長(zhǎng)fish探針的合成的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及長(zhǎng)FISH探針的合成，具體地提供了一種方法，其包括：合成包含與染色體中的獨(dú)特序列雜交的探針序列的一組重疊的寡核苷酸；以一定方式組裝所述重疊的寡核苷酸從而產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸，每個(gè)雙鏈多核苷酸均包含多個(gè)探針序列；標(biāo)記該一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸而產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記探針；和將所述標(biāo)記探針與完整染色體原位雜交。
【專(zhuān)利說(shuō)明】長(zhǎng)FISH探針的合成

【背景技術(shù)】
[0001] 染色體重排、缺失和其它畸變久已被與遺傳疾病關(guān)聯(lián)。染色體結(jié)構(gòu)異常經(jīng)常 起因于同源重組中的錯(cuò)誤。非整數(shù)倍性（Aneuploidy)，也稱(chēng)作數(shù)目異常（numerical abnormality)，其中細(xì)胞中的染色體含量異常，可能由于減數(shù)分裂期間染色體不分離而發(fā) 生。在Edwards、Patau和唐氏綜合征中會(huì)見(jiàn)到三倍體，其中存在染色體的三個(gè)拷貝，而不是 通常的兩個(gè)。結(jié)構(gòu)異常和非整數(shù)倍性可能在配子（gamete)中出現(xiàn)，因此可能存在于受影響 的人體的所有細(xì)胞中，或者它們也可以在減數(shù)分裂期間出現(xiàn)，導(dǎo)致同時(shí)具有一些正常細(xì)胞 和一些異常細(xì)胞的遺傳嵌合（mosaic)個(gè)體的產(chǎn)生。
[0002] 基因組不穩(wěn)定性還會(huì)在某些細(xì)胞中，例如癌細(xì)胞中，造成復(fù)雜的染色體重排模式。 常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)測(cè)定法，例如吉姆薩（G)條帶分析，已經(jīng)在癌細(xì)胞中鑒定了大量的癌癥特 異性易位和染色體異常，例如費(fèi)城（t9,22)染色體。唐氏綜合征（三體）、Jac 〇bSen綜合征 (缺失）和伯基特氏淋巴瘤（易位）在傳統(tǒng)上是通過(guò)核型分析（karyotype analysis)進(jìn)行 研究的。
[0003] 細(xì)胞遺傳條帶分析（cytogenetic banding)和可視化（visualization)，例如Μ條 帶和光譜核型分析（spectral karyotyping) (SKY)的進(jìn)步已經(jīng)使得人們能夠?qū)︻崜Q和易位 進(jìn)行細(xì)致的分析，并能夠鑒定感興趣的癌癥中染色體材料的失衡增加或缺失。熒光原位雜 交（FISH)進(jìn)一步使得人們能夠使用僅與染色體中顯示高度互補(bǔ)性的區(qū)域結(jié)合的熒光探針 來(lái)檢測(cè)染色體上特定DNA序列的存在或缺失。
[0004] 在開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)染色體異常的技術(shù)方法方面，還存在很大的、未能滿足的需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 提供了一種方法，其包括：a)合成一組重疊的寡核苷酸，該組重疊的寡核苷酸包 含與染色體中的獨(dú)特序列雜交的探針序列；b)以一定方式組裝這些重疊的寡核苷酸從而 產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸，其中每一個(gè)均包含多個(gè)探針序列；c)標(biāo)記該一個(gè)或多個(gè) 雙鏈多核苷酸而產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記探針；和d)將所述標(biāo)記探針與完整染色體原位雜交。 所述一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸可以通過(guò)多種不同的方式，例如通過(guò)連接或通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)?組裝（polymerase chain assembly),從所述重疊的寡核苷酸制備。
