析
采用實(shí)施例1構(gòu)建的雞ro-Ι重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，采用實(shí)施例2所建立的雞ro-l實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀采用Life Technologies公司(美國(guó))生產(chǎn)的ABI 750熒光定量PCR儀。用1:10倍系列稀釋的101~IO109 copies/μ L雞PD-1陽(yáng)性重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明，PD-1的檢測(cè)下限為10 copies/μ L0
[0046]對(duì)雞ro-l分子Real-time-PCR溶解曲線(見(jiàn)附圖4)及產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳做特異性分析，結(jié)果表明，溶解曲線出現(xiàn)單一狹窄峰，能夠擴(kuò)增到與預(yù)期目的片段同樣大小的特異性片段，沒(méi)有生成非特異性的產(chǎn)物和引物二聚體(見(jiàn)附圖5)。
[0047]用本發(fā)明建立的方法分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測(cè)，結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)小于3%，重復(fù)性良好(見(jiàn)表1)。
[0048]表1雞ro-l實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法批內(nèi)與批間重復(fù)性評(píng)價(jià)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.雞外周血單核淋巴細(xì)胞ro-1實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: 采集雛雞的外周血，分離出淋巴細(xì)胞，提取淋巴細(xì)胞的總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA保存于-20°C，備用；采用普通PCR方法擴(kuò)增Η)-1目的基因片段，將該目的基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并回收純化，然后將ro-Ι目的基因純化片段與PMD 18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5 α中，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測(cè)序分析，得到與目的基因片段相同序列的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒； 普通PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系為25 μ L，反應(yīng)體系如下:2yL樣品cDNA模板，2.5yLIOXPCR Buffer,2y L dNTP，濃度均為20Mmol/L的正向引物和反向引物各0.5μ L，0.5μ L的TaqDNA聚合酶，其余為無(wú)菌三蒸水； 其中，正向引物 F 為:5' -GGACTACGGTGTGCTGGAGTT-3'， 反向引物 R 為:5' -TCTTTCCTCGCTCTGGTGTG-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于:所述目的基因片段為序列表中的SEQID N0.1 序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法，其特征在于:其中普通PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)程序?yàn)?95°C熱啟動(dòng)Imin ;94°C變性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0
4.一種雞外周血 單核淋巴細(xì)胞ro-1基因的豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: (1)將回收純化的ro-l目的基因片段與pMD18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，提取重組質(zhì)粒；經(jīng)克隆篩選后進(jìn)行測(cè)序分析，選取與ro-l目的基因片段相同序列的陽(yáng)性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的DNA濃度，并換算成質(zhì)粒的拷貝濃度，按I: 10倍的濃度梯度稀釋陽(yáng)性質(zhì)粒； (2)以稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)熒光信號(hào)的變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出樣品DNA中ro-1的基因豐度； 其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20yL，包括2yL質(zhì)粒模板，濃度均為20Mmol/L的正向引物F和反向引物R各0.2yL，SYBR Green I PreMix ΙΟμ?，三蒸水7.6μ L ； 其中，正向引物 F 為:5' -GGACTACGGTGTGCTGGAGTT-3'， 反向引物 R 為:5' -TCTTTCCTCGCTCTGGTGTG-3'。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，其特征在于:所述目的基因片段為序列表的SEQ ID N0.1序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，其特征在于:實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C熱啟動(dòng)30s;94°C變性5s;60°C退火和延伸34s，60°C時(shí)收集熒光信號(hào)，再40個(gè)循環(huán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，其特征在于:實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)時(shí)采用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為ABI 7500 Fast型熒光定量PCR儀。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的豐度實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，其特征在于:所述稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒濃度范圍為4.36X 1010-4.36 X IO1 copies/μ L ;所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=L 0，斜率為 _3.484。
9.權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法在分析雞感染免疫抑制性疾病后ro-1基因的轉(zhuǎn)錄水平變化規(guī)律中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK103789432SQ201410037329
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月26日
【發(fā)明者】王選年, 孫國(guó)鵬, 王愛(ài)國(guó), 朱艷平, 張艷芳, 岳鋒, 李鵬, 張萬(wàn)方, 李博文, 楊媛, 阮濤, 王軍 申請(qǐng)人:新鄉(xiāng)學(xué)院