Hla-b*15:02等位基因檢測方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于卡馬西平等精神類藥物用藥指導的HLA-B*15:02等位基因檢測方法，包括提供待測樣品、核酸擴增體系和熒光檢測體系混合物；通過擴增反應循環(huán)擴增靶多核苷酸；使熒光發(fā)生基團與被擴增的靶多核苷酸序列間接結合；測定熒光發(fā)生基團產(chǎn)生的熒光量，確定靶多核苷酸的存在及其相對量。本發(fā)明還公開了一種試劑盒，包括分別裝有反應液1、反應液2、反應液3、EZ?Taq酶混合液、標準液1、標準液2的多個密封離心管，分隔并集中包裝這些離心管的試劑盒。本發(fā)明可廣泛應用于人HLA-B*15:02等位基因的檢測和臨床上規(guī)避因該等位基因表達而與卡馬西平等精神類藥物相互作用引起的史蒂芬綜合征和中毒性表皮壞死松解癥。
【專利說明】HLA-B*15:02等位基因檢測方法及其試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種臨床上用于卡馬西平等精神類藥物用藥指導的HLA_B*15:02等位基因檢測方法及試劑盒，特別是涉及采用實時定量熒光聚合酶鏈反應技術對HLA-B*15:02等位基因的檢測，并將檢測結果應用于臨床上指導卡馬西平等精神類藥物使用的方法與試劑盒。
【背景技術】
[0002]藥物不良反應(adverse drug reactions,簡稱ADR)，按照WHO國際藥物監(jiān)測合作中心的規(guī)定，系指正常劑量的藥物用于預防、診斷、治療疾病或調節(jié)生理機能時出現(xiàn)的有害的和與用藥目的無關的反應。藥物不良反應，是病患者治療過程中的巨大隱患。據(jù)統(tǒng)計，每年全世界死于不合理用藥的人群總數(shù)量達1900萬人。在美國每年有220萬人在服用處方藥后會產(chǎn)生副作用。其中死亡的病例超過了 10萬，每年用于治療藥物副作用的支出就達40億美元。在我國，因藥物不良反應住院的病人每年約250萬人，直接死亡20萬人。用藥安全已經(jīng)成為醫(yī)學界的熱點問題。
[0003]HLA(human leukocyte antigen),即人類白細胞抗原是人體重要的免疫遺傳體系，也是目前所知人體最復雜的多態(tài)系統(tǒng)。HLA作為抗原刺激機體產(chǎn)生相應抗體的性質或分子結構，這是器官移植產(chǎn)生排異反應的主要原因，也是血清學和細胞學配型的基礎。在骨髓干細胞移植中最主要的排斥反應是移植物對宿主疾病(Graft Versus HostDisease，GVHD)，這主要是由于移植物中的免疫活性細胞(T細胞)識別并對移植物受體中的HLA和次要組織相容性產(chǎn)生反應的結果。因此在建立骨髓庫以及移植手術前必須進行分型。
[0004]近年的研究發(fā)現(xiàn)HLA的部分等位基因與某些藥物引起的不良反應密切關聯(lián)。如美國白種人群中進的卡馬西平-藥物超敏綜合征(CBZ-HSS)關聯(lián)性研究結果表明:HLA-B*0801、HLA-DR3和HLA-DQ2等位基因與CBZ-HSS具有相關性；卡馬西平(carbamazepine)、Iamotrigin`e 等精神類藥物引起史蒂芬 Stevens-Johnson 綜合征(SJS)和中毒性表皮壞死松解癥(TEN)與HLA-B*15:02等位基因HLA-A*31:01等們基因相關聯(lián)。在亞裔人群中以HLA-B*15:02為主，因此亞裔患者服用卡馬西平風險比西方人群高
10倍(Celeste B.L.Man, Patrick Kwan, et.Association between HLA-B □ 1502Alleleand Antiepileptic Drug-1nduced Cutaneous React ions in Han Chinese.Epilepsia, 48(5): 1015 1018，2007)。HLA等位基因的分型檢測可識別特定的HLA多態(tài)基因型。通過已知的多態(tài)基因型與藥物療效及毒性的關系，指導相關疾病的給藥，對規(guī)避藥物不良反應，倡導安全用藥有著重要的影響與意義。
