鼠灰鏈霉菌amp脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達(dá)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達(dá)方法。該方法以鼠灰鏈霉菌基因組為模板，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增AMP脫氨酶基因序列，在其兩端加入酶切位點(diǎn)和組氨酸標(biāo)簽，并亞克隆至組成型表達(dá)載體pGAP9K以構(gòu)建重組質(zhì)粒，酶切線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，篩選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液上清，即得AMP脫氨酶表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明首次在畢赤酵母中成功表達(dá)了鼠灰鏈霉菌來源的AMP脫氨酶，實(shí)驗(yàn)結(jié)顯示該重組酶具有較高的酶活，且酶活性穩(wěn)定，易于純化，可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，為AMP脫氨酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達(dá)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及AMP脫氨酶基因的真核表達(dá)，具體涉及一種鼠灰鏈霉菌來源的AMP脫氨酶基因的真核表達(dá)方法及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]AMP脫氨酶,英文名為AMP deaminase,簡(jiǎn)寫為AMPD,是一種氨基水解酶,其可催化AMP使其脫去氨基生成肌苷酸(MP)和NH3, MP在食品以及制藥等領(lǐng)域中有重要應(yīng)用。另外，AMP脫氨酶是嘌呤核苷酸代謝循環(huán)中的三種主要酶類之一，對(duì)于維持機(jī)體免疫力和腺苷酸能荷具有重要作用。因此，AMP脫氨酶是工業(yè)生產(chǎn)中一種重要的酶。
[0003]AMP脫氨酶廣泛存在于各種生物體內(nèi)。其最早由鼠骨骼肌制備，隨后又由人紅血細(xì)胞制備，目前工業(yè)化生產(chǎn)中通常由酵母、霉菌等微生物發(fā)酵產(chǎn)AMP脫氨酶，但是在酶的提取純化、酶活性以及穩(wěn)定性等方面存在諸多問題。因此，利用DNA重組技術(shù)，將微生物來源的AMP脫氨酶基因在特定宿主中進(jìn)行重組表達(dá)，可以有效改善上述問題。現(xiàn)在國(guó)內(nèi)關(guān)于AMP脫氨酶基因重組表達(dá)的研究從未報(bào)道過，國(guó)外關(guān)于該酶的重組表達(dá)的研究較少，僅在申請(qǐng)?zhí)枮镃N200580013789.3的專利“放線菌來源的AMP脫氨酶及其應(yīng)用”( 申請(qǐng)人::天野酶株式會(huì)社)中報(bào)道過一次。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本 申請(qǐng)人:經(jīng)過研究改進(jìn)，提供一種鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的真核表達(dá)方法。本發(fā)明首次在畢赤酵母中成功表達(dá)了鼠灰鏈霉菌來源的AMP脫氨酶，實(shí)驗(yàn)結(jié)顯示該重組酶具有較高的酶活，且酶活性穩(wěn)定。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達(dá)方法，其特征在于:以鼠灰鏈霉菌基因組為模板，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增AMP脫氨酶基因序列，在其兩端加入酶切位點(diǎn)和組氨酸標(biāo)簽，并亞克隆至組成型表達(dá)載體PGAP9K以構(gòu)建重組質(zhì)粒，酶切線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，篩選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液上清，即得AMP脫氨酶表達(dá)產(chǎn)物。
[0007]具體地，所述方法步驟如下:
[0008]( 1)鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的克隆
[0009]以鼠灰鏈霉菌基因組為模板，以序列為SEQ ID NO:1和SEQ ID Ν0:2的引物對(duì)通過PCR特異性擴(kuò)增AMP脫氨酶基因，在其兩端均加入EcoRI酶切位點(diǎn)和組氨酸標(biāo)簽，純化回收PCR產(chǎn)物；
[0010](2)重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0011 ] 將組成型表達(dá)載體pGAP9K和步驟(1)所得PCR產(chǎn)物分別用EcoRI酶切純化，連接所得酶切產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化Ε.coli JM109，篩選陽(yáng)性克隆菌株；
[0012](3)線性化重組質(zhì)粒對(duì)畢赤酵母的電轉(zhuǎn)以及陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子的篩選[0013]提取步驟(2)所得陽(yáng)性克隆菌株質(zhì)粒,經(jīng)SacI線性化后電轉(zhuǎn)化Pichia pastorisGS115，使用步驟(1)所述引物對(duì)篩選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子；
[0014](4)重組菌的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