[0006] 附圖簡(jiǎn)沭
[0007] 圖1是示意性圖解本文所述探針合成方法的某些一般特征的圖。
[0008] 圖2是示意性圖解本方法的一個(gè)實(shí)施方案的圖。
[0009] 圖3是示意性圖解本方法的另一個(gè)實(shí)施方案的圖。
[0010] 圖4是示意性圖解本方法的另一個(gè)實(shí)施方案的圖。
[0011] 定義
[0012] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"樣品"是指含有一種或多種感興趣的被分析物的材料或 材料混合物，其通常是，但不一定是液體形式。
[0013] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"基因組樣品"是指含有來(lái)自生物體的遺傳材料的材料或 材料混合物。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"基因組DNA"是指從生物體獲得的脫氧核糖核酸。 術(shù)語(yǔ)"基因組樣品"和"基因組DNA"涵蓋可能已經(jīng)過(guò)擴(kuò)增、純化或斷裂的遺傳材料。如本文 中所使用的，術(shù)語(yǔ)"測(cè)試基因組"是指在某個(gè)研究中感興趣的基因組DNA。
[0014] 術(shù)語(yǔ)"核苷酸"意圖包括這樣的部分（moieties):它們不僅含有已知的嘌呤和嘧 陡堿基，還包含其它已經(jīng)被修飾的雜環(huán)堿基。這樣的修飾包括甲基化噪呤或啼陡、酰基化噪 呤或嘧啶、烷基化核糖或其它雜環(huán)。此外，術(shù)語(yǔ)"核苷酸"包括這樣的部分，其含有半抗原或 熒光標(biāo)記，并且可能不僅包含常規(guī)的核糖和脫氧核糖，還包含其它的糖。修飾的核苷或核苷 酸還包括對(duì)糖部分的修飾，例如其中一個(gè)或多個(gè)羥基被鹵素原子或脂肪族基團(tuán)代替，或者 被官能化為醚、胺或其它。
[0015] 術(shù)語(yǔ)"核酸"和"多核苷酸"在本文中可以互換使用，描述由核苷酸（例如脫氧核糖 核苷酸或核糖核苷酸）構(gòu)成的任意長(zhǎng)度（例如大于約2個(gè)堿基，大于約10個(gè)堿基，大于約 100個(gè)堿基，大于約500個(gè)堿基，大于1000個(gè)堿基，直至約10, 000個(gè)或更多個(gè)堿基）的聚合 物，其可以通過(guò)酶促或合成產(chǎn)生（例如美國(guó)專(zhuān)利No. 5, 948, 902及其引用的參考文獻(xiàn)中所述 的PNA)，其能夠與天然存在的核酸以類(lèi)似兩個(gè)天然存在的核酸的序列特異性方式雜交，例 如能夠參與Watson-Crick堿基配對(duì)相互作用。天然存在的核苷酸包括鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、腺 嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶（分別為G、C、A、T和U)。DNA和RNA分別具有脫氧核糖和核糖骨 架，而PNA的骨架由通過(guò)肽鍵連接的重復(fù)N-(2-氨基乙基）甘氨酸單元構(gòu)成。在PNA中，各 種噪呤和啼陡堿基通過(guò)亞甲基羰基鍵（methylene carbonyl bonds)與骨架相連。鎖定核酸 (locked nucleic acid) (LNA)通常被稱(chēng)作無(wú)法觸及的RNA，是一種修飾的RNA核苷酸。LNA 核苷酸的核糖部分被修飾而具有一個(gè)連接2'氧和4'碳的額外的橋。該橋?qū)⒑颂?鎖閉"為 3'-內(nèi)向（北型）（North)構(gòu)象，這種構(gòu)象常常在A型雙鏈體中發(fā)現(xiàn)。在任何期望的情況下， 在寡核苷酸中LNA核苷酸可以與DNA或RNA殘基混合。術(shù)語(yǔ)"非結(jié)構(gòu)核酸（unstructured nucleic acid) "或"UNA"是含有以降低的穩(wěn)定性彼此結(jié)合的非天然核苷酸的核酸。例如， 非結(jié)構(gòu)核酸可以含有G'殘基和C'殘基，其中這些殘基對(duì)應(yīng)于G和C的非天然存在形式，即 類(lèi)似物，它們彼此以降低的穩(wěn)定性堿基配對(duì)，但是仍然保持分別與天然存在的C和G殘基進(jìn) 行堿基配對(duì)的能力。非結(jié)構(gòu)核酸在US20050233340中有描述，本文為了公開(kāi)UNA而通過(guò)援 引將其并入。
