一種基于免疫磁珠富集水體甲肝病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于免疫磁珠富集水體甲肝病毒的方法，其包括如下步驟：制備富集甲肝病毒的特異性免疫磁珠；免疫磁珠富集甲肝病毒；定量檢測甲肝病毒的富集效率。本發(fā)明構思合理，采用了免疫磁珠富集水體中甲肝病毒，突顯了操作簡便、特異性強、分離速度快、可重復性好，不需要昂貴的儀器設備等優(yōu)點。另外，本發(fā)明在1mg的活化磁珠與75μg甲肝病毒單克隆抗體偶聯(lián)時，可使病毒濃度為1.52×103拷貝/μl的300μl甲肝病毒水樣富集效率最高達64.54%；使病毒濃度為1.52×106拷貝/μl的300μl甲肝病毒水樣富集效率最高達91.45%。本方法對于富集水體中的甲肝病毒及其檢測具有重要意義。
【專利說明】一種基于免疫磁珠富集水體甲肝病毒的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術應用領域和環(huán)境監(jiān)測【技術領域】，具體采用免疫磁珠的免疫學反應原理及磁場力的特性富集水體中污染的甲肝病毒。
技術背景
[0002]甲肝病毒(!fepatitis A Virus，HAV)是一種RNA病毒，屬小RNA病毒科，嗜肝病毒屬，為常見的腸道病毒之一。甲肝病毒高濃度存在于感染者的糞便中，早在1973年，F(xiàn)einslone利用免疫電鏡技術在患病者的糞便樣品中觀測到了甲肝病毒(Martin andLemon2006)，它們主要通過糞-口途徑傳播，無論是直接從人到人的傳播或是接觸了受污染的食物或水域，都會引起暴發(fā)流行。甲肝病毒較一般腸道病毒抵抗力強，耐酸堿，室溫下可生存I周，在淡水、海水、污水以及海產(chǎn)品中(如毛蚶)存活數(shù)天至數(shù)月，25°C時在干糞中能生存30天。
[0003]我國是甲型肝炎的高發(fā)區(qū)，在衛(wèi)生條件比較差的農(nóng)村，由于無自來水設施，人們多飲用井水、河水。若不慎飲用了污染水源，極易引起感染；在一些城市和發(fā)達的江浙滬等地區(qū)，人群甲肝病毒的流行也呈逐年增加的趨勢，因此依然有暴發(fā)流行的可能，且這種危險將長期存在。由此可見找到高效準確檢測甲肝病毒方法的重要性。2012年國家飲用水衛(wèi)生監(jiān)督監(jiān)測工作方案明確規(guī)定將甲肝病毒列為水性疾病監(jiān)測的重要對象。
[0004]水體中甲肝病毒檢測的難點在于含量低、干擾測定的基體成分復雜，給準確測定造成了很大的困難。大部分水體需通過水樣體積的濃縮，先將病毒富集，才能進行檢測，但水中不必要的污染物也因此被富集，從而干擾實驗結果。如通常使用絮凝沉淀法對水樣進行濃縮，但其殘留的有機物質可能會對PCR的檢測結果造成影響。另外傳統(tǒng)的病毒富集檢測方法，如細胞培養(yǎng)病毒鑒定，在操作上比較耗時，在技術成本的花費上比較昂貴，而且甲肝病毒很難在體外環(huán)境下培養(yǎng)(Brooks, Gersberg et al.2005)。
[0005]免疫磁珠分離技術(Immunomagneticbeads separation techniques, I MBS)是上世紀后期發(fā)展起來的一項免疫學檢測和磁性分離相結合的免疫學技術。免疫磁珠以磁性微球為載體，通過功能基團(羧基、氨基、羥基、醛基等)共價結合免疫配基(酶、細胞、抗體、抗原、DNA、RNA等生物活性物質)，利用特異性的免疫學反應在外部磁場力的作用下分離檢測靶物質。其具有靈敏度高、分離速度快、特異性強、操作簡便、可重復性好，不需要昂貴的儀器設備等優(yōu)點。另外，免疫磁珠分離技術與熒光定量PCR檢測技術相結合，能有效祛除PCR反應的抑制物(Haramoto, Kitajima et al.2010)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種特異性強、操作簡便、省時高效的水體中甲肝病毒的富集方法，它以水體中的甲肝病毒為對象，采用免疫磁珠特異性吸附甲肝病毒，又在磁場力的作用下分離，實現(xiàn)水體中甲肝病毒的富集。
