一種來源于小眼蟲的δ4脂肪酸去飽和酶及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種來源于小眼蟲的Δ4脂肪酸去飽和酶及其應(yīng)用。本發(fā)明公開的一種蛋白，為如下（1）或（2）所示：（1）SEQ?ID?No.2所示的蛋白；（2）將SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。本發(fā)明公開的一種Δ4脂肪酸去飽和酶可以促進哺乳動物中生產(chǎn)高水平的DHA等重要的長鏈多不飽和脂肪酸，同時也能將哺乳動物細胞或動物中利用各種方法產(chǎn)生的DPA轉(zhuǎn)化為DHA。
【專利說明】一種來源于小眼蟲的Δ 4脂肪酸去飽和酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種來源于小眼蟲的λ 4脂肪酸去飽和酶及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酸分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸(PUFAs)。其中，PUFAs對人體具有更為獨特的作用和意義，是一類被廣泛研究和備受關(guān)注的脂肪酸。PUFAs包括ω-3和ω-ePUFAs兩種類型，每一種類型又包括多個碳鏈長度不同、不飽和鍵數(shù)量不等的成員。碳鏈長度≥20的PUFAs被稱為長鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFAs)，最重要的LCPUFAs包括DHA (22:6n-3)、EPA (20:5n_3)和ARA (20:4n_6，即花生四烯酸)，它們是生物體內(nèi)生物活性最強的三種不飽和脂肪酸，已經(jīng)被證實在促進大腦發(fā)育和功能維持以及在預(yù)防和治療心血管疾病、炎癥、癌癥等多種疾病方面有著重要作用。相對于其他一些生物，人類及其他哺乳動物自身合成PUFAs的能力很低，原因如下:首先，哺乳動物不能從乙酰輔酶A開始合成PUFAs，僅能夠以來源于食物的LA (18:2n-6，即亞油酸)和ALA (18:3n-3,即α-亞麻酸)為底物，利用自身的脂肪酸去飽和酶及延長酶活性合成相應(yīng)的PUFAs ;其次，哺乳動物中這些脂肪酸去飽和酶及延長酶活性是很有限的，故只能最終合成有限的一小部分PUFAs ；再次，哺乳動物中還缺失一些其他生物擁有的脂肪酸去飽和酶及延長酶活性而使得一些重要的長鏈多不飽和脂肪酸尤其是DHA的合成極為困難。因此，人體對更多的PUFAs需求主要依靠從食物來源獲取。但是自然界中o-6PUFAs豐富而o-3PUFAs稀缺,從而致使人體中攝入和積累的o-6PUFAs過多而co-3PUFAs過少。而哺乳動物中不存在使co-6PUFAs轉(zhuǎn)變?yōu)閛-3PUFAs的酶活性，故人體中co-6PUFAs和ω-3PUFAs的比例嚴重失衡。co-6PUFAs雖然對人體也不可或缺，但其過量的攝入反而危害人體健康。
[0003]現(xiàn)代人的生活和飲食模式導(dǎo)致了脂肪酸的攝取嚴重不平衡。這種不平衡體現(xiàn)在以下幾個層次。第一個層次是飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸之間的不平衡，即大多數(shù)情況下人體攝入了過多的飽和脂肪酸(主要來自動物油脂)，而不飽和脂肪酸不足；第二個層次是攝入的不飽和脂肪酸中ω-6系不飽和脂肪酸與ω-3系不飽和脂肪酸之間的不平衡，即ω-6系不飽和脂肪酸過多而ω-3系不飽和脂肪酸過少；第三個層次是攝入的不飽和脂肪酸中，短鏈不飽和脂肪酸(18C)與長鏈不飽和脂肪酸(20C~22C)的不平衡，即短鏈不飽和脂肪酸多，長鏈不飽和脂肪酸少。大多數(shù)常用植物油如大豆油、花生油、葵花籽油等都含有很高水平的短鏈的ω-6不飽和脂肪酸即LA (18:2η-6，即亞油酸)，亞麻籽油、紫蘇籽油等雖然含有高水平的短鏈的ω-3不飽和脂肪酸即ALA (18:3η-3，即α -亞麻酸)，但它們并非日常生活中常用油。深海魚油是長鏈多不飽和脂肪酸EPA和DHA的主要提供者，但價格昂貴，資源稀少，食用人群有限，所以它并沒有在大范圍內(nèi)改變?nèi)祟愔舅釘z入不平衡的狀態(tài)。由此可見，脂肪酸的不平衡正好體現(xiàn)在DHA (22:6η-3)、ΕΡΑ (20:5η_3)和ARA (20:4η_6)這三種最具生物活性的長鏈多不飽和脂肪酸的缺乏。也就是說，如果能夠獲得豐富的DHA (22:6η-3)、ΕΡΑ (20:5η_3)和ARA (20:4η_6)資源供人類攝取就能夠改變目前人類脂肪酸攝取不平衡的現(xiàn)狀。[0004]如何獲取豐富的DHA (22:6n_3)、EPA (20:5n_3)和 ARA (20:4n_6)資源是當今世界范圍內(nèi)人們所關(guān)心的一個問題。在深海魚油面臨資源枯竭以及污染日益嚴重的現(xiàn)狀下，利用一些海洋藻類和真菌類等EPA (20:5n-3)、DHA (22:6n_3)的初始生產(chǎn)者獲取這些長鏈多不飽和脂肪酸成為很好的選擇，目前開發(fā)也獲得很大的成功。