[0016] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸"是指核苷酸的單鏈多聚體，長(zhǎng)度為約2-200 個(gè)核苷酸，多達(dá)500個(gè)核苷酸。寡核苷酸可以是合成的，或者可以酶促制備，并且在一些實(shí) 施方案中，長(zhǎng)度為30-150個(gè)核苷酸。寡核苷酸可以含有核糖核苷酸單體（即可以是寡核糖 核苷酸）或脫氧核糖核苷酸單體。寡核苷酸的長(zhǎng)度可以是例如10-20、11-30、31-40、41-50、 51-60、61-70、71-80、80-100、100-150 或 150-200 個(gè)核苷酸。
[0017] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"序列特異性寡核苷酸"是指僅與單倍體基因組中的單一 位點(diǎn)結(jié)合的寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，"序列特異性"寡核苷酸可以和所研究樣品中獨(dú) 特的互補(bǔ)核苷酸序列雜交。
[0018] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)"是指通過(guò)非共價(jià)鍵與感興趣的靶核酸堿基配對(duì)的 核苷酸序列。在經(jīng)典的Watson-Crick堿基配對(duì)中，DNA中的腺嘌呤（A)與胸腺嘧啶（T)形 成堿基對(duì)，鳥(niǎo)苷酸（G)與胞嘧啶（C)形成堿基對(duì)。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶（U)代替。 這樣，A與T互補(bǔ)，而G與C互補(bǔ)。在RNA中，A與U互補(bǔ)，反之亦然。典型地，"互補(bǔ)"是指 與感興趣的靶標(biāo)完全互補(bǔ)的核苷酸序列，從而序列中的每一個(gè)核苷酸均與靶核酸相應(yīng)位置 處的每一個(gè)核苷酸互補(bǔ)。在某些情況下，核苷酸序列可以與靶部分互補(bǔ)，其中不是所有核苷 酸均與靶核酸所有相應(yīng)位置處的每一個(gè)核苷酸互補(bǔ)。
[0019] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"引物"是指這樣的寡核苷酸，其或者是天然存在的，例如 在純化的限制性消化物中，或者是合成產(chǎn)生的，當(dāng)將該寡核苷酸置于與某條核酸鏈互補(bǔ)的 引物延伸產(chǎn)物的合成被誘發(fā)的條件下，即有核苷酸和誘發(fā)劑（如DNA聚合酶）存在、且溫度 和pH適宜時(shí)，該寡核苷酸能夠充當(dāng)合成的啟動(dòng)點(diǎn)。引物可以是單鏈的或者雙鏈的，并且必 須足夠長(zhǎng)，以便在存在誘發(fā)劑時(shí)可以引發(fā)期望的延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長(zhǎng)度將取決 于許多因素，包括溫度、引物來(lái)源、和方法的用途。例如，對(duì)于診斷應(yīng)用，取決于靶序列的復(fù) 雜性，寡核苷酸引物通常含有15-25或更多個(gè)核苷酸，盡管它也可含有更少的核苷酸。本 文中的引物經(jīng)過(guò)選擇以與特定靶DNA序列的不同鏈基本上互補(bǔ)。這意味著，引物必須有足 夠的互補(bǔ)性以與其相應(yīng)鏈雜交。因此，引物序列不必反映模板的確切序列。例如，在引物的 5'端可以附接非互補(bǔ)的核苷酸片段，而引物序列的其余部分與所述鏈互補(bǔ)?；蛘?，可以將非 互補(bǔ)的堿基或更長(zhǎng)序列散布在引物中，只要引物序列與鏈的序列足夠互補(bǔ)從而可以與之雜 交，藉此形成用于合成延伸產(chǎn)物的模板即可。