[0007]本發(fā)明解決其技術問題采用以下的技術方案:[0008]本發(fā)明提供的基于免疫磁珠富集水體甲肝病毒的方法，其步驟包括:
[0009](1)制備富集甲肝病毒的特異性免疫磁珠:
[0010]通過活化羧基磁珠，磁珠與甲肝病毒抗體偶聯(lián)和封閉的步驟制備所述特異性免疫磁珠；
[0011](2)免疫磁珠富集甲肝病毒:
[0012]將1mg制備的特異性免疫磁珠與300 μ I甲肝病毒吸附，室溫孵育2小時；
[0013](3)定量檢測甲肝病毒的富集效率:
[0014]提取甲肝病毒RNA，反轉錄成cDNA ;熒光定量PCR檢測水體富集的甲肝病毒拷貝數(shù)；計算甲肝病毒富集效率。
[0015]所述的定量檢測甲肝病毒的富集效率時，使用Trizol法提取病毒RNA，具體是:將吸附病毒的免疫磁珠加入600 μ I Trizol，室溫靜置5min ;再往EP管中加入300 μ I氯仿，震蕩30秒，在冰上放置5分鐘后，12000r/min、4°C離心15min，磁珠沉降在EP管底部；輕輕吸取上層水相液體，置于新的無RNA酶EP管中，余下部分丟棄，再加等體積的異丙醇和I μ IGlyco Blue Coprecip,震蕩后在 _20°C冰箱放置 2 分鐘，12000r/min、4°C離心 IOmin ;棄去上清液，加200ml75%乙醇進行洗滌，12000r/min、4°C離心IOmin ；、棄掉上清液，讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；用12 μ I Rnase-free water溶解RNA。
[0016]本發(fā)明使用的磁珠為以超順磁性Fe3O4為內(nèi)核、粒徑為3 μ m的羧基磁珠,使用的甲肝病毒抗體為VP2蛋白抗原決定簇的鼠源單克隆抗體。
[0017]所述的磁珠與抗體偶聯(lián)，當Img活化磁珠與75 μ g甲肝病毒單克隆抗體偶聯(lián)時，偶聯(lián)甲肝病毒抗體的量為≤17.26 μ g ;當Img活化磁珠與25-75 μ g甲肝病毒單克隆抗體偶聯(lián)時，甲肝病毒抗體的偶聯(lián)率為21.96-54.32%。
[0018]所述的免疫磁珠富集甲肝病毒，當Img的活化磁珠與75μ g甲肝病毒單克隆抗體偶聯(lián)時，免疫磁珠對甲肝病毒的富集效率最高，可達92.87% ；當1mg的活化磁珠與25-250 μ g甲肝病毒單克隆抗體偶聯(lián)時，富集300 μ I濃度7.99 X 105拷貝/ μ I甲肝病毒水樣，其富集效率為49.69-92.87%。
[0019]所述的Img免疫磁珠，其偶聯(lián)75 μ g甲肝病毒單克隆抗體的免疫磁珠時，使病毒濃度為1.52 X 103拷貝/ μ I的300 μ I甲肝病毒水樣富集效率最高達64.54% ;使病毒濃度為1.52 X 106拷貝/ μ I的300 μ I甲肝病毒水樣富集效率最高達91.45%。
[0020]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，主要有以下效果:
[0021]1.采用了免疫磁珠富集病毒與熒光定量PCR檢測相結合的技術，免疫磁珠富集病毒可有效消除富集濃縮時殘留的PCR抑制物，突顯了操作簡便、特異性強、分離速度快、靈敏度高、可重復性好，不需要昂貴的儀器設備等優(yōu)點。
[0022]2.使用Trizol法提取病毒RNA，可避免使用直接加熱法提取核酸分離磁珠與裂解緩沖液時，含有核酸的緩沖液體積的損失。