然而，這些產(chǎn)品通常作為食品添加劑使用有一定的局限性，其保存需要嚴格的措施、其口味不佳難以長期使用?？梢栽O(shè)想，如果陸地動物如豬牛羊等家畜能夠像深海魚一樣可以提供DHA (22:6n-3)、EPA (20:5n-3)和ARA (20:4n_6)等不飽和脂肪酸的話，那么其資源的豐富性將產(chǎn)生革命性的變化，而且在不影響和改變?nèi)藗兩盍晳T的情況下就能獲取這些重要的脂肪酸，這對人類健康將產(chǎn)生深遠的影響。但是，正如前面所提及的，哺乳動物合成DHA (22:6n-3)、EPA (20:5n_3)和ARA (20:4n-6)是極為有限的，要提高其含量，就必須從相應(yīng)的多不飽和脂肪酸合成酶著手。相關(guān)的研究基礎(chǔ)已經(jīng)顯示，通過轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)在哺乳動物中來生產(chǎn)這些長鏈多不飽和脂肪酸是有可能的。1997年,James P等從線蟲C.elegans中篩選克隆了第一個動物Δ 15去飽和酶基因，命名為fat-Ι，在后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)fat-Ι基因可以將16~20碳ω -6PUFAs去飽和變成o-3PUFAs。Zhao B.Kang等將fat_l基因轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞，ω -6/ ω -3PUFAs比從15:1下降到1:1，使哺乳動物的o-3PUFAs含量顯著地提高。之后又于2004年將fat_l基因轉(zhuǎn)入小鼠，使得ALA、EPA、DPA等co-3PUFAs均顯著提高。2006年，Lai等制備的fat_l的轉(zhuǎn)基因豬，也表現(xiàn)出了與轉(zhuǎn)基因小鼠類似的情況。然而，這些轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)所合成的co-3PUFAs中以18C、20C的co-3PUFAs為主，而更為重要的22C的DHA (22:6n_3)總量仍然很少。事實上，后續(xù)的一些研究表明fat-Ι的Δ 15去飽和酶活性并不能增加這些動物體內(nèi)的DHA (22:6n-3)含量。因此，fat_l基因用于提高哺乳動物長鏈多不飽和脂肪酸含量的實踐中，關(guān)鍵性的缺憾就是不能增加DHA (22:6n-3)的含量。
[0005]事實上，DHA (22: 6n_3)在哺乳動物中的合成很復(fù)雜，要經(jīng)過一個所謂的“Sprecher通路”，EPAC 20: 5n-3)延長生成一個中間產(chǎn)物DPA( 22: 5n_3)后，再進一步延伸為24: 5n_3，然后迅速被Λ 6去飽 和酶作用生成24: 6η-3，之后進一步經(jīng)β -氧化作用產(chǎn)生DHA( 22: 6n_3 )，這種復(fù)雜的機制可能是哺乳動物難以合成高水平DHA (22:6n-3)的原因。有關(guān)多不飽和脂肪酸生物合成途徑如圖1所示。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種來源于小眼蟲的Λ 4脂肪酸去飽和酶及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供的一種蛋白，為如下(I)或(2)所示:
[0008](I) SEQ ID N0.2 所示的蛋白；
[0009](2)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。
[0010]上述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0011]上述編碼基因中，所述編碼基因為如下中至少一種:
[0012]I) SEQ ID N0.1中自5’末端起第10位至第1635位核苷酸所示的DNA分子；
[0013]2)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0014]3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。[0015]含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0016]一種蛋白組合物也屬于本發(fā)明的保護范圍，由SEQ ID N0.2所示的蛋白和SEQ IDN0.4所示的蛋白組成。
[0017]一種蛋白組合物也屬于本發(fā)明的保護范圍，由SEQ ID N0.2所示的蛋白、SEQ IDN0.5所示的蛋白和SEQ ID N0.6所示的蛋白組成。
[0018]一種提高哺乳動物細胞中DHA (22:6n-3)合成能力的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍，包括如下步驟:將所述蛋白的編碼基因?qū)氲匠霭l(fā)細胞中，得到轉(zhuǎn)基因細胞；與出發(fā)細胞相比，轉(zhuǎn)基因細胞的DHA (22:6n-3)合成能力提高。