[0005]目前，HLA等位基因分型檢測的常用方法主要是基于核酸序列識別的方法，主要有PCR-SSOP(Sequence Specific Oligonucleotide Probes)法、PCR-SSP(Sequence-specificprimers)法和 PCR-SBT(Sequence-Based Typing)法。其中，PCR-SBT 測序方法更是現(xiàn)世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的HLA分型方法的“金標準”。此類方法具有靈敏度高，特異性強，樣本需求量少等優(yōu)點。但是，擁有眾多優(yōu)點的同時，此類方法也存在著操作繁瑣，耗時長，成本高昂等缺點。尤其，操作繁瑣，耗時長等缺點已經(jīng)逐漸不能滿足現(xiàn)代醫(yī)學檢測需要，不適應現(xiàn)代醫(yī)學檢驗所要求的“快速、簡便”的理念。實時熒光定量PCR (FQ-PCR)是近年在普通PCR基礎上發(fā)展起來的核酸檢測方法，它將熒光值的積累與PCR產(chǎn)物的擴增過程相結合，通過測量指數(shù)擴增期的熒光值來計算待測樣本中核酸的原始量。相較于傳統(tǒng)的HLA等位基因分型檢測方法，F(xiàn)Q-PCR除了具有靈敏度高、特異性強等特點外，還具有著操作簡便、耗時短、可定量等傳統(tǒng)方法無可比擬的優(yōu)點將FQ-PCR應用于HLA等位基因的分型檢測是PCR【技術領域】的一項創(chuàng)新。Taqman PCR技術是FQ-PCR技術中更具技術優(yōu)勢的一種，本發(fā)明即將Taqman PCR技術應用于HLA_B*15:02等位基因的檢測，使Taqman PCR的技術優(yōu)點(靈敏度高、特異性強、著操作簡便、耗時短、可定量)在HLA-B*15:02等位基因檢測中得到完美繼承的同時對HLA-B*15:02等位基因的純合型和雜合型進行了鑒定。本發(fā)明涉及的試劑盒可廣泛應用于人HLA-B*15:02等位基因的檢測，指導臨床上卡馬西平等精神類藥物的使用，規(guī)避HLA-B*15:02基因型患者在使用卡馬西平等精神類藥物后可能引起史蒂芬綜合征(SJS)和中毒性表皮壞死松解癥(TEN)。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種HLA_B*15:02等位基因檢測方法及其試劑盒，以克服現(xiàn)有技術存在的上述缺陷。
[0007]本發(fā)明的一個目的是提供一種HLA_B*15:02等位基因檢測方法，該方法包括如下步驟:
[0008](I)提供包括待測樣品、核酸擴增體系和熒光檢測體系的混合物； [0009](2)通過擴增反應循 環(huán)擴增待測樣品中的靶多核苷酸；
[0010](3)使所述熒光檢測體系中的熒光發(fā)生基團與被擴增的靶多核苷酸序列間接結合；
[0011](4)測定熒光發(fā)生基團所產(chǎn)生的熒光量，從而確定靶多核苷酸的存在及其相對量。
[0012]所述核酸擴增體系由如下組分組成:耐熱DNA聚合酶、2’ -脫氧核苷三磷酸、能夠與靶多核苷酸的第一條鏈結合的正向引物a和能夠與靶多核苷酸的第二條鏈結合的反向引物a，能夠與靶多核苷酸的第一條鏈結合的正向引物b和能夠與靶多核苷酸的第二條鏈結合的反向引物b ；
[0013]所述熒光檢測體系是能夠與靶多核苷酸結合并且兩端分別結合有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的兩條寡核苷酸探針。
[0014]作為一種優(yōu)選的技術方案，本發(fā)明所述核酸擴增體系和熒光檢測體系共3組，其中:
[0015]核酸擴增體系I中用于靶多核苷酸擴增的正向引物a和反向引物a分別為引物I和引物2，用于靶多核苷酸擴增的正向引物b和反向引物b分別為引物7和引物8，并且熒光檢測體系I中所使用的寡核苷酸探針為探針I(yè)和探針4 ；