[0023]3.有效縮短了常規(guī)檢測致病微生物的過程中最為耗時的擴增培養(yǎng)微生物的步驟。
[0024]4.在Img活化磁珠與75yg甲肝病毒單克隆抗體偶聯(lián)時，可使病毒濃度為1.52X 103拷貝/μ I的300μ I甲肝病毒水樣富集效率最高達64.54%;使病毒濃度為
1.52 X 106拷貝/ μ I的300 μ I甲肝病毒水樣富集效率最高達91.45%。【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為免疫磁珠富集水體中甲肝病毒的工作流程圖。
【具體實施方式】
[0026]以下詳細描述本發(fā)明的實施例，這些實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不應當作對本發(fā)明的限制。
[0027]本發(fā)明采用無錫知益微球科技有限公司的羧基磁珠，磁珠以超順磁性Fe3O4為內(nèi)核，粒徑為3 μ m,濃度為25mg/ml,羧基密度≥2.8 μ mol/mg。甲肝病毒抗體采用北京科興中維生物技術有限公司針對甲肝病毒VP2蛋白抗原決定簇的鼠源單克隆抗體，其蛋白濃度為lmg/ml。
[0028]實施例1.偶聯(lián)最佳抗體量的活化磁珠富集病毒的效率
[0029]1.富集甲肝病毒的特異性免疫磁珠制備:
[0030](I)活化羧基磁珠:
[0031]取2mg(25mg/ml)充分搖勻的羧基磁珠至2ml離心管中，再加Iml濃度為0.01M的2-(4-嗎啉)乙磺酸(MEST，pH5.0,0.05%Tween-20)活化緩沖液在渦旋混合器上混合均勻，將離心管置于磁分離器上，待磁珠被完全吸附后，棄掉上清液；再加入Iml MEST活化緩沖液將磁珠洗滌2遍后，分別加入300 μl濃度為5mg/ml的活化試劑碳二亞胺(EDC，由0.01MρΗ5.0的MES緩沖液配制)和300 μl濃度為5mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS,由0.01MPH5.0的MES緩沖液配制)溶液，經(jīng)渦旋儀混勻，固定在靜音混合器上，37°C活化45min。用磁分離器分離磁珠，棄掉上清液，加500 μl pH7.4PBS緩沖液洗滌3次，每次洗滌需在混合器上充分混合，再加入200 μlPBS緩沖液，懸浮磁珠。
[0032](2)磁珠與甲肝病毒抗體偶聯(lián):
[0033]取6份Img的活化磁珠分別置于2ml離心管中，各加入甲肝病毒單克隆抗體10、25、50、75、100、250μ g (用PBS緩沖液補齊至500 μ 1)，用渦旋儀混勻，固定在靜音混合器上，37°C偶聯(lián)2小時。用磁分離器分離磁珠，收集各管上清液。用BCA蛋白濃度測定試劑盒(購自碧云天生物技術研究所)檢測上述各管中上清液剩余的抗體量，用酶標儀測其OD值，可得Img磁珠偶聯(lián)的抗體量，并依此計算其偶聯(lián)率。
[0034]往上述剩余的磁珠中加入500 μl PBS (或用500 μl PBS+0.1%BSA)緩沖液，在搖床上震蕩5min，用磁分離器分離磁珠，棄掉上清液；再加500 μl PBS (或用500 μlPBS+0.1%BSA)緩沖液洗滌2次，去除未與磁珠結合的抗體。
[0035]由表1可知，當Img活化磁珠與75 μ g甲肝病毒單克隆抗體偶聯(lián)時，偶聯(lián)甲肝病毒抗體的量最大為17.26 μ g。當Img活化磁珠與25-75 μ g甲肝病毒單克隆抗體偶聯(lián)時，甲肝病毒抗體的偶聯(lián)率為21.96-54.32%。
[0036](3)封閉:
