基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-625-5p檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-625-5p檢測試劑盒及其檢測方法，涉及MicroRNA。試劑盒設(shè)有盒體、隔板、外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時熒光定量PCR試劑瓶。提取樣本中miRNA，若為血清/血漿或其他體液樣本，則在樣本充分裂解后加入試劑盒提供的濃度為5n?mol的外源性參照cel-miR-395μL，漩渦震蕩；若為細(xì)胞或組織樣本，則無需加入外源性參照cel-miR-39；采用試劑盒提供的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄miRNA為cDNA；采用試劑盒提供的實(shí)時熒光定量PCR試劑將cDNA進(jìn)行實(shí)時PCR擴(kuò)增；綜合分析儀器給出的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，設(shè)定合理的閾值和基線，進(jìn)行結(jié)果分析。
【專利說明】基于Al IG1探針熒光定量PCR的hsa-miR-625-5p檢測試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及MicroRNA，尤其是涉及一種基于AllGl0探針熒光定量PCR的hsa-miR-625-5p檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]MicroRNA (miRNA)是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中的長約22個核苷酸的非編碼RNA分子，參與了在生物體中許多生理病理過程，通過調(diào)芐基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖、凋亡、生長發(fā)育、細(xì)胞分化、代謝等過程中發(fā)揮重要作用，具體表現(xiàn)為miRNA在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)過形成最初的初級轉(zhuǎn)錄本pr1-miRNA到pre_miRNA,后轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核,通過剪切形成成熟miRNA,通過與Ago蛋白等形成RISC (RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)，部分抑制或降解靶mRNA序列，參與基因表達(dá)調(diào)控(Bartel DP.MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function [J].Cell, 2004，116(2):281-297)。
[0003]由于miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后判斷以及許多其他疾病狀態(tài)下扮演著重要角色，精確檢測其表達(dá)情況對于研究miRNA的作用具有重大意義。目前，檢測miRNA的方法主要有northern blot技術(shù)、實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)、原位雜交技術(shù)、微陣列芯片技術(shù)等。其中，northern blot技術(shù)是RNA檢測的早期手段之一，但其特異性和敏感性低，如果樣本RNA含量低或存在降解，可能檢測不到；原位雜交技術(shù)用于檢測組織和細(xì)胞水平miRNA的分布情況，同時對miRNA進(jìn)行半定量檢測，其不足地方在于不能準(zhǔn)確檢測到低表達(dá)的miRNA ；微陣列芯片技術(shù)是一種高 通量的檢測技術(shù)，能同時檢測一種或多種樣本的大量的miRNA，但存在芯片制作費(fèi)時，費(fèi)力和標(biāo)記成本高，檢測靈敏度和特異性低等問題。
[0004]實(shí)時熒光定量技術(shù)(RT-qPCR)是目前最普遍用于基因表達(dá)檢測的技術(shù)之一，具有簡便快速、敏感性高和特異性好等特點(diǎn)。目前，用于檢測miRNA的實(shí)時熒光定量PCR方法包括miRNA逆轉(zhuǎn)錄和下游的熒光定量PCR兩部分，其中逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)反轉(zhuǎn)錄引物的不同分為兩種:同聚物加尾法和莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄法；熒光定量PCR的檢測分為染料法和探針法，其中目前檢測miRNA的探針多為Taqman-MGB探針(一種適合于擴(kuò)增短片段的突光探針)，由于成熟的miRNA具有片段短小的特點(diǎn)，要特異的檢測，探針法更有優(yōu)勢，在敏感性和特異性上優(yōu)于染料法?；谇o環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物能特異識別，擴(kuò)增成熟的miRNA序列，而miRNA的前體并未被擴(kuò)增，Taqman-MGB探針檢測miRNA缺點(diǎn)在于合成價(jià)格貴,不利于推廣。
[0005]目前，AllGl0探針已經(jīng)成功應(yīng)用于檢測皰疹病毒、乙型肝炎病毒基因突變(Feng, Z.L.Yuj X.Y.Lu，Z.M.Gengj D.Y.Zhang, L.Chen, S.J.Rapid detection of thehepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo?probes[J].Clin Chim Acta,2011,412 (11-12): 1018-1021)、侵襲性曲霉菌病(Wuj D.S.Shenj J.Z.Zhou, X.Q.Shenj S.F.Wuj X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AlIGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke ZaZhij 2010，49 (2): 142-145)、K-ras基因突變、強(qiáng)直性脊柱炎等檢測。[0006]有研究報(bào)道表明hsa-miR-625_5p在胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程扮演重要作用(Wang M, Li C，Nie H, Lv X, Qu Y,Yu B, et al.Down-regulated miR-625suppressesinvasion and metastasis of gastric cancer by targeting ILK[J].FEBSLett, 2012，586(16):2382-2388)在個體化早期診斷方面，適合做為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療藥物療效的指標(biāo)之一(Rasmussen MH, Jensen NF, Tarpgaard LS, Qvortrup C，RomerMU, Stenvang J, et al.High expression of microRNA-625_3p is associated with poorresponse to first-line oxaliplatin based treatment of metastatic colorectalcancer [J], Mol Oncol, 2013, 7(3): 637-646)。目前 hsa-miR-625_5p 在生物及其他領(lǐng)域的功能越來越得到重視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的之一在于針對現(xiàn)有檢測miRNA方法中使用的試劑盒和檢測方法存在的上述缺陷，提供基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-625-5p檢測試劑盒。