[0019]上述方法中，所述編碼基因是通過重組表達載體導(dǎo)入的，所述重組表達載體是將所述編碼基因插入出發(fā)載體PCDNA3.1(_)的多克隆位點得到的。
[0020]上述蛋白在制備促進DHA (22: 6n_3 )合成的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0021]或，
[0022]上述任一所述的蛋白組合物在制備促進DHA (22:6n_3)合成的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0023]上述蛋白在制備促進0?么(22:511-3)轉(zhuǎn)化成0撤(22:611-3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0024]或，
[0025]上述任一所述的蛋白組合物在制備促進DPA (22:5n-3)轉(zhuǎn)化成DHA (22: 6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0026]或，
[0027]上述蛋白在制備促進Λ 15脂肪酸去飽和酶將DPA(22:5n-3)轉(zhuǎn)化成DHA(22:6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0028]或，
[0029]上述蛋白在制備促進Λ 15脂肪酸去飽和酶將LA(18:2n-6)和/或ARA (20: 4n_6)轉(zhuǎn)化成DHA(22:6n-3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0030]所述Λ 15脂肪酸去飽和酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示；
[0031]或，
[0032]上述蛋白在制備促進Λ6-脂肪酸去飽和酶和Λ5-脂肪酸去飽和酶將DPA(22:5n-3)轉(zhuǎn)化成DHA(22:6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0033]上述蛋白在制備促進Λ6-脂肪酸去飽和酶和Λ5-脂肪酸去飽和酶將LA(18:2n-6)和/或ALA(18:3n_3)轉(zhuǎn)化成DHA(22:6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0034]所述Λ 6-脂肪酸去飽和酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示；
[0035]所述Λ 5-脂肪酸去飽和酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示。
[0036]本發(fā)明提供的一種Λ4脂肪酸去飽和酶，通過配合或協(xié)同其他脂肪酸去飽和酶(Λ 15或Λ6/Λ5)的作用，可以促進基因轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞以及轉(zhuǎn)基因動物將添加的初始脂肪酸底物如LA(18:2n-6)或ALA(18:3n_3)轉(zhuǎn)化成為高水平的DHA (22:6n_3)等重要的長鏈多不飽和脂肪酸，同時也能將哺乳動物細胞或動物中利用各種方法產(chǎn)生的DPA轉(zhuǎn)化為 DHA。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為多不飽和脂肪酸生物合成途徑。
[0038]圖2 為 pcDNA3.l_sEgD4 載體示意圖。
[0039]圖3為轉(zhuǎn)sEgD4基因細胞中目的基因的表達鑒定。
[0040]圖4為GC-MS檢測結(jié)果。
[0041]圖5為實施例2中轉(zhuǎn)基因細胞的鑒定。
[0042]圖6為Λ 4脂肪酸去飽和酶與Λ 15脂肪酸去飽和酶的協(xié)同作用分析。
[0043]圖7為實施例3中轉(zhuǎn)基因細胞的鑒定。
[0044]圖8為Λ 4脂肪酸去飽和酶與Λ 6/ Λ 5脂肪酸去飽和酶的協(xié)同作用分析。
【具體實施方式】
[0045]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0046]下述實施例中所用 的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0047]中國倉鼠卵巢(CHO)細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所基礎(chǔ)醫(yī)學細胞中心。
[0048]pEGFP-Nl 購自 Clontech 公司。
[0049]pcDNA3.1(-)購自 Invitrogen 公司。
[0050]pcDNA3.1-EGFP的構(gòu)建方法如下:
[0051]一、以 pEGFP-Nl 為模板，用引物 fG-s:5' -TCTAGATCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3'和fG-a:5' -CTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3'進行 PCR 擴增，得到 PCR 擴增產(chǎn)物，此產(chǎn)物為EGFP基因編碼區(qū)(725bp)；