[0016]核酸擴增體系II中用于靶多核苷酸擴增的正向引物a和反向引物a分別為引物3和引物4，用于靶多核苷酸擴增的正向引物b和反向引物b分別為引物7和引物8，并且熒光檢測體系II中所使用的寡核苷酸探針為探針2和探針4 ；[0017]核酸擴增體系III中用于靶多核苷酸擴增的正向引物a和反向引物a分別為引物5和引物6，用于靶多核苷酸擴增的正向引物b和反向引物b分別為引物7和引物8，并且熒光檢測體系III中所使用的寡核苷酸探針為探針3和探針4 ；
[0018]其中，各引物和探針具體組成如下:
[0019]引物1-6來源于人HLA-B位點的基因序列，引物I位于102-123位，含21個堿基，引物2位于202-221位，含19個堿基，擴增片段長度為120bp ;引物3位于1244-1262位，含18個堿基，引物4位于1371-1386位，含17個堿基，擴增片段長度為143bp ;引物5位于2924-2943位，含19個堿基，引物6位于3065-3083位，含18個堿基，擴增片段長度為160bp ;引物7、8來自源人β -globin基因組序列的HBB基因(62137-63742)，引物7位于62627-62647位，含19個堿基，引物8位于62756-62775位，含18個堿基，擴增片段長度為149bp。探針1-3分別來源于HLA-B位點基因序列的122-146位、1256-1276位和3038-3061位；探針4來源于人β -globin基因序列反向序列的62731-62755位。
[0020]可使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和快速液相層析法(FPLC)純化后進行氨解處理。同樣合成所需的探針序列，氨解處理后分別在其5’端標記作為熒光發(fā)生基團(報告基團)的FAM或HEX，并在其3’端標記借助活性連接臂偶聯(lián)的作為熒光淬滅基團的TAMRA或BHQ。以FPLC層析法純化熒光標記的探針，然后使用變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20%)電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針的純度。
[0021]所述擴增反應循環(huán)是重復35-45次的聚合酶鏈反應循環(huán)。
[0022]所述待測樣品是指需要檢測其中是否含有HLA_B*15:02基因型的臨床血液樣本。
[0023]所述靶多核苷酸來自人血液全基因組DNA。
[0024]作為本發(fā)明的一 個優(yōu)選實施方案，步驟(4)中，先確定樣品中的靶多核苷酸經(jīng)擴增后所產(chǎn)生的熒光達到基線以上的固定閾值時所需的閾循環(huán)數(shù)；然后將上述測定的閾循環(huán)數(shù)與標準溶液中的靶多核苷酸的閾循環(huán)數(shù)相比較，以確定樣品中靶多核苷酸的相對量，從而判斷樣品包含靶多核苷酸基因的純合型與雜合型。
[0025]使用磁珠法或DNA柱回收法(可購買市售DNA提取試劑盒)從得自受試者的血液樣本中提取基因組DNA，然后將提取合格的DNA產(chǎn)物用于后續(xù)的PCR擴增。
[0026]在含有引物1、2和引物7、8，探針1、4，0嫩模板(？0?擴增靶序列)，(1見1^(101111)，耐熱DNA聚合酶，Mg2+，PCR緩沖液和水的反應體系中(體系I );含有引物3、4和引物7、8，探針2、4，DNA模板(PCR擴增靶序列)，dNTPs (10mM)，耐熱DNA聚合酶，Mg2+，PCR緩沖液和水的反應體系中(體系II);含有引物5、6和引物7、8，探針3、4，DNA模板(PCR擴增靶序列)，dNTPs (10mM)，耐熱DNA聚合酶，Mg2+，PCR緩沖液和水的反應體系中(體系III);使用ABI7500,Roche Light Cycler480,Mx3000P等其它結構類似的自動熒光檢測熱循環(huán)儀上對如上得到的DNA序列進行PCR擴增。所使用的反應條件是:96°C預變性3分鐘，95°C 30秒—65 0C 45秒，共進行35個循環(huán)；最后25°C下至少30秒。