[0015]將步驟(2)所得陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子接種至YPD培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期24h的種子液以體積比3%的接種量接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于30°C、200r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)96h，取發(fā)酵液上清，即得AMP脫氨酶表達(dá)產(chǎn)物；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下:甘油2wt%，蛋白胨 2wt%、酵母膏 lwt%、KH2PO4 0.5wt%, MgSO4.7H20 0.05wt%, pH 值為 6.0。
[0016]優(yōu)選地，步驟(1)所述鼠灰鏈霉菌選自鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)MCCCN0.1A01641。
[0017]本發(fā)明還提供了上述鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達(dá)方法制備得到的AMP脫氨酶表達(dá)產(chǎn)物在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明的有益技術(shù)效果在于:
[0019]本發(fā)明首次以鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因組為模板，通過重組表達(dá)載體PGAP9K-AMPD的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子的篩選、重組菌瓶搖發(fā)酵培養(yǎng)條件(包括培養(yǎng)基碳源、氮源、種子液接種齡、接種量、培養(yǎng)基PH值、發(fā)酵時(shí)間)的精心優(yōu)化和篩選，在畢赤酵母(Pichia pastoris GS115)中成功表達(dá)了鼠灰鏈霉菌來源的AMP脫氨酶；試驗(yàn)結(jié)果顯示:本發(fā)明制備的重組AMP脫氨酶表達(dá)產(chǎn)物具有較高的酶活，酶活性穩(wěn)定，在培養(yǎng)基碳源添加量為2wt%、培養(yǎng)基pH為6.0，接種齡為24h，發(fā)酵時(shí)間96h的發(fā)酵條件下，重組菌GSl 15酶活可達(dá)到2230±60U/ml，且重組酶帶組氨酸標(biāo)簽，易于純化，可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，為AMP脫氨酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。`【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為實(shí)施例2重組表達(dá)質(zhì)粒pGAP9K-AMPD酶切驗(yàn)證電泳圖。
[0021]圖2為實(shí)施例4不同碳源對(duì)GS115重組菌產(chǎn)酶影響的示意圖。
[0022]圖3為實(shí)施例4碳源添加量對(duì)GS115重組菌產(chǎn)酶影響的示意圖。
[0023]圖4為實(shí)施例4不同氮源對(duì)GS115重組菌產(chǎn)酶影響的示意圖。
[0024]圖5為實(shí)施例4接種齡對(duì)GS115重組菌產(chǎn)酶影響的示意圖。
[0025]圖6為實(shí)施例4接種量對(duì)GS115重組菌產(chǎn)酶影響的示意圖。
[0026]圖7為實(shí)施例4發(fā)酵培養(yǎng)基pH對(duì)GSl 15重組菌產(chǎn)酶影響的示意圖。
[0027]圖8為實(shí)施例4不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)GS115重組菌產(chǎn)酶影響的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]以下結(jié)合附圖，并通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說明。
[0029]以下實(shí)施例所涉及實(shí)驗(yàn)材料如下:
[0030]菌株:鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)購(gòu)自中國(guó)海洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC)，保藏編號(hào)MCCC N0.1A01641,以下簡(jiǎn)稱鼠灰鏈霉菌MCCC 1A01641 ；E.coliJM109購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；所述畢赤酵母Pichia pastoris GS115表達(dá)系統(tǒng)購(gòu)自 Invitrogen 公司。
[0031 ] 所涉及其他試劑及試劑盒均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口商品。[0032]實(shí)施例1鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的克隆
[0033]以鼠灰鏈霉菌MCCC 1A01641基因組為模板，設(shè)計(jì)引物對(duì)AMPDF2/AMPDR2特異性擴(kuò)增鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因，在其兩端均加入EcoRI酶切位點(diǎn)(下劃線表示)和組氨酸標(biāo)簽(雙下劃線表示)，引物對(duì)AMPDF2/AMPDR2序列如下:
[0034]AMPDF2:
[0035]5，-GCGGAATTC CATCATCATCATCATCAT GCGCCGCCGCCCCGGCAG-3，(SEQ IDNO:1)；
[0036]AMPDR2:
[0037]5，-GCCGAATTCTCA ATGATGATGATGATGATG CCCCCGGGCGTGCGCCC-3，(SEQID NO:2)；
[0038]用膠純化試劑盒純化所得PCR產(chǎn)物。
[0039]實(shí)施例2重組表達(dá)載體pGAP9K-AMPD的構(gòu)建
[0040]將組成型表達(dá)載體pGAP9K和步驟(1)所得PCR產(chǎn)物分別用EcoRI酶切純化，于16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109，提取pGAP9K-AMPD-JM109菌株質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，篩選出pGAP9K-AMPD-JM109陽(yáng)性菌株。重組表達(dá)質(zhì)粒pGAP9K_AMPD酶切驗(yàn)證電泳圖如圖1所示。