[0052]二、Xba I和Xho I雙酶切步驟一得到的PCR擴增產(chǎn)物，得到基因片段；Xba I和Xho I雙酶切pcDNA3.1 (_)，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pcDNA3.1-EGFP。
[0053]pMD18-T購自寶生物工程(大連)有限公司。
[0054]pcDNA3.1-F2F1的構(gòu)建方法在文獻“汪坤福，朱貴明，張莉等。脂肪酸合成酶系多基因表達載體的構(gòu)建。中國老年學雜志，2013，33 (17)，4178-4180”中公開過，公眾可從佳木斯大學獲得。
[0055]實施例1、Λ 4脂肪酸去飽和酶基因(sEgD4基因)的合成及其功能驗證
[0056]一、Λ4脂肪酸去飽和酶基因(sEgD4基因)的合成
[0057]對GenBank中提交的小眼蟲(Euglena gracilis)的Δ4脂肪酸去飽和酶基因(GenBank號:AY278558)的cDNA序列(編碼框全長為1626bp)進行密碼子優(yōu)化，使之符合哺乳動物基因密碼子使用偏好。優(yōu)化后使用軟件預(yù)測其mRNA的二級結(jié)構(gòu)，驗證密碼子優(yōu)化是
否合理。
[0058]優(yōu)化后的Λ 4脂肪酸去飽和酶基因(sEgD4基因)的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中自5’末端起第10位至第1635位核苷酸所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。[0059]將優(yōu)化后的序列在兩端加上EcoRI和HindIII酶切位點，然后進行全長基因的人工合成，全長序列如SEQ ID N0.1所示。
[0060]二、將 SEQ ID N0.1 所示的序列與 T 載體(pMD18_T)連接，得到 pMD18T_sEgD4重組質(zhì)粒；用EcoRI和HindIII雙酶切pMD18T_sEgD4，得到基因片段；EcoRI和HindIII雙酶切真核表達載體PCDNA3.1 (-)，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組表達質(zhì)粒，將其命名為pcDNA3.l-sEgD4。將pcDNA3.l_sEgD4送測序，結(jié)果正確。pcDNA3.l-sEgD4載體的示意圖如圖2所示。
[0061]三、Λ4脂肪酸去飽和酶基因(sEgD4基因)的功能驗證
[0062](一)CHO細胞的培養(yǎng)
[0063]培養(yǎng)基組成:DMEM高糖培養(yǎng)基，10 %胎牛血清，I %青鏈霉素(IOOX )，I %非必需氨基酸，lg/100ml丙酮酸鈉，0.22 μ M濾膜過濾除菌，%均代表體積百分含量。
[0064]中國倉鼠卵巢(CHO)細胞以5X105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，于37°C、5%C02及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0065](二)脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染CHO細胞
[0066]1、轉(zhuǎn)染前的準備:用pcDNA3.l_sEgD4瞬時轉(zhuǎn)染CHO細胞(實驗組)，以含增強型綠色熒光蛋白的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP為對照瞬時轉(zhuǎn)染CHO細胞(對照組)，監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染前一天將培養(yǎng)的CHO細胞傳代至60mm培養(yǎng)皿，添加lOymol/L的脂肪酸底物即DPA(22:5n-3),當細胞長至90%~95%進行轉(zhuǎn)染。
`[0067]2、轉(zhuǎn)染:向1.5ml EP管中加500 μ I DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再力卩入8 μ gpcDNA3.l-sEgD4或pcDNA3.1-EGFP后輕輕混勻，標為A液；向另一 1.5ml EP管中加500 μ I DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再加入20 μ I轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000后混合均勻，標為B液,室溫孵育5min。將A和B加到一個管中混勻，室溫靜置20min,得混合液。然后將混合液加到CHO細胞的60mm培養(yǎng)皿輕輕混勻，37°C，5%C02培養(yǎng)4_6h后，吸棄孔中的液體，換新鮮培養(yǎng)基(同樣含Ιθμπιο?/L的DPA)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后次日開始可用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，48h后收集得到的實驗組和對照組的細胞用于后續(xù)檢測和實驗。