[0020] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"探針"是指這樣的核酸，其與感興趣的核苷酸序列部分 或完全互補(bǔ)，從而能夠在嚴(yán)格的雜交條件下與之穩(wěn)定雜交。在某些情況下，靶分析物的檢測(cè) 需要探針與靶雜交。探針可以具有，但非必須具有與靶序列不互補(bǔ)的區(qū)域，只要這樣的序列 在嚴(yán)格雜交條件下不會(huì)實(shí)質(zhì)性地改變探針期望的特異性即可。如果存在這些非互補(bǔ)區(qū)，它 們可能含有5'啟動(dòng)子序列和/或RNA轉(zhuǎn)錄的結(jié)合位點(diǎn)，限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，或可以含有 可賦予探針、靶核酸、或者探針和靶核酸二者以期望的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)（例如催化活性位 點(diǎn)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)）的序列。探針可以用能夠用來(lái)檢測(cè)或確認(rèn)探針已與靶序列雜交的報(bào)告基團(tuán) 部分，例如放射性同位素、熒光基團(tuán)或化學(xué)發(fā)光部分，用酶或其它配體進(jìn)行標(biāo)記。在某些實(shí) 施方案中，探針可以固定在基質(zhì)的表面上，其中基質(zhì)可以具有各種構(gòu)型，例如片層、珠子或 其它結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，探針可以存在于平面支持物的表面上，例如以陣列的形式。
[0021] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增"是指，合成與模板核酸的一條或兩條鏈互補(bǔ)的核 酸分子的過(guò)程。擴(kuò)增核酸分子通常包括使模板核酸變性、使引物在低于引物熔點(diǎn)的溫度下 與模板核酸退火、和酶促地從引物延長(zhǎng)以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。變性、退火和延長(zhǎng)步驟可以分別 進(jìn)行一次。然而，一般而言，變性、退火和延長(zhǎng)步驟進(jìn)行多次（例如至少5-10次，多達(dá)30-40 次，或更多次），從而使擴(kuò)增產(chǎn)物的量增加，經(jīng)常指數(shù)倍增，盡管指數(shù)擴(kuò)增并不是本方法要求 的。擴(kuò)增通常要求存在脫氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶和對(duì)該聚合酶的最佳活性而言合 適的緩沖液和/或輔助因子。術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增產(chǎn)物"是指由此處所定義的擴(kuò)增程序產(chǎn)生的核酸 序列。
[0022] 本文中，術(shù)語(yǔ)"確定"、"測(cè)量"、"評(píng)估"、"評(píng)價(jià)"、"分析"和"測(cè)定"可以互換使用，指 任意形式的測(cè)量，并且包括確定某要素是否存在。這些術(shù)語(yǔ)包括定量和/或定性確定。評(píng) 估可以是相對(duì)的或絕對(duì)的。"評(píng)估…的存在"包括確定某物的存在量，以及確定其是否存在。
[0023] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"Tm"是指寡核苷酸雙鏈體的熔解溫度，在該溫度一半的 雙鏈體仍保持雜交，而一半的雙鏈體解離為單鏈。寡核苷酸雙鏈體的T m可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定 或者用如下的公式預(yù)測(cè)：Tm=81.5+16.6(l Og1(l[Na+])+0.41(G+C分?jǐn)?shù)）-(60/N)，其中N是鏈 長(zhǎng)度，[Na+]小于 1M。見(jiàn) Sambrook and Russell (2〇01;Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N. Y.,第 10 章）。還 存在其它用于預(yù)測(cè)寡核苷酸雙鏈體Tm的公式，且一個(gè)公式可能或多或少地適用于一個(gè)給 定的條件或一組條件。