[0041]實(shí)施例3線性化重組質(zhì)粒pGAP9K-AMPD對(duì)GS115的電轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化子的篩選
`[0042]提取實(shí)施例2所得pGAP9K-AMPD-JM109陽(yáng)性菌株質(zhì)粒，經(jīng)SacI線性化后電轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GSl 15,涂布MD平板,3~5天后挑取單菌落,通過蝸牛酶法提取重組質(zhì)粒，使用實(shí)施例1所述特異性引物對(duì)AMPDF2/AMPDR2進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選得到陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子。將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子接種至YPD培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)。
[0043]實(shí)施例4重組菌瓶搖發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化
[0044]4.1考察不同碳源對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響
[0045]以2wt%蛋白胨為氮源，分別以2wt%甘油、乳糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉以及葡萄糖為碳源對(duì)重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明:各種碳源對(duì)重組菌的生長(zhǎng)和酶活影響差別較大，其中以甘油為碳源時(shí)，不僅菌體量達(dá)到最高，而且AMP脫氨酶的酶活也最高；以葡萄糖作為碳源時(shí)，菌體量和酶活也較好，僅次于甘油；但分別以乳糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉為碳源時(shí)，不僅菌體生長(zhǎng)不好，而且酶活很低，因此，選擇甘油作為碳源。在以甘油為碳源時(shí)，繼續(xù)考察甘油的添加量對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響。分別配制含有0.5wt%、lwt%、2wt%、3wt%、4wt%、5wt%甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)重組菌進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，72h后取樣測(cè)菌體濃度和酶活，如圖3所示。結(jié)果表明，當(dāng)甘油濃度< 20g/L時(shí)，菌體濃度和酶活隨著甘油濃度的增加而不斷上升；當(dāng)甘油濃度>20g/L時(shí)，隨著甘油濃度的不斷上升菌體量不再增加，而酶活在逐漸降低，這可能是由于過高的甘油濃度對(duì)重組酶的表達(dá)有抑制作用。因此，選擇2被％的甘油為碳源。
[0046]4.2考察不同氮源對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響
[0047]以2wt%甘油為碳源，分別以2wt%(NH4)2SO4 (A)、KNO3 (B)、麩皮(C)、棉籽粉(D)、玉米漿(E)、蛋白胨(F)、酵母膏(H)、牛肉膏(I)單一氮源以及蛋白胨+酵母膏(2:1) (J)、蛋白胨+牛肉膏(2:1) (K)復(fù)合氮源為氮源進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，72h后測(cè)菌體濃度和酶活，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明:無機(jī)氮源產(chǎn)酶能力較低且菌體生長(zhǎng)相對(duì)較差；有機(jī)氮源更有利于促進(jìn)產(chǎn)酶且有利于菌體的生長(zhǎng)，其中，以蛋白胨+酵母膏(2:1)為氮源時(shí)酶活最大。因此，選取蛋白胨+酵母膏(2:1)作為氮源。
[0048]4.3考察接種齡對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響
[0049]分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期12、16、20、24、28、32、36h的種子液以2%接種量轉(zhuǎn)接至50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(甘油2wt%，蛋白胨2wt%，酵母膏l(xiāng)wt%，KH2PO4 0.5wt%, MgSO4.7Η20
0.05wt%, pH 6.0。)中，搖瓶培養(yǎng)72h后，取樣測(cè)菌體濃度和酶活，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明:對(duì)數(shù)期內(nèi)，菌體濃度隨著菌齡的增大而增加，而酶活在對(duì)數(shù)期20h達(dá)到最大，之后逐漸降低。因此，最適接種齡為20h。
[0050]4.4考察接種量對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響
[0051]將種齡為20h的種子液分別以體積比1%、2%、3%、4%、5%的接種量接到50ml
發(fā)酵培養(yǎng)基(同上)中，72h后取樣測(cè)菌體濃度和酶活，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示:在1%~5%范圍內(nèi)，重組菌的菌體濃度與接種量成正相關(guān)。酶活測(cè)定結(jié)果顯示在接種量為3%時(shí)酶活最大，高于或低于3%接種量時(shí)酶活均有所降低。因此，最佳接種量為3%。
