山羊源奧斯陸莫拉菌及其分子鑒定的特異性片段及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及山羊源奧斯陸莫拉菌及其分子鑒定的特異性片段，還涉及到所述特異性片段的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的山羊源奧斯陸莫拉菌，生物保藏編號為CCTCC?M2014036，是從山羊肺炎病例肺臟化膿部位分離得到。該菌為進(jìn)一步研究山羊源奧斯陸莫拉菌生理生化特性及其對動物機(jī)體的危害奠定了基礎(chǔ)；本發(fā)明的山羊源奧斯陸莫拉菌DNA分子鑒定的特異性片段，其制備方法簡單，采用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增得到，所述的特異性片段能快速、準(zhǔn)確的鑒定山羊源奧斯陸莫拉菌菌株，特異性好；本發(fā)明還涉及檢測山羊源奧斯陸莫拉菌的試劑盒，該試劑盒可以快速篩查山羊源奧斯陸莫拉菌。
【專利說明】山羊源奧斯陸莫拉菌及其分子鑒定的特異性片段及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及山羊源奧斯陸莫拉菌及其分子鑒定的特異性片段，還涉及到所述特異性片段的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]奧斯陸莫拉菌(Moraxella osloensis)是Henriksen于1967年在奧斯陸發(fā)現(xiàn)的，該菌是人和動物粘膜上的正常菌群，主要在機(jī)體抵抗力及免疫力降低時(shí)，引起肺部和泌尿系統(tǒng)方面的感染，同時(shí)可能引起敗血癥和其他感染。奧斯陸莫拉菌的詳細(xì)描述參見網(wǎng)站:[0003]http://www.escience.gov.cn/MetaDataSiteMap/Crawler?resourceId=nongyewei_1544C0001000000596o
[0004]目前，對奧斯陸莫拉菌的研究已取得了一些進(jìn)展，趙锎從一名女患者血液中分離到一株奧斯陸莫拉菌，并研究了其對青霉素、頭孢他啶、頭孢曲松、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、復(fù)方磺胺甲惡唑等的耐藥性[參見文獻(xiàn):從血液中分離出I株奧斯陸莫拉菌，中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2004，14 (10):1198]。林燕青等從腎盂積水中檢出奧斯陸莫拉菌，并對其進(jìn)行了菌落特征鑒定[參見文獻(xiàn):從腎盂積水中檢出奧斯陸莫拉菌I例，中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2004，1 (14):14]。目前，關(guān)于奧斯陸莫拉菌對山羊的生理機(jī)能危害還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供了一種山羊源奧斯陸莫拉菌，為今后進(jìn)一步研究山羊源奧斯陸莫拉菌生理生化特性及其對動物機(jī)體的危害奠定了基礎(chǔ)；本發(fā)明的目的之二在于提供山羊源奧斯陸莫拉菌DNA分子鑒定的特異性片段及其制備方法，該特異性片段可以快速檢測、鑒定山羊源奧斯陸莫拉菌，所述的制備方法可以特異性擴(kuò)增得到山羊源奧斯陸莫拉菌DNA分子鑒定的特異性片段；本發(fā)明的目的之三在于提供山羊源奧斯陸莫拉菌DNA分子鑒定的特異性片段的應(yīng)用，利用該特異片段可以快速鑒定山羊源奧斯陸莫拉菌；本發(fā)明的目的之四在于提供檢測山羊源奧斯陸莫拉菌的試劑盒，該試劑盒可以快速篩查山羊源奧斯陸莫拉菌。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0007]山羊源奧斯陸莫拉菌，其生物保藏編號為CCTCC M2014036。
[0008]生物保藏信息說明:
[0009]于2014年I月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為武昌珞珈山武漢大學(xué)校內(nèi)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2014036，分類命名為Morexellaosloensis FLZ-0127 (奧斯陸莫拉菌 FLZ-0127)。
[0010]生物保藏編號為CCTCC M2014036的山羊源奧斯陸莫拉菌，是從山羊肺炎病例肺臟化膿部位分離得到。
[0011]進(jìn)一步，所述的山羊源奧斯陸莫拉菌，所述的分離是將肺臟化膿部位采用無菌劃線接種到鮮血瓊脂培養(yǎng)基平板上，37°C恒溫培養(yǎng)24_48h，分離得到病原菌。[0012]山羊源奧斯陸莫拉菌DNA分子鑒定的特異性片段，序列如SEQ ID N0:1所示。
[0013]山羊源奧斯陸莫拉菌DNA分子鑒定的特異性片段的制備方法，包括如下進(jìn)行的步驟:
[0014](1)取權(quán)利要求2所述的山羊源奧斯陸莫拉菌，提取基因組DNA，制備模板DNA ；
[0015](2)取步驟(1)中所制備的模板DNA，采用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增所述山羊源奧斯陸莫拉菌的16S rDNA，得到山羊源奧斯陸莫拉菌DNA分子鑒定的特異性片段；所述的通用引物為:上游引物F27，序列如SEQ ID NO:2所示；下游引物R1492，序列如SEQ ID N0:3所示。
[0016]進(jìn)一步，所述的制備方法，所述步驟(2)中，采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系總體積為50μ L，含有2XTaqPCR Master Mix25 μ L，上、下游引物各I μ L，模板DNA2 μ L，余量為水，所述上、下游引物濃度均為50 μ mol/L。
[0017]進(jìn)一步，所述的制備方法，所述擴(kuò)增為在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min, 94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸45s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin,結(jié)束反應(yīng)后，所得的PCR產(chǎn)物于4°C保存；采用10g/L瓊脂糖凝膠電泳對所述的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，PCR產(chǎn)物序列如SEQ ID NO:1所示。