[0008]本發(fā)明的目的之二在于提供基于AllGl0探針熒光定量PCR的hsa-miR-625-5p的檢測方法。
[0009]所述hsa-miR-625-5p為一種人源性miRNA，其核苷酸序列為:SEQ ID N0.15 ; -AGGGGGAAA⑶UCUAUA⑶CC-3 ;。
[0010]所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-625-5p檢測試劑盒，設(shè)有盒體、隔板、外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時熒光定量PCR試劑瓶；隔板設(shè)在盒體內(nèi)，外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時熒光定量PCR試劑瓶插在隔板上，外源性參照瓶內(nèi)裝有外源性參照，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶內(nèi)裝有莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑，實(shí)時熒光定量PCR試劑瓶內(nèi)裝有實(shí)時熒光定量PCR試劑。
[0011]所述外源性參照可采用cel-miR-39等,所述cel-miR-39為一種線蟲類miRNA,其核苷酸序列為:SEQ ID N0.25 ; -UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3 ;;其工作濃度可為 5nmol。
[0012]所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑包括以`下組份:200單位/ μ L的MMLV酶、IOm mol dNTP混合液、5 X RT 緩沖液(所述 5 X RT 緩沖液由 250m mol Tris-HCl、375m mol KCl、15m mol MgCl2,50m mol DTT組成)、40單位/ μ L的RNA酶抑制劑、IOm mol的MgCl2U μ mol的特異的miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物、miRNA標(biāo)準(zhǔn)品(這里的miRNA標(biāo)準(zhǔn)品是指人工合成的miRNA，濃度為IOOnmol )。
[0013]所述miRNA的特異逆轉(zhuǎn)錄引物由hsa-miR-625_5p的特異逆轉(zhuǎn)錄引物、外源性參照cel-miR-39的特異逆轉(zhuǎn)錄引物和內(nèi)源性參照U6的特異逆轉(zhuǎn)錄引物組成:
[0014]所述hsa-miR-625-5p的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ ID N0.35 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGGACTATA-3 ;；
[0015]所述外源性參照cel-miR-39的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ ID N0.45 1-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTGTTCCT-3 ;；
[0016]所述內(nèi)源性參照U6的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ IDN0.55 ; _AACGCTTCACGAATTTGCGT_3 ;。
[0017]所述實(shí)時熒光定量PCR試劑包括以下組份:10 X Taq緩沖液(10 X Taq緩沖液包括100m mol Tris-HCl, 500m mol KCl)> 10m mol 的 MgCl2、5 單位 / μ L 的 Taq 聚合酶、10m moldNTP混合液、IOOmL無核酶水、10 μ mol特異正向引物、10 μ mol通用反向引物和AllGlo探針。
[0018]所述特異正向引物由hsa-miR-625_5p的特異引物、外源性參照celniR-39的特異引物和內(nèi)源性參照U6的特異引物組成:
[0019]所述hsa-miR-625_5p的特異引物的核苷酸序列為:
[0020]
【權(quán)利要求】
1.基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-625-5p檢測試劑盒，其特征在于所述hsa-miR-625-5p 為一種人源性miRNA，其核苷酸序列為:SEQ ID N0.15 ; -AGGGGGAAAGUUCUAUAGUCC-3 ;； 所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-625-5p檢測試劑盒，設(shè)有盒體、隔板、外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時熒光定量PCR試劑瓶；隔板設(shè)在盒體內(nèi)，外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時熒光定量PCR試劑瓶插在隔板上，外源性參照瓶內(nèi)裝有外源性參照，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶內(nèi)裝有莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑，實(shí)時熒光定量PCR試劑瓶內(nèi)裝有實(shí)時熒光定量PCR試劑。
2.如權(quán)利要求1所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-625_5p檢測試劑盒，其特征在于所述外源性參照采用cel-miR-39，所述cel-miR-39為一種線蟲類miRNA,其核苷酸序列為:SEQ ID N0.25 ; -UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3 ;;其工作濃度為 5nmol。