[0052]4.5考察培養(yǎng)基pH對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響
[0053]配制pH 值分別為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 的 50ml 發(fā)
酵培養(yǎng)基(同上)，按20h種齡、體積比3%接種量接入種子液，72h后測(cè)菌體濃度和酶活，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示:pH值為4.0~6.0時(shí)菌體量逐漸增大，pH值為6.0-7.5時(shí)菌體量變化不大；pH值為4.0時(shí)沒有酶活，pH為6.0時(shí)重組酶活性最大，當(dāng)pH大于6.0時(shí)，隨著pH值增大酶活逐漸降低。因此,培養(yǎng)基最適pH確定為6.0。
[0054]4.6考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響
[0055]配制pH值為6.0的50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(同上)，按20h種齡、3%接種量接入種子液，30°C、200r/min 搖瓶培養(yǎng)，分別培養(yǎng) 48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h 后，取樣測(cè)酶活，結(jié)果如圖8所示。結(jié)果顯示:培養(yǎng)96h時(shí)重組酶活性最大。
[0056]實(shí)施例5正交試驗(yàn)
[0057]根據(jù)正交設(shè)計(jì)原理以及實(shí)施例4發(fā)酵培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了四因素三水平正交試驗(yàn)方案，正交試驗(yàn)因素參見表1。
[0058]表1正交試驗(yàn)因素表
[0059]
【權(quán)利要求】
1.鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達(dá)方法，其特征在于:以鼠灰鏈霉菌基因組為模板，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增AMP脫氨酶基因序列，在其兩端加入酶切位點(diǎn)和組氨酸標(biāo)簽，并亞克隆至組成型表達(dá)載體PGAP9K以構(gòu)建重組質(zhì)粒，酶切線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，篩選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液上清，即得AMP脫氨酶表達(dá)產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達(dá)方法，其特征在于具體步驟如下: (1)鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的克隆 以鼠灰鏈霉菌基因組為模板，以序列為SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2的引物對(duì)通過PCR特異性擴(kuò)增AMP脫氨酶基因，在其兩端均加入EcoRI酶切位點(diǎn)和組氨酸標(biāo)簽，純化回收PCR產(chǎn)物； (2)重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將組成型表達(dá)載體PGAP9K和步驟(1)所得PCR產(chǎn)物分別用EcoRI酶切純化，連接所得酶切產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化E.coli JM109，篩選陽(yáng)性克隆菌株； (3)線性化重組質(zhì)粒對(duì)畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化以及陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子的篩選 提取步驟(2)所得陽(yáng)性克隆菌株質(zhì)粒，經(jīng)SacI線性化后電轉(zhuǎn)化Pichia pastorisGS115，使用步驟(1)所述引物對(duì)篩選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子； (4)重組菌的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將步驟(2)所得陽(yáng)性 克隆轉(zhuǎn)化子接種至YPD培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期24h的種子液以體積比3%的接種量接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于30°C、200r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)96h，取發(fā)酵液上清，即得AMP脫氨酶表達(dá)產(chǎn)物；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下:甘油2wt%，蛋白胨 2wt%、酵母膏 lwt%、KH2PO40.5wt%, MgSO4.7H20 0.05wt%, pH 值為 6.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達(dá)方法，其特征在于:步驟(1)所述鼠灰鏈霉菌選自鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus) MCCCN0.1A01641。
4.權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述鼠灰鏈霉菌AMP脫氨酶基因的畢赤酵母真核表達(dá)方法制備得到的AMP脫氨酶表達(dá)產(chǎn)物在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/84GK103805629SQ201410042060
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】張梁, 石貴陽(yáng), 方煒, 丁重陽(yáng), 顧正華 申請(qǐng)人:江南大學(xué)