[0068](三)RT-PCR進行轉(zhuǎn)基因細胞的鑒定
[0069]1、總RNA的提取:取轉(zhuǎn)染48h后的實驗組和對照組的細胞用TRizol試劑提取總RNA,并測定RNA濃度，最后將提取的RNA置于_80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0070]2、mRNA的反轉(zhuǎn)錄:將實驗組和對照組的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為420C 30min ；95°C 5min ；5°C 5min ;4°C保存。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，將cDNA置于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0071]3、PCR檢測目的基因sEgD4的表達，并以β-actin為內(nèi)參基因
[0072]①sEgD4基因的檢測引物:
[0073]D4d-s:5，-TCATCATCAACCACATCAGCGAG-3，Tm:63.2°C
[0074]D4d-a:5’ -TTTAGCTCTTCTTGTCGCCGTTG-3’ Tm:63.8°C
[0075]目的產(chǎn)物長度為426bp。
[0076]②β -actin內(nèi)參基因檢測引物:
[0077]Bact-s:5，-CTGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3，Tm:65.7°C
[0078]Bact-a:5，-TGCCACAGGATTCCATACCCAAG-3，Tm:65.7°C
[0079]目的產(chǎn)物長度為2IObp。[0080]以步驟2制備的實驗組的cDNA為模板，分別以D4d_s和D4d-a、Bact_s和Bact-a為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物I。
[0081]以步驟2制備的對照組的cDNA為模板，分別以D4d_s和D4d-a、Bact_s和Bact-a為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物2。
[0082]取PCR擴增產(chǎn)物I和2進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。
[0083]圖3中，I為PCR擴增產(chǎn)物2 ;2為PCR擴增產(chǎn)物I。
[0084]圖3表明，pcDNA3.l_sEgD4轉(zhuǎn)染的CHO細胞中檢測到目的基因sEgD4的轉(zhuǎn)錄，而轉(zhuǎn)染含增強型綠色熒光蛋白的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP的CHO細胞中沒有檢測到目的基因sEgD4，證明實驗組轉(zhuǎn)sEgD4基因細胞構(gòu)建成功。
[0085](四)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)(GC-MS)檢測脂肪酸的組成變化
[0086]1、總脂肪酸的提取:將轉(zhuǎn)染48h后的實驗組和對照組的培養(yǎng)皿中的細胞分別用
0.4ml胰蛋白酶37°C消化3min，用Iml含血清培養(yǎng)基終止胰蛋白的作用，用去離子水漂洗一次，lOOOrpm，離心5min，加入Iml體積百分含量為2.5%H2S04的甲醇溶液，輕輕混勻，80°C水浴90min，待冷卻至室溫，加入1.5ml0.9g/100ml的NaCl溶液和Iml正己烷，震蕩，2000rpm，離心5min，將脂肪酸萃取到有機相(即正己烷)中，吸取實驗組或?qū)φ战M的有機相萃取物經(jīng)氮氣吹干濃縮后用于GC-MS檢測分析，或于_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0087]2、GC-MS檢測:檢測時使用儀器為ΗΡ_5890/ΗΡ_5971氣質(zhì)聯(lián)用分析儀，實驗條件按照常規(guī)不飽和脂肪酸的檢測分析要求進行，具體參考文獻“Kang ZB, Ge Y, Chen Z, etal.Adenoviral gene transfer of Caenorhabditis elegans n-3fatty acid desaturaseoptimizes fatty acid composition in mammalian cells.Proc Natl Acad SciUSA, 2002，98 (7): 405 0 - 4054”。
[0088]結(jié)果如圖4所示，圖4中，A為對照組GC-MS檢測結(jié)果；B為實驗組GC-MS檢測結(jié)
果O