[0018]所述的山羊源奧斯陸莫拉菌DNA分子鑒定的特異性片段或特異性片段的互補(bǔ)序列片段在檢測山羊源奧斯陸莫拉菌中的應(yīng)用，如作為特異性分子探針檢測山羊源奧斯陸莫拉菌。
[0019]檢測山羊源奧斯陸莫拉菌的試劑盒，包括基因組DNA提取試劑和PCR反應(yīng)試劑，所述基因組DNA提取試劑是提取山羊源奧斯陸莫拉菌基因組DNA，所述PCR反應(yīng)試劑包括2XTaqPCR Master Mix、序列如SEQ ID NO:2所示的上游引物F27和序列如SEQ ID NO:3所示的下游引物R1492 ;所述基因組DNA提取試劑是提取樣品的基因組DNA，所述PCR反應(yīng)試劑是對所得的樣品基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物即目的片段，所述PCR反應(yīng)試劑包? 2 X TaqPCR Master Mix、序列如SEQ ID NO:2所示的上游引物F27和序列如SEQ ID NO:3所示的下游引物R1492。
[0020]檢測山羊源奧斯陸莫拉菌的試劑盒的使用方法:取待檢病原菌樣品，用試劑盒中基因組DNA提取試劑提取病原菌的基因組DNA，制備模板DNA，然后取模板DNA、上游引物F27、下游引物R1492、2XTaqPCR Master Mix建立PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，序列與山羊源奧斯陸莫拉菌DNA分子鑒定的特異性片段或特異性片段的互補(bǔ)序列片段進(jìn)行比對，進(jìn)而鑒定所述病原菌。
[0021]本發(fā)明的有益效果:
[0022]本發(fā)明的山羊源奧斯陸莫拉菌，為進(jìn)一步研究山羊源奧斯陸莫拉菌生理生化特性及其對動物機(jī)體的危害奠定了基礎(chǔ)；本發(fā)明的山羊源奧斯陸莫拉菌DNA分子鑒定的特異性片段，其制備方法簡單，所述的特異性片段能快速、準(zhǔn)確的鑒定山羊源奧斯陸莫拉菌菌株，特異性好；本發(fā)明的檢測山羊源奧斯陸莫拉菌的試劑盒，該試劑盒可以快速篩查山羊源奧斯陸莫拉菌。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1分離病原菌菌落圖片(10倍物鏡)。
[0024]圖2革蘭氏染色結(jié)果。[0025]圖3PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
[0026]圖4基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹狀圖(Moraxella oslooensis (#)為分離病原菌)。
[0027]圖5PCR產(chǎn)物測序結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0028]所舉實(shí)施例是為了更好地對本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行說明，但并不是本發(fā)明的內(nèi)容僅限于所舉實(shí)施例。所以熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
對實(shí)施方案進(jìn)行非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0029]優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。本發(fā)明所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)
品O
[0030]另外，實(shí)施例中所涉及的核苷酸序列的書寫順序默認(rèn)為從5’端至3’端。
[0031]實(shí)施例1山羊源奧斯陸莫拉菌的篩選及鑒定
[0032]1.試劑 [0033]營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，購自杭州微生物試劑有限公司；
[0034]鮮血瓊脂培養(yǎng)基，由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所制備。方法如下:滅菌加玻璃珠的三角瓶，經(jīng)頸靜脈無菌采集山羊鮮血，并勻速震蕩制成脫纖維羊血，按6%比例加入滅菌后冷卻至45-50°C的普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，輕輕搖勻后，趁熱分裝于平皿中制成平板；
[0035]基因組DNA的提取采用DNA抽提試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；
[0036]PCR反應(yīng)試劑2xTaq PCR Master Mix購自天根生化科技(北京)有限公司；
[0037]瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；
[0038]16S rDNA的PCR擴(kuò)增引物為通用引物，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1.5kb左右，由大連寶生物工程有限公司合成。
[0039]引物序列為:F27:5’-AGAGTTTGATCCTGG-CTCAG-3’ ；
[0040]R1492:5’ -ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。
[0041]電泳標(biāo)準(zhǔn)品DNA Marker,電泳后其條帶大小依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp。
[0042]2.篩選