[0037]在上述6份磁珠的離心管中，加入500 μ 11%BSA (由ρΗ7.4的PBS緩沖液配制)封閉液，經(jīng)渦旋儀混勻，固定在靜音混合器上，37°C封閉I小時(或者4°C封閉過夜)。
[0038]用磁分離器分離磁珠，棄掉上清封閉液，加500 μl PBS (或用500 μlPBS+0.1%BSA)緩沖液洗滌3次，每次洗滌需在混合器上充分混合，最后加入300 μl PBS緩沖液，貯存于4°C以備用。[0039]2.免疫磁珠富集甲肝病毒:
[0040]此6份Img免疫磁珠各加入300 μ I濃度為7.99X IO5拷貝/μ I的甲肝病毒(即凍干甲型肝炎減毒活疫苗，購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所)，用渦旋儀混勻，固定在靜音混合器上，室溫孵育2小時。用磁分離器分離磁珠，棄掉上清液，加500 μ I PBS (或用500 μ I PBS+0.1%BSA)緩沖液，在搖床上震蕩5min，用磁分離器分離磁珠，棄掉上清液；再加500 μ I PBS (或用500 μ I PBS+0.1%BSA)緩沖液洗滌2次，去除未吸附病毒。
[0041]3.定量檢測甲肝病毒的富集效率:
[0042](I) Trizol 法提取病毒 RNA:
[0043]將上述吸附病毒的免疫磁珠從離心管轉移到無RNA酶的EP管中，用磁分離器分離磁珠，棄掉上清液，加入600 μ I Trizol，室溫靜置5min ;再往EP管中加入300 μ I氯仿，震蕩30秒，在冰上放置5分鐘后，12000r/min、4°C離心15min，磁珠沉降在EP管底部；輕輕吸取上層水相液體，置于新的無RNA酶EP管中，余下部分丟棄，再加入等體積的異丙醇和I μ IGlyco Blue Coprecip (Invitrogen)，震蕩后在-20°C冰箱放置 2 分鐘，12000r/min、4°C離心IOmin ;棄去上清液,加200ml75%乙醇(Rnase-free water配制)進行洗漆，12000r/min、4°C離心IOmin ;棄掉上清液,讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；用12μ I Rnase-free water溶解RNA。
[0044]反轉錄:12μ I 的 RNA template 加入 0.5 μ I 的 Random hexamer primer(20 μ Μ)、
0.5 μ I的01igo(dt)(20 μ M)?；旌暇鶆蚝?，將各反應管置于PCR儀中，70°C，5min,馬上冰浴5min,繼續(xù)加入:5μ I 的 5 X r`eaction buffer (Promega) > I μ I 的 Ribolockribo nucleaseinhibitor (20U/μ I TaKaRa)、5μ I 的 dNTP mix (2.5mM TaKaRa)U μ I 的 M-MLV Reversetranscriptase (200U/ μ I Promega)?；旌暇鶆颍糜?PCR 儀中，42°C, 60min; 95°C, 5min,反應完成后將產(chǎn)物置于_20°C備用。
[0045](2) SYBR Green熒光定量PCR檢測甲肝病毒的富集效率
[0046]用熒光定量PCR檢測富集甲肝病毒的拷貝數(shù)，反應體系:cDNA模板IyLJOyM甲肝病毒正反向引物各 0.5 μ L、2XSsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad) 10 μ L、用 ddH20補足20 μ L。反應條件:95°C 3min,以95°C 10s、55°C 30s擴增40個循環(huán)，熔點曲線繪制溫度 55? ~95?。
[0047](3)甲肝病毒富集效率的計算:
[0048]公式如下:
[0049]