[0089]圖4表明，添加DPA (22: 5n_3)底物后，實驗組較對照組DHA (22: 6n_3)的合成量顯著增加，差異極顯著，說明sEgD4基因表達厶4脂肪酸去飽和酶在合成0撤(22:611-3)的過程中發(fā)揮了其作用，將DPA(22:5n-3)直接轉(zhuǎn)化成為DHA(22:6n_3)。
[0090]實施例2、哺乳動物細胞中sEgD4基因編碼的Λ 4脂肪酸去飽和酶與Λ 15脂肪酸去飽和酶的協(xié)同作用
[0091]一、根據(jù)研究報道，來源于線蟲C.elegans的fat-Ι基因(GenBank號:NM_001028389)的表達產(chǎn)物具有Λ 15脂肪酸去飽和酶活性，將fat_l基因進行密碼子優(yōu)化設(shè)計、人工合成的序列如SEQ ID N0.3所示。
[0092]該Λ 15脂肪酸去飽和酶的編碼基因序列如SEQ ID N0.3中自5’末端起第13位至第1221位核苷酸所示，Δ 15脂肪酸去飽和酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0093]按照實施例1步驟二的方法得到重組表達質(zhì)粒pcDNA3.l_sD15。
[0094]二、按照實例I中步驟三的細胞轉(zhuǎn)染方法，分別將表達質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP,pcDNA3.l-sD15、pcDNA3.l_sD15+pcDNA3.l_sEgD4 轉(zhuǎn)染鋪板于 60mm 平皿的 CHO 細胞，每個轉(zhuǎn)染組所用質(zhì)粒均為8 μ g (pcDNA3.l_sD15+pcDNA3.l_sEgD4中兩種質(zhì)粒各4 μ g),并與細胞培養(yǎng)基中添加lOymol/L的底物亞油酸LA(18:2n_6)及10 μ mol/L花生四烯酸ARA(20:4n-6)培養(yǎng)48h后，收集細胞，一部分用于提取總RNA，進行RT-PCR鑒定和檢測基因表達的轉(zhuǎn)錄水平，方法同實施例1中步驟三的(三)，結(jié)果如圖5所示；另一部分用于提取細胞中脂肪酸，進行GC-MS分析脂肪酸組成，方法同實施例1中步驟三的(四)，結(jié)果如圖6所
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[0095]圖5中，I代表pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染組(對照組)；2代表pcDNA3.l_sD15轉(zhuǎn)染組；3代表 pcDNA3.l-sD15+pcDNA3.l_sEgD4 轉(zhuǎn)染組。
[0096]圖5表明，目的基因sD15、sD15和sEgD4按照預(yù)期在相應(yīng)的細胞中實現(xiàn)了表達，不含目的基因表達質(zhì)粒的pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染組(對照組)則檢測不到目的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0097]圖6 中，EGFP 代表 pcDNA3.1-EGFP 轉(zhuǎn)染組(對照組)；sD15 代表 pcDNA3.l_sD15 轉(zhuǎn)染組；sD15+sEgD4 代表 pcDNA3.l_sD15+pcDNA3.l_sEgD4 轉(zhuǎn)染組。
[0098]Δ 15脂肪酸去飽和酶將添加的一部分LA(18:2n-6)轉(zhuǎn)化為ALA(18:3n_3)(這部分ALA(18:3n-3)按ω-3途徑經(jīng)兩步代謝后成為EPA (20: 5η_3))，另一部分LA (18: 2η_6)被細胞內(nèi)本身所擁有的去飽和酶和延長酶活性通過兩步轉(zhuǎn)化而成為ARA(20:4n-6)。這部分ARA(20:4n-6)同添加的ARA(20:4n_6) —起被Λ 15脂肪酸去飽和酶部分轉(zhuǎn)化為ΕΡΑ(20:5η-3)。仍然有一部分ARA(20:4η_6)未被轉(zhuǎn)化成為EPA(20:5η_3)則被細胞內(nèi)本身所擁有的延長酶活性轉(zhuǎn)化為ADA(22:4n-6)。Λ 15脂肪酸去飽和酶此時可將ADA (22: 4η_6)轉(zhuǎn)化為DPA(22:5n-3)，還有一部分DPA (22: 5n_3)由EPA (20: 5n_3)經(jīng)過細胞內(nèi)延長酶作用而產(chǎn)生。經(jīng)過Sprecher通路將DPA(22:5n-3)轉(zhuǎn)化成為DHA(22:6n_3)的量并不顯著，但在sD15+sEgD4轉(zhuǎn)染組中由Λ 4脂肪酸去飽和酶則可以進一步將積累的DPA(22:5n_3)直接轉(zhuǎn)化為DHA(22:6n-3)，其數(shù)量的增加是非常顯著的。上述多不飽和脂肪酸的代謝轉(zhuǎn)化過程可參見圖1。