[0027]1.無效結果判定:與存在于體系1、I1、111中的寡核苷酸熒光探針4相關的擴增曲線不呈現(xiàn)“S”型或Ct值空白又或Ct值> 30的樣本，報告為無效；
[0028]2.陽性結果判定:滿足與體系I和體系II中的寡核苷酸探針1、探針2和探針4相關的擴增曲線呈現(xiàn)“S”型且同體系中探針1、探針2和探針4的CT值< 30，同時體系III中的寡核苷酸探針3的CT值空白且體系中III探針4的CT值< 30的樣本，報告為陽性；[0029]3.陰性結果判定:屬于無效結果判定和陽性結果判定以外的情況則報告為陰性；
[0030]可利用已知為HLA_B*15:02純合型和雜合型等位基因的樣本與待檢樣本同批次進行PCR擴增反應，在獲得相應的CT值后，利用雙Λ Ct法，將標準品(HLA-B*15:02純合型和雜合型樣本)擴增體系II中與探針2、探針4相關的擴增曲線的CT值，與待檢樣本(根據(jù)擴增試驗結果已確定為HLA-B*15:02等位基因型)擴增體系II中探針2、探針4相關的擴增曲線的CT值進行比較分析，從而判斷出待檢樣本(根據(jù)擴增試驗結果已確定為HLA-B*15:02等位基因型)HLA-B*15:02等位基因的純合型或雜合型。也就是說，為了基于上述的擴增反應結果推斷出待檢樣本HLA-B*15:02等位基因的純合型或雜合型。[0031]本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于上述HLA_B*15:02等位基因檢測的試劑盒，該試劑盒包括:(I)分別裝有反應液1、反應液2、反應液3、EZ Taq酶混合液、標準液1、標準液2的多個密封離心管，(2)分隔并集中包裝這些離心管的試劑盒；其中:
[0032]反應液I由如下組分組成:由PCR反應緩沖液、2’ -脫氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴增的引物I和引物2，寡核苷酸探針為探針I(yè) ;用于靶多核苷酸擴增的引物7和引物8，寡核苷酸探針為探針4;
[0033]反應液2由如下組分組成:PCR反應緩沖液、2’ -脫氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴增的引物3和引物4，寡核苷酸探針為探針2 ;用于靶多核苷酸擴增的引物7和引物8，寡核苷酸探針為探針4 ；
[0034]反應液3由如下組分組成:PCR反應緩沖液、2’ -脫氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴增的引物5和引物6，寡核苷酸探針為探針3 ;用于靶多核苷酸擴增的引物7和引物8，寡核苷酸探針為探針4 ；
[0035]EZ Taq混合液:主要成份為熱啟動Taq酶；
[0036]標準液1:純合型HLA-B*15:02基因組DNA ;
[0037]標準液2:雜合型HLA_B*15:02基因組DNA。
[0038]與基于擴增反應完成后進行單一終點檢測的傳統(tǒng)PCR方法不同，實時熒光定量聚合酶鏈反應方法可以在擴增反應進行的過程中隨時監(jiān)測擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而極大的提高了定量檢測的準確性和精密度。實時熒光定量PCR (Taqman探針法)在PCR的擴增中，同時加入了引物和在5’末端和3’末端分別標記有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的特異性寡核苷酸探針。如果探針沒有與靶序列互補結合，探針序列保持完整，熒光發(fā)生基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，故沒有熒光信號的產(chǎn)生，而當探針與靶序列能夠互補結合時，在PCR擴增進行的過程中，DNA聚合酶在引導DNA序列復制的同時其5’ -3’端外切酶活性將切斷熒光探針，導致熒光發(fā)生基團與熒光淬滅基團的分離，從而熒光檢測系統(tǒng)可以接收并記錄熒光信號。每擴增一條DNA鏈即有一個熒光信號的產(chǎn)生，熒光信號的積累與PCR產(chǎn)物的形成完全同步，故可以實時地監(jiān)測整個PCR反應過程，并可借助標準曲線或表達量恒定的內對照產(chǎn)物對未知的靶多核苷酸進行絕對或相對的定量分析。