3.如權(quán)利要求1所述基于AlIGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-625_5p檢測試劑盒，其特征在于所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑包括以下組份:200單位/ μ L的MMLV酶、IOm mol dNTP混合液、5 X RT緩沖液、40單位/ μ L的RNA酶抑制劑、IOm mol的MgCl2U μ mol的特異的miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物、miRNA標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為IOOn mol ;所述5XRT緩沖液由250m mol Tris-HCl,375m mol KClU5m mol MgCl2,50m mol DTT 組成。
4.如權(quán)利要求3所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-625_5p檢測試劑盒，其特征在于所述miRNA的特異逆轉(zhuǎn)錄引物由hsa-miR-625-5p的特異逆轉(zhuǎn)錄引物、外源性參照cel-miR-39的特異逆轉(zhuǎn)錄引物和內(nèi)源性參照U6的特異逆轉(zhuǎn)錄引物組成； 所述hsa-miR-625-5p的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ ID N0.35 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGGACTATA-3 ;； 所述外源性參照cel-miR-39的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ ID N0.45 ; -GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTGTTCCT-3 ;； 所述內(nèi)源性參照U6的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為:SEQ IDN0.55 ; _AACGCTTCACGAATTTGCGT_3 ;。
5.如權(quán)利要求1所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-625_5p檢測試劑盒，其特征在于所述實(shí)時熒光定量PCR試劑包括以下組份:10XTaq緩沖液、IOm mol的MgCl2、5單位/ μ L的Taq聚合酶、IOm mol dNTP混合液、IOOmL無核酶水、10 μ mol特異正向引物、ΙΟμπιοΙ通用反向引物和AllGlo探針;所述10 X Taq緩沖液包括IOOm mol Tris-HCl, 500mmol KCl0
6.如權(quán)利要求5所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-625-5p檢測試劑盒，其特征在于所述特異正向引物由hsa-miR-625-5p的特異引物、外源性參照cel-miR-39的特異引物和內(nèi)源性參照U6的特異引物組成； 所述hsa-miR-625-5p的特異引物的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.65 ; -TGGAGGAGGGGGAAAGT-3 ;； 所述外源性參照cel-miR-39的特異引物的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.75 ; -CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3 ;； 所述內(nèi)源性參照U6的特異引物的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.85 ; -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ;。
7.如權(quán)利要求5所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-625_5p檢測試劑盒，其特征在于所述通用反向引物的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.95 ; -CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3 ;。
8.如權(quán)利要求5所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-625_5p檢測試劑盒，其特征在于所述AllGlo探針由hsa-miR-625-5p的特異探針、內(nèi)源性參照U6的特異探針和外源性參照cel-miR-39的特異探針組成； 所述hsa-miR-625-5p的特異探針的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.10MAR-TTGCACTGGATACGACGGACTATAG-MAR ； 所述內(nèi)源性參照U6的特異探針的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.11JUP-CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCC-JUP ； 所述外源性參照cel-miR-39的特異探針的核苷酸序列為:
SEQ ID N0.12JUP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-JUP。
9.基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-625_5p的檢測方法，其特征在于其步驟如下: 1)采用常規(guī)方法提取樣本中miRNA，若為血清/血漿或其他體液樣本，則在樣本充分裂解后加入所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的hsa-miR-625-5p檢測試劑盒提供的濃度為5nmol的外源性參照cel-miR-395 μ L，立即進(jìn)行漩渦震蕩15s ;若為細(xì)胞或組織樣本，則無需加入外源性參照cel-miR-39 ； 2)采用所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的hsa-miR-625-5p檢測試劑盒提供的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄miRNA為cDNA ； 3)采用所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的hsa-miR-625-5p檢測試劑盒提供的實(shí)時熒光定量PCR試劑將cDNA進(jìn)行實(shí)時PCR擴(kuò)增； 4)綜合分析儀器給出的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，設(shè)定合理的閾值和基線，進(jìn)行結(jié)果分析。
10.如權(quán)利要求 9所述基于AllGl0探針熒光定量PCR的hsa-miR-625-5p的檢測方法，其特征在于所述AllGlo探針采用美國AlleLogic Biosciences Corporation公司的突光定量探針。
【文檔編號】C12M1/34GK103757125SQ201410041333
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】張忠英, 唐晶 申請人:廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院