[0099]圖6 表明，與對照組相比，pcDNA3.l_sD15、pcDNA3.l_sD15+pcDNA3.l_sEgD4 兩組轉(zhuǎn)染組中0-6系？現(xiàn)么8如1^(18:211-6)、六狀(20:411-6)及ADA(22:4n_6)均顯著降低，而 ω -3 系 PUFAs 中 ALA (18: 3η_3)及 EPA (20: 5η_3)均顯著增加。但是，DPA (22: 5η_3)和DHA(22:6n-3)情況完全不同:與對照組相比，pcDNA3.l_sD15轉(zhuǎn)染組中DPA(22:5n_3)顯著增加，而sD15+sEgD4轉(zhuǎn)染組中DPA(22:5n-3)含量基本與對照組持平；sD15轉(zhuǎn)染組中DHA(22:6n-3)含量基本與對照組持平，而pcDNA3.l_sD15+pcDNA3.l_sEgD4轉(zhuǎn)染組中DHA(22:6n-3)含量則顯著增加(其含量占多不飽和脂肪酸總含量的近10%)。
[0100]結(jié)果表明，sEgD4基因編碼的Λ 4脂肪酸去飽和酶可與Λ 15脂肪酸去飽和酶協(xié)同作用，在哺乳動物細胞內(nèi)，利用sEgD4基因編碼的Λ 4脂肪酸去飽和酶可以促進Λ 15脂肪酸去飽和酶活性，將添加的亞油酸及花生四烯酸轉(zhuǎn)化為較高水平的DHA(22:6n-3)，與只添加Λ 15脂肪酸去飽和酶相比，含量提高約I倍。
[0101]實施例3、哺乳動物細胞中sEgD4基因編碼的Λ 4脂肪酸去飽和酶與Λ 6/ Λ 5脂肪酸去飽和酶的協(xié)同作用
[0102]pcDNA3.1-F2F1為含有來源于小鼠的Λ 6_脂肪酸去飽和酶基因fads2 (GenBank號:BC057189)和Λ 5-脂肪酸去飽和酶基因fadsl (GenBank號:BC063053)的雙基因表達載體。
[0103]Λ 6-脂肪酸去飽和酶的編碼基因序列如SEQ ID N0.5所示，該蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0.6 所示。
[0104]Λ 5-脂肪酸去飽和酶的編碼基因序列如SEQ ID N0.7所示，該蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0.8 所示。
[0105]按照實例I中步驟三的細胞轉(zhuǎn)染方法，分別將表達質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP,pcDNA3.1-F2F1、pcDNA3.l_F2Fl+pcDNA3.l_sEgD4 轉(zhuǎn)染鋪板于 60mm 平皿的 CHO 細胞，每個轉(zhuǎn)染組所用質(zhì)粒均為8μ g (pcDNA3.l-F2Fl+pcDNA3.l_sEgD4中兩種質(zhì)粒各4 μ g)，并與細胞培養(yǎng)基中添加1(^11101/1的脂肪酸底物亞油酸1^(18:211-6)和10 μ mol/L α -亞麻酸ALA(18:3n-3)培養(yǎng)48h后，收集細胞，一部分用于提取總RNA，進行RT-PCR鑒定和檢測轉(zhuǎn)基因表達的轉(zhuǎn)錄水平，方法同實施例1中步驟三的(三)，結(jié)果如圖7所示；另一部分用于提取細胞中脂肪酸，進行GC-MS分析脂肪酸組成，方法同實施例1中步驟三的(四)，結(jié)果如圖8所示。
[0106]圖7中，I代表pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染組(對照組)；2代表pcDNA3.1-F2F1轉(zhuǎn)染組；3代表 pcDNA3.l-F2Fl+pcDNA3.l_sEgD4 轉(zhuǎn)染組。
[0107]圖7表明，轉(zhuǎn)染的目的基因f ads2和fads 1、f ads2、fads I和sEgD4按照預(yù)期在相應(yīng)的細胞中實現(xiàn)了超表達，其轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組；不含目的基因表達質(zhì)粒的pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染組(對照組)則檢測不到sEgD4基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0108]圖8 中，EGFP 代表 pcDNA3.1-EGFP 轉(zhuǎn)染組(對照組)；F2F1 代表 pcDNA3.1-F2F1 轉(zhuǎn)染組；F2Fl+sEgD4 代表 pcDNA3.l_F2Fl+pcDNA3.l_sEgD4 轉(zhuǎn)染組。
[0109]圖8中各物質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程如實施例2中所述。
[0110]圖8表明，與對照組相比，pcDNA3.1-F2F1轉(zhuǎn)染組中，Λ 6/Λ 5脂肪酸去飽和酶活性的增加能夠促使添加的脂 肪酸底物LA (18: 2η-6)顯著地轉(zhuǎn)變?yōu)锳RA (20: 4η_6)，Λ 6/ Λ 5脂肪酸去飽和酶活性的增加使添加的脂肪酸底物ALA(18:3n-3)轉(zhuǎn)變?yōu)楦嗟腅PA(20:5n_3)和DPA(22:5n-3)，但Λ 6/Λ 5脂肪酸去飽和酶活性并沒有顯著地提高DHA (22: 6n_3)的含量。與 pcDNA3.1-F2F1 轉(zhuǎn)染組相比，在 pcDNA3.l_F2Fl+pcDNA3.l_sEgD4 轉(zhuǎn)染組中，EgD4 基因編碼的Λ 4脂肪酸去飽和酶協(xié)同Λ 6/Λ 5脂肪酸去飽和酶的活性，將DPA (22:5η-3)直接轉(zhuǎn)化成為更高水平的DHA(22:6n-3)，DHA(22:6n-3)的含量較pcDNA3.1-F2F1轉(zhuǎn)染組提高了約1.5倍，占多不飽和脂肪酸總含量近30%。