[0024] 術(shù)語(yǔ)"使用（using)"具有其常規(guī)含意，并且同樣意指"利用（employing)"，例如， 利用方法或組合物以達(dá)成目的。例如，如果使用程序創(chuàng)造一個(gè)文件，則該是執(zhí)行該程序以制 作文件，所述文件通常是所述程序的輸出物。在另一個(gè)例子中，如果使用計(jì)算機(jī)文件，則通 常是訪問(wèn)、讀取所述文件，且使用存儲(chǔ)于該文件中的信息以達(dá)成目的。簡(jiǎn)單地說(shuō)，如果使用 一種獨(dú)特的標(biāo)識(shí)，例如條形碼，則通常是讀取該獨(dú)特的標(biāo)識(shí)以識(shí)別，例如，與該獨(dú)特的標(biāo)識(shí) 相關(guān)聯(lián)的物體或文件。
[0025] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"染色體重排"是指染色體的一個(gè)或多個(gè)部分在單個(gè)染色 體內(nèi)或者在染色體之間重新排列的事件。在某些情況下，染色體重排可以反映染色體結(jié)構(gòu) 的異常。染色體重排可以是例如顛換（inversion)、缺失、插入、或易位。
[0026] 術(shù)語(yǔ)"接觸"意思是使之在一起。因此，當(dāng)將第一個(gè)物品與第二個(gè)物品放在一起， 例如使它們彼此碰到或?qū)⑺鼈冎糜谕蝗芤褐?，則稱(chēng)第一個(gè)物品與第二個(gè)物品接觸。因此 "被接觸樣品"是寡核苷酸探針?biāo)s交的測(cè)試染色體。
[0027] 術(shù)語(yǔ)"雜交"是指核酸與互補(bǔ)核酸通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)的特異結(jié)合。因此， 術(shù)語(yǔ)"原位雜交"是指核酸與中期（metaphase)或間期（interphase)染色體的特異結(jié)合。
[0028] 術(shù)語(yǔ)"雜交"和"結(jié)合"在用于指示核酸時(shí)可以互換使用。
[0029] 術(shù)語(yǔ)"多個(gè)"、"一組"、"多"、和"群體"可以互換使用，意思是至少2個(gè)、至少10個(gè)、 至少100個(gè)、至少500個(gè)、至少1000個(gè)、至少10, 000個(gè)、至少100, 000個(gè)，至少1000, 000個(gè)、 至少10, 000, 000個(gè)或者更多。
[0030] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"染色體區(qū)"是指生物體基因組中連續(xù)的一段核苷酸。染 色體區(qū)的長(zhǎng)度范圍可以是l〇kb到整個(gè)染色體，例如100kb-10MB。
[0031] "測(cè)試染色體"是從哺乳動(dòng)物細(xì)胞分離的完整中期或間期染色體，其中完整染色體 具有與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在的相同染色體相同的整體形態(tài)，例如含有著絲粒、含有端粒的 長(zhǎng)臂和含有端粒的短臂。測(cè)試染色體與參考染色體相比可以含有顛換、易位、缺失、插入或 其它重排。測(cè)試染色體是所研究的染色體。
[0032] "參考染色體"是完整的中期染色體，可以將測(cè)試染色體與其進(jìn)行比較以鑒定重 排。參考染色體可以任意選擇。參考染色體可以具有已知的序列。參考染色體可以自身含 有染色體重排。
[0033] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"參考染色體區(qū)"是指將測(cè)試染色體區(qū)與之比較的染色體 區(qū)。在某些情況下，參考染色體區(qū)可以具有已知的核苷酸序列，例如其序列已錄入NCBI的 Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)和其它數(shù)據(jù)庫(kù)中的染色體區(qū)。
[0034] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"原位雜交條件"是指允許核酸與完整染色體中的互補(bǔ)核 酸雜交的條件。合適的原位雜交條件可以包括雜交條件和任選的清洗條件，清洗條件包括 溫度、變性劑濃度、鹽、溫育時(shí)間等。這些條件是本領(lǐng)域已知的。
[0035] 術(shù)語(yǔ)"不同的非連續(xù)區(qū)域"是指染色體上不連續(xù)的區(qū)域或間隔。