[0039]如上所述，為了檢測出臨床血液樣本中HLA(human leukocyte antigen)的基因型為HLA-B*15:02等位基因型，特別是能夠準確區(qū)分HLA_B*15:13/15/31/55/88/89，HLA-B*95:12/21，HLA_B*15:139/144/170 等與 HLA_B*15:02 等位基因有著較高相似度 DNA序列的其他等位基因型，設計并制備實現(xiàn)這些目的的寡核苷酸引物和探針是一個非常重要的技術環(huán)節(jié)。為此，我們在使用適當?shù)暮怂岱治鲕浖?如DNA Star)對HLA-B*的核苷酸序列進行分析，進一步使用適當?shù)囊镌O計軟件(如Primer primer5.0)選擇并設計具有特定核苷酸序列的寡核苷酸引物；選擇并設計具有特定核苷酸序列的寡核苷酸探針。
[0040]如上所述，為了檢測出臨床血液樣本中HLA(human leukocyte antigen)的基因型為HLA-B*15:02等位基因型，特別是能夠準確區(qū)分HLA_B*15:13/15/31/55/88/89，HLA-B*95:12/21，HLA_B*15:139/144/170 等與 HLA_B*15:02 等位基因有著較高相似度 DNA序列的其他等位基因型，本發(fā)明將HLA-B*15:02等位基因型的DNA序列與其它與之有著高度同源性的等位基因型的DNA序列進行了同源性比較和分析，特別設計適用本發(fā)明檢測試劑盒的寡核苷酸引物和探針。使用這些引物和探針完成的HLA-B*15:02等位基因實時定量檢測，極大的簡化了 HLA-B*15:02等位基因檢測的操作步驟，縮短了檢測時間，提高了檢測靈敏度，降低了模板使用量。實驗證明，本發(fā)明對HLA-B*15:02等位基因型檢測的準確度在99.5%以上。
[0041]值得特別說明的是，我們使用了已知為HLA_B*15:02等位基因純合型和雜合型的血樣標準品，作為檢測體系中的陽性對照。此外，標準品的存在，使完成HLA-B*15:02等位基因型檢測的同時，進一步提高了待檢樣本HLA-B*15:02等位基因純合型或雜合型判斷的準確度。 [0042]本發(fā)明即將Taqman PCR技術應用于HLA_B*15:02等位基因的檢測，使Taqman PCR的技術優(yōu)點(靈敏度高、特異性強、著操作簡便、耗時短、可定量)在HLA-B*15:02等位基因檢測中得到完美繼承的同時對HLA-B*15:02等位基因的純合型和雜合型進行了鑒定。本發(fā)明涉及的試劑盒可廣泛應用于人HLA-B*15:02等位基因的檢測，指導臨床上別嘌呤醇藥物的使用，規(guī)避HLA-B*15:02基因型患者在使用卡馬西平等精神類藥物后可能引起的史蒂芬綜合征(SJS)和中毒性表皮壞死松解癥(TEN)。
【具體實施方式】
[0043]下面給出本發(fā)明較佳實施例，以詳細說明本發(fā)明的技術方案。
[0044]實施例1:
[0045]HLA_B*15:02等位基因檢測試劑盒(SSP-PCR熒光探針法)及其使用。
[0046](I)制備包括下列組成成份的試劑盒:反應液I (650μ I/管)I管、反應液2(650 μ I/管)I管、反應液3 (650 μ I/管)I管、EZ Taq酶混合液(150 μ I/管)I管、標準液I (30 μ I/管)、標準液2 (30 μ I/管)。