[0043]山羊?yàn)橹貞c市某羊場送檢的肺炎病例，實(shí)驗(yàn)室解剖送檢肺炎病例山羊，對肺臟化膿部位進(jìn)行無菌劃線分別接種到普通瓊脂平板和鮮血瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37°C恒溫培養(yǎng)，在這個(gè)過程中要仔細(xì)觀察細(xì)菌的生長情況，現(xiàn)象表明，分離到的菌株在普通瓊脂平板上生長十分緩慢，96h后仍觀察不到菌落，說明該菌對營養(yǎng)需求較高；在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長48h后，可觀察到直徑為2.0~2.5mm的粘性菌落，如圖1所示。將分離得到的病原菌在LB培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，對得到的純化病原菌菌株進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察結(jié)果如圖2所示，對純化得到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色后發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陰性菌，呈桿狀，短且寬，近橢圓形，長成對或呈短鏈狀。[0044]3.分子鑒定
[0045]取1.5mL步驟2中純培養(yǎng)的菌液離心，按DNA抽提試劑盒說明書提取基因組。PCR擴(kuò)增選用的是細(xì)菌通用引物，在PCR反應(yīng)體系為:2XTaqPCR Master Mix25 μ L，上、下游引物各IuL (50 μ mol/L),模板DNA2 μ L，加ddH20至50 μ L，在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min，94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸45s, 30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin，結(jié)束反應(yīng)后4°C保存。PCR產(chǎn)物采用10g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，電泳結(jié)果如圖3所示。
[0046]將分離純化的病原菌菌株16S rDNA序列與GenBank中已知的相關(guān)核酸序進(jìn)行分析比對，并利用生物軟件MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹。
[0047]將該菌的16SrDNA序列在GenBank進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)所得序列與奧斯陸莫拉菌(Moraxella osloensis，登陸編號為JN084136)同源性高達(dá)99.9%。將所得序列與其相關(guān)性較高的奈瑟氏菌屬(Neisseria)、莫拉克斯氏菌屬(Moraxella)、俊片菌屬(Lampropedia)與副球菌屬(Paracoccus)等4種菌屬的代表菌株16S rDNA進(jìn)行序列比對分析，各代表菌株相關(guān)信息如表1，并利用生物軟件MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化結(jié)果如圖4所示。
[0048]表1系統(tǒng)發(fā)育樹的代表菌株及16rDNA序列信息表
[0049]
【權(quán)利要求】
1.山羊源奧斯陸莫拉菌，其特征在于，生物保藏編號為CCTCCM2014036。
2.生物保藏編號為CCTCC M2014036的山羊源奧斯陸莫拉菌，其特征在于，是從山羊肺炎病例肺臟化膿部位分離得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的山羊源奧斯陸莫拉菌，其特征在于，所述的分離是將肺臟化膿部位采用無菌劃線接種到鮮血清瓊脂平板上，37°C恒溫培養(yǎng)24-48h，分離得到病原菌。
4.山羊源奧斯陸莫拉菌DNA分子鑒定的特異性片段，序列如SEQID NO:1所示。
5.山羊源奧斯陸莫拉菌DNA分子鑒定的特異性片段的制備方法，其特征在于，包括如下進(jìn)行的步驟: (1)取權(quán)利要求2所述的山羊源奧斯陸莫拉菌，提取基因組DNA，制備模板DNA； (2)取步驟(1)中所制備的模板DNA，采用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增所述山羊源奧斯陸莫拉菌的16S rDNA，得到山羊源奧斯陸莫拉菌DNA分子鑒定的特異性片段；所述的通用引物為:上游引物F27，序列如SEQ ID NO:2所示；下游引物R1492，序列如SEQ ID NO:3所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系總體積為50 μ L，含有2 X TaqPCR Master Mix25 μ L，上、下游引物各I μ L,模板DNA2 μ L,余量為水,所述上、下游引物濃度均為50 μ mol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述擴(kuò)增為在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min，94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸45s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin，結(jié)束反應(yīng)后，所得的PCR產(chǎn)物于4°C保存；采用10g/L瓊脂糖凝膠電泳對所述的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，PCR產(chǎn)物序列如SEQ ID NO:1所示。
8.權(quán)利要求4所述的山羊源奧斯陸莫拉菌DNA分子鑒定的特異性片段或特異性片段的互補(bǔ)序列片段在檢測山羊源奧斯陸莫拉菌中的應(yīng)用。
9.檢測山羊源奧斯陸莫拉菌的試劑盒，其特征在于，包括基因組DNA提取試劑和PCR反應(yīng)試劑，所述基因組DNA提取試劑是提取山羊源奧斯陸莫拉菌基因組DNA，所述PCR反應(yīng)試劑包括2XTaqPCR Master Mix、序列如SEQ ID NO:2所示的上游引物F27和序列如SEQ IDNO:3所示的下游引物R1492。
【文檔編號】C12N15/10GK103898006SQ201410041790
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】付利芝, 張素輝, 黃勇富, 沈克飛, 徐登峰, 王可甜, 邱進(jìn)杰 申請人:重慶市畜牧科學(xué)院