[0036] 術(shù)語(yǔ)"結(jié)合模式"是指一組標(biāo)記探針與某個(gè)完整染色體結(jié)合的模式。
[0037] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"聚合酶鏈?zhǔn)浇M裝"是指這樣的方案，其中將多個(gè)重疊的 寡核苷酸組合，并使之經(jīng)歷多輪引物延伸（即在聚合酶和核苷酸存在下進(jìn)行多輪連續(xù)的 引物延伸、變性和退火）使用彼此作為模板經(jīng)歷，從而延長(zhǎng)寡核苷酸，借此產(chǎn)生含有每個(gè)起 始寡核苷酸核苷酸序列的產(chǎn)物分子。然后，在標(biāo)記之前，使用與產(chǎn)物分子末端位點(diǎn)結(jié)合的引 物對(duì)產(chǎn)物分子進(jìn)行擴(kuò)增。
[0038] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"（使）變性"是指通過(guò)將核酸雙鏈體置于合適的變性條 件下使核酸雙鏈體的至少一部分堿基對(duì)分離。變性條件是本領(lǐng)域眾所周知的。在一個(gè)實(shí)施 方案中，為了使核酸雙鏈體變性，可以將雙鏈體暴露于超過(guò)雙鏈體的Tm的溫度，由此使雙 鏈體的一條鏈從另一個(gè)鏈上釋放。在某些實(shí)施方案中，可以通過(guò)將核酸暴露于至少90°C達(dá) 合適的時(shí)間量（例如至少30秒，多達(dá)30min)使之變性。在某些實(shí)施方案中，可以使用完全 變性條件來(lái)完全分離雙鏈體的堿基對(duì)。在其它實(shí)施方案中，可以使用部分變性條件（例如 用低于完全變性條件的溫度）分離雙鏈體某些部分的堿基對(duì)（例如富含A-T堿基對(duì)的區(qū)域 可以分離，而富含G-C堿基對(duì)的區(qū)域可以保持配對(duì)）。核酸還可以被化學(xué)變性（例如使用尿 素或NaOH)。
[0039] 如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"延伸"是指通過(guò)使用聚合酶添加核苷酸使引物延伸。如 果與核酸退火的引物被延伸，則該核酸充當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)的模板。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"重疊的寡核苷酸"是指一組寡核苷酸，其中每一個(gè)寡核苷酸的某個(gè)末端（例 如3'端）與該組中另一個(gè)寡核苷酸的某個(gè)末端互補(bǔ)，使得重疊的寡核苷酸的各末端可以彼 此雜交，并可以通過(guò)使用其它寡核苷酸作為模板被聚合酶所延伸。
[0041] 術(shù)語(yǔ)"彼此連結(jié)"是指彼此結(jié)合形成一個(gè)單元。多核苷酸序列可以彼此連結(jié)產(chǎn)生 一個(gè)單一的序列。
[0042] 術(shù)語(yǔ)"重復(fù)序列"是指基因組中非獨(dú)特的序列，例如衛(wèi)星DNA、LINES、SINES，或者 本來(lái)在單倍體基因組的至少兩個(gè)區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)的序列，例如在同源基因或已被復(fù)制的基因中 出現(xiàn)的序列。
[0043] 示例實(shí)施方案詳細(xì)說(shuō)明
[0044] 在更詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不僅限于所述的特定實(shí)施方案，因 此它們當(dāng)然可以發(fā)生變化。還應(yīng)當(dāng)理解，這里所用的術(shù)語(yǔ)只是出于描述特定實(shí)施方案的目 的，并不意圖有限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅由隨附的權(quán)利要求所限定。
[0045] 當(dāng)提供某個(gè)值的范圍時(shí)，應(yīng)該理解為還具體公開(kāi)了上限和下限之間的每一個(gè)居間 值，到下限的單位的十分之一，除非上下文中另有明確說(shuō)明。在指明的范圍中，任意指明的 值或居間值與該范圍中的其它指明的或居間值之間的每一個(gè)更小范圍都包括在本發(fā)明之 中。