m _/η/ 富集甲肝病毒的拷貝數(shù)(拷貝/uL).π.回收率(％)=加入甲肝病毒的拷貝數(shù)(拷貝/μι) X 100%
[0050]根據(jù)表2中的計算結果，當Img的活化磁珠與75 μ g甲肝病毒單克隆抗體偶聯(lián)時，免疫磁珠對甲肝病毒的富集效率最高，可達92.87%，此結果與Img的活化磁珠與75 μ g甲肝病毒單克隆抗體偶聯(lián)時偶聯(lián)量最大的結果相一致。當Img的活化磁珠與25-250 μ g甲肝病毒單克隆抗體偶聯(lián)時，富集300 μ I濃度7.99 X IO5拷貝/ μ I甲肝病毒水樣，其富集效率可達 49.69-92.87%。
[0051]實施例2.單位免疫磁珠吸附甲肝病毒的能力
[0052]1.單位免疫磁珠吸附甲肝病毒:[0053]濃度為1.52 X IO6拷貝/ μ I的甲肝病毒，按1:10、1:100、1:1000的比例稀釋。取4份Img免疫磁珠(偶聯(lián)75 μ g甲肝病毒單克隆抗體的免疫磁珠)分別與原濃度、1:10、1:100、1:1000稀釋的300 μ I病毒吸附，室溫孵育2小時。用磁分離器分離磁珠，棄掉上清液，加500 μ I PBS (或用500 μ I PBS+0.1%BSA)緩沖液，在搖床上震蕩5min，用磁分離器分離磁珠，棄掉上清液；再加500 μ I PBS (或用500 μ I PBS+0.1%BSA)緩沖液洗滌2次，去除未吸附病毒。
[0054]2.定量檢測甲肝病毒的富集效率
[0055](I) Trizol 法提取病毒 RNA:
[0056]將上述吸附病毒的免疫磁珠從離心管轉移到無RNA酶的EP管中，用磁分離器分離磁珠，棄掉上清液，加入600 μ I Trizol，室溫靜置5min ;再往EP管中加入300 μ I氯仿，震蕩30秒，在冰上放置5分鐘后，12000r/min、4°C離心15min，磁珠沉降在EP管底部；輕輕吸取上層水相液體，置于新的無RNA酶EP管中，余下部分丟棄，再加等體積的異丙醇和I μ IGlyco Blue Coprecip (Invitrogen),震蕩后在 _20°C冰箱放置 2 分鐘，12000r/min、4°C離心IOmin ;棄去上清液，加200ml75%乙醇(Rnase-free water配制)進行洗漆，12000r/min、4°C離心IOmin ；、棄掉上清液,讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；用12μ I Rnase-freewater 溶解 RNA。
[0057]反轉錄:12μ I 的 RNA template 加入 0.5 μ I 的 Random hexamer primer(20 μ Μ)、
0.5 μ I的01igo(dt)(20 μ M)。混合均勻后，將各反應管置于PCR儀中，70°C，5min,馬上冰浴5min,繼續(xù)加入:5μ I 的 5 X reaction buffer (Promega) > I μ I 的 Ribolockribo nucleaseinhibitor (20U/μ I TaKaRa)、5μ I 的 dNTP mix (2.5mM TaKaRa)U μ I 的 M-MLV Reversetranscriptase (200U/ μ I Promega)?；旌暇鶆颍糜?PCR 儀中，42°C, 60min; 95°C, 5min,反應完成后將產(chǎn)物置于_20°C備用。
[0058](2) SYBR Green熒光定量PCR檢測甲肝病毒的富集效率
[0059]用熒光定量PCR檢測富集甲肝病毒的拷貝數(shù)，反應體系:cDNA模板IyLJOyM甲肝病毒正反向引物各 0.5 μ L、2XSsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad) 10 μ L、用 ddH20補足20 μ L。反應條件:95°C 3min,以95°C 10s、55°C 30s擴增40個循環(huán)，熔點曲線繪制溫度 55? ~95?。