[0047](2)樣本采集、運送和保存:用一次性真空采血器，無菌操作，取待檢個體血液樣本，做好標示后將獲取的血液樣本置于低溫冰箱(_70°C或-20°C)中冷凍保存。如集中檢驗，標本需在0°C以下環(huán)境中運送并于24小時內送達實驗室。
[0048](3)檢驗步驟和結果分析:
[0049]將待檢測血樣取300 μ 1，用柱回收法提取血液樣本中的DNA，用分光光度計或類似的儀器確認提取的DNA的質量(0D260/280在1.8-2.0之間)，將提取的每份待檢樣本DNA和標準品DNA分別置于3個PCR反應管或PCR板的3個孔中，每孔2 μ I。然后,在加入同一 DNA樣本的3個孔中各加入一種PCR反應液(反應液1、反應液2、反應液3) 15 μ 1，再在每個孔中加入3 μ I的酶混合液?；靹螂x心后，將PCR反應體系置于自動熒光檢測熱循環(huán)儀上，選擇FAM通道(Reporter:FAM, Quencher:none)收集特異擴增信號；選擇HEX或VIC通道(Reporter:HEX/VIC, Quencher:none)檢測內標；參比突光(Passive Reference)設置為none ;設置Sample Volume為20。按照儀器操作說明做好相應設置后開始試驗。本試劑盒的所使用的反應條件是:96°C預變性3分鐘，95°C 30秒一65°C 45秒，共進行35個循環(huán)；最后25°C下至少30秒。
[0050]反應結束后保存檢測數(shù)據(jù)文件，點選儀器的數(shù)據(jù)分析選項后可查看各個PCR反應體系的結果，如PCR擴增曲線，待檢樣本和標準樣本的CT值等，具體PCR擴增反應條件、標準品和樣品的檢測結果見表1~表3。
[0051]表1 PCR擴增反應條件
【權利要求】
1.一種HLA-B*15:02等位基因檢測方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)提供包括待測樣品、核酸擴增體系和熒光檢測體系的混合物； (2)通過擴增反應循環(huán)擴增待測樣品中的靶多核苷酸； (3)使所述熒光檢測體系中的熒光發(fā)生基團與被擴增的靶多核苷酸序列間接結合； (4)測定熒光發(fā)生基團所產(chǎn)生的熒光量，從而確定靶多核苷酸的存在及其相對量； 所述核酸擴增體系由如下組分組成:耐熱DNA聚合酶、2’ -脫氧核苷三磷酸、能夠與靶多核苷酸的第一條鏈結合的正向引物a和能夠與靶多核苷酸的第二條鏈結合的反向引物a，能夠與靶多核苷酸的第一條鏈結合的正向引物b和能夠與靶多核苷酸的第二條鏈結合的反向引物b ;所述熒光檢測體系是能夠與靶多核苷酸結合并且兩端分別結合有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的兩條寡核苷酸探針。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸擴增體系和熒光檢測體系共3組,其中: 核酸擴增體系I中用于靶多核苷酸擴增的正向引物a和反向引物a分別為引物I和引物2，用于靶多核苷酸擴增的正向引物b和反向引物b分別為引物7和引物8，并且熒光檢測體系I中所使用的寡核苷酸探針為探針I(yè)和探針4 ;核酸擴增體系II中用于靶多核苷酸擴增的正向引物a和反向引物a分別為引物3和引物4，用于靶多核苷酸擴增的正向引物b和反向引物b分別為引 物7和引物8，并且熒光檢測體系II中所使用的寡核苷酸探針為探針2和探針4 ;核酸擴增體系III中用于靶多核苷酸擴增的正向引物a和反向引物a分別為引物5和引物6，用于靶多核苷酸擴增的正向引物b和反向引物b分別為引物7和引物8，并且熒光檢測體系III中所使用的寡核苷酸探針為探針3和探針4 ;各引物和探針具體組成如下: 引物1-6來源于人HLA-B位點的基因序列，引物I位于102-123位，含21個堿基，引物2位于202-221位，含19個堿基，擴增片段長度為120bp ;引物3位于1244-1262位，含18個堿基，引物4位于1371-1386位，含17個堿基，擴增片段長度為143bp ;引物5位于2924-2943位，含19個堿基，引物6位于3065-3083位，含18個堿基，擴增片段長度為160bp ;引物7、8來自源人β -globin基因組序列的HBB基因(62137-63742)，引物7位于62627-62647位，含19個堿基，引物8位于62756-62775位，含18個堿基，擴增片段長度為149bp。