[0111]結(jié)果表明，在哺乳動物細胞內(nèi)，EgD4基因編碼的Λ 4脂肪酸去飽和酶可以協(xié)同Λ6/Λ5脂肪酸去飽和酶的作用將ω-3系的α -亞麻酸ALA(18:3η_3)轉(zhuǎn)化為高水平DHA(22:6n-3)。
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白，為如下(I)或(2)所示: Cl) SEQ ID N0.2所示的蛋白； (2)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因為如下中至少一種: O SEQ ID N0.1中自5’末端起第10位至第1635位核苷酸所示的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.一種蛋白組合物，由SEQ ID N0.2所示的蛋白和SEQ ID N0.4所示的蛋白組成。
6.一種蛋白組合物，由SEQ ID N0.2所示的蛋白、SEQ ID N0.5所示的蛋白和SEQ IDN0.6所示的蛋白組成。
7.一種提高哺乳動物細胞中DHA (22:6n-3)合成能力的方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求I所述蛋白的編碼基因?qū)氲匠霭l(fā)細胞中，得到轉(zhuǎn)基因細胞；與出發(fā)細胞相比，轉(zhuǎn)基因細胞的DHA (22:6n-3)合成能力提高。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述編碼基因是通過重組表達載體導(dǎo)入的，所述重組表達載體是將所述編碼基因插入出發(fā)載體PCDNA3.1(_)的多克隆位點得到的。
9.權(quán)利要求1所述的蛋白在制備促進DHA(22:6n-3)合成的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或， 權(quán)利要求5或6所述的蛋白組合物在制備促進DHA (22:6n_3)合成的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的蛋白在制備促進DPA(22:5n-3)轉(zhuǎn)化成DHA(22:6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或， 權(quán)利要求5或6所述的蛋白組合物在制備促進DPA (22:5n-3)轉(zhuǎn)化成DHA (22: 6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或， 權(quán)利要求1所述的蛋白在制備促進Λ 15脂肪酸去飽和酶將DPA(22:5n-3)轉(zhuǎn)化成DHA(22:6n-3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或， 權(quán)利要求1所述的蛋白在制備促進Λ 15脂肪酸去飽和酶將LA(18:2n-6)和/或ARA(20:4n-6)轉(zhuǎn)化成DHA (22: 6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述Λ 15脂肪酸去飽和酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示； 或， 權(quán)利要求1所述的蛋白在制備促進Λ6-脂肪酸去飽和酶和Λ5-脂肪酸去飽和酶將DPA(22:5n-3)轉(zhuǎn)化成DHA (22: 6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或，權(quán)利要求1所述的蛋白在制備促進Λ6-脂肪酸去飽和酶和Λ5-脂肪酸去飽和酶將LA(18:2n-6)和 / 或 ALA (18: 3n_3)轉(zhuǎn)化成 DHA (22: 6n_3)的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述Λ 6-脂肪酸去飽和酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示； 所述Λ 5-脂肪酸去飽和酶的氨·基酸序列如SEQ ID N0.8所示。
【文檔編號】C12N15/53GK103820402SQ201410043571
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月29日
【發(fā)明者】朱貴明, 王淑秋, 孫潔, 王迪迪, 葛堂棟, 江旭東, 樸金花 申請人:佳木斯大學