[0060](3)甲肝病毒富集效率的計算:
[0061]公式如下:
[0062]
【權利要求】
1.一種基于免疫磁珠富集水體甲肝病毒的方法，其特征在于采用包括以下步驟的方法: (1)制備富集甲肝病毒的特異性免疫磁珠: 通過活化羧基磁珠，磁珠與甲肝病毒抗體偶聯(lián)和封閉的步驟制備所述特異性免疫磁珠; (2)免疫磁珠富集甲肝病毒: 將Img制備的特異性免疫磁珠與300 μ I甲肝病毒吸附，室溫孵育2小時； (3)定量檢測甲肝病毒的富集效率: 提取甲肝病毒RNA，反轉錄成cDNA ;熒光定量PCR檢測水體富集的甲肝病毒拷貝數(shù)； 計算甲肝病毒富集效率。
2.如權利要求1所述的基于免疫磁珠富集水體甲肝病毒的方法，其特征在于所述的定量檢測甲肝病毒的富集效率時，使用Trizol法提取病毒RNA，具體是:將吸附病毒的免疫磁珠加入600 μ I Trizol，室溫靜置5min ;再往EP管中加入300 μ I氯仿，震蕩30秒，在冰上放置5分鐘后，12000r/min、4°C離心15min，磁珠沉降在EP管底部；輕輕吸取上層水相液體，置于新的無RNA酶EP管中，余下部分丟棄，再加等體積的異丙醇和1μ I Glyco BlueCoprecip，震蕩后在_20°C冰箱放置2分鐘，12000r/min、4°C離心IOmin ;棄去上清液，加200ml75%乙醇進行洗滌，12000r/min、4°C離心IOmin ；、棄掉上清液，讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；用12 μ I Rnase-free water溶解RNA。
3.如權利要求1所述的基于免疫磁珠富集水體甲肝病毒的方法，其特征在于使用的磁珠為以超順磁性Fe3O4為內(nèi)核 、粒徑為3 μ m的羧基磁珠，使用的甲肝病毒抗體為VP2蛋白抗原決定簇的鼠源單克隆抗體。
4.如權利要求1所述的基于免疫磁珠富集水體甲肝病毒的方法，其特征在于所述的磁珠與抗體偶聯(lián)，當Img活化磁珠與75 μ g甲肝病毒單克隆抗體偶聯(lián)時，偶聯(lián)甲肝病毒抗體的量為≤17.26 μ g ;當Img活化磁珠與25-75 μ g甲肝病毒單克隆抗體偶聯(lián)時，甲肝病毒抗體的偶聯(lián)率為21.96-54.32%。
5.如權利要求1所述的基于免疫磁珠富集水體甲肝病毒的方法，其特征在于所述的免疫磁珠富集甲肝病毒，當Img的活化磁珠與75 μ g甲肝病毒單克隆抗體偶聯(lián)時，免疫磁珠對甲肝病毒的富集效率最高，可達92.87% ;當Img的活化磁珠與25-250 μ g甲肝病毒單克隆抗體偶聯(lián)時，富集300 μ I濃度7.99X IO5拷貝/ μ I甲肝病毒水樣，其富集效率為49.69-92.87%。
6.如權利要求1所述的基于免疫磁珠富集水體甲肝病毒的方法，其特征在于所述的Img免疫磁珠，其偶聯(lián)75 μ g甲肝病毒單克隆抗體的免疫磁珠時，使病毒濃度為1.52 X IO3拷貝/ μ I的300 μ I甲肝 病毒水樣富集效率最高達64.54% ;使病毒濃度為1.52 X IO6拷貝/ μ I的300 μ I甲肝病毒水樣富集效率最高達91.45%。
【文檔編號】C12R1/93GK103805574SQ201410037509
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月26日 優(yōu)先權日:2014年1月26日
【發(fā)明者】胡國良, 喬煜婷, 曹華斌, 郭小權, 張彩英 申請人:江西農(nóng)業(yè)大學