探針1_3分別來源于HLA-B位點基因序列的122-146位、1256-1276位和3038-3061位；探針4來源于人β -globin基因序列反向序列的62731-62755位。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴增反應循環(huán)是重復35-45次的聚合酶鏈反應循環(huán)。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，先確定樣品中的靶多核苷酸經(jīng)擴增后所產(chǎn)生的熒光達到基線以上的固定閾值時所需的閾循環(huán)數(shù)；然后將上述測定的閾循環(huán)數(shù)與標準溶液中的靶多核苷酸的閾循環(huán)數(shù)相比較，以確定樣品中靶多核苷酸的相對量，從而判斷樣品包含靶多核苷酸基因的純合型與雜合型。
5.一種用于HLA-B*15:02等位基因檢測的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括: (O分別裝有反應液1、反應液2、反應液3、EZ Taq混合液、標準液1、標準液2的多個密封離心管，(2)分隔并集中包裝這些離心管的試劑盒；其中: 反應液I由如下組分組成:由PCR反應緩沖液、2’ -脫氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴增的引物I和引物2，寡核苷酸探針為探針I(yè) ;用于靶多核苷酸擴增的引物7和引物8，寡核苷酸探針為探針4 ； 反應液2由如下組分組成:PCR反應緩沖液、2’ -脫氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴增的引物3和引物4，寡核苷酸探針為探針2 ;用于靶多核苷酸擴增的引物7和引物8，寡核苷酸探針為探針4 ； 反應液3由如下組分組成:PCR反應緩沖液、2’ -脫氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴增的引物5和引物6，寡核苷酸探針為探針3 ;用于靶多核苷酸擴增的引物7和引物8，寡核苷酸探針為探針4 ； EZ Taq混合液:主要成份為熱啟動Taq酶； 標準液1:純合型HLA-B*15:02基因組DNA ； 標準液2:雜合型HLA-B*15:02基因組DNA ； 各引物和探針具體組成如下: 引物1-6來源于人HLA-B位點的基因序列，引物I位于102-123位，含21個堿基，引物2位于202-221位，含19個堿基，擴增片段長度為120bp ;引物3位于1244-1262位，含18個堿基，引物4位于1371-1386位，含17個堿基，擴增片段長度為143bp ;引物5位于2924-2943位，含19個堿基，引物6位于3065-3083位，含18個堿基，擴增片段長度為160bp ;引物7、8來自源人β -globin基因組序列的HBB基因(62137-63742)，引物7位于62627-62647位，含19個堿基，引物8位于62756-62775位，含18個堿基，擴增片段長度為149bp。探針1_3分別來源于HLA-B位點基因序列的122-146位、1256-1276位和3038-3061位；探針4來源于人β -globin基因序列反向 序列的62731-62755位。
【文檔編號】C12Q1/68GK103820543SQ201410040161
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權日:2014年1月27日
【發(fā)明者】劉志文, 肖偉明, 闕秋華, 孫祖勇 申請人:希斯奇生物醫(yī)藥（上海）有限公司