[0046] 除非另外指出，否則這里所用全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通 技術(shù)人員所公知的相同的意思。盡管在實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明時(shí)也可以使用與本文中所述的相 似或等同的方法或材料，但是現(xiàn)在描述的是優(yōu)選的方法和材料。
[0047] 本文通過(guò)援引并入本說(shuō)明書(shū)中所引證的全部出版物和專(zhuān)利的內(nèi)容，就像具體地逐 個(gè)聲明通過(guò)援引并入每一個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠粯樱煌ㄟ^(guò)援引并入這些出版物和專(zhuān)利是 為了公開(kāi)和描述與對(duì)這些出版物的引證相關(guān)聯(lián)的方法和/或材料。對(duì)任何出版物的引證是 出于引證其中早于申請(qǐng)日的公開(kāi)內(nèi)容的目的，而不應(yīng)當(dāng)被解釋為了承認(rèn)本發(fā)明無(wú)權(quán)基于發(fā) 明在先而使這些出版物不構(gòu)成本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。而且，所提供的出版日期可能與實(shí)際的 出版日期不同，其可能需要單獨(dú)加以確認(rèn)。
[0048] 應(yīng)當(dāng)注意，如本文中所使用的，以及在隨附的權(quán)利要求中，除非上下文明確地另有 要求，否則單數(shù)形式"一"、"一個(gè)"、和"該"包括復(fù)數(shù)形式。此外應(yīng)當(dāng)注意，權(quán)利要求可以使 用排除任何任選元素的表述。因此，本陳述應(yīng)視為將排他性術(shù)語(yǔ)如"唯一"、"僅"等與某一 權(quán)利要求元素聯(lián)用、或使用"負(fù)"限定的在先基礎(chǔ)。
[0049] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀本公開(kāi)文件時(shí)容易想到的，本文中所描述和例示的每個(gè)單 獨(dú)的實(shí)施方案都具有離散的組成成分和技術(shù)特征，其可以隨時(shí)從任意其它幾個(gè)實(shí)施方案的 特征分離或與其它幾個(gè)實(shí)施方案的特征結(jié)合而不背離本發(fā)明的教導(dǎo)的范圍或精神。任何提 到的方法都可以以提到的順序進(jìn)行，或以任意邏輯上可能的順序進(jìn)行。
[0050] 本方法的某些方面如圖1所示。在某些實(shí)施方案中，該方法包括合成一組重疊的 寡核苷酸2,其包含探針序列，所述探針序列中每一個(gè)與基因組4中的一個(gè)獨(dú)特序列（即僅 與一個(gè)位置）雜交。在這些實(shí)施方案中，重疊寡核苷酸的長(zhǎng)度范圍可以是50-200個(gè)核苷酸 (或者更長(zhǎng)）。重疊寡核苷酸中每一個(gè)的一個(gè)末端（例如3'端）與重疊寡核苷酸中另一個(gè) 的一個(gè)末端互補(bǔ)，從而重疊寡核苷酸的末端可以彼此雜交，并且如果需要，可以用另一個(gè)重 疊寡核苷酸（another of the overlapping oligonucleotides)作為模板加以延伸。相 鄰的寡核苷酸之間可以有10%_90%重疊。在某些情況下，重疊的區(qū)域（即相鄰寡核苷酸之 間的互補(bǔ)區(qū)域）可以是12-50個(gè)堿基，例如15-30個(gè)堿基的范圍。探針序列的長(zhǎng)度范圍可 以是10-200個(gè)，例如20-150個(gè)核苷酸。取決于寡核苷酸是如何制備的（例如取決于它們 是剛剛合成的未處理的寡核苷酸，還是已經(jīng)通過(guò)PCR進(jìn)行了擴(kuò)增的寡核苷酸），寡核苷酸可 以是單鏈寡核苷酸或雙鏈寡核苷酸。在制備重疊寡核苷酸之后，以一定的方式組裝重疊寡 核苷酸，以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)雙鏈多寡核苷酸6,所述雙鏈多寡核苷酸各自包含多個(gè)（例如至 少2個(gè)、至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少50個(gè)、或者至少100個(gè)或更多、多達(dá)1，000個(gè)或更多） 探針序列。如將在下文中更詳細(xì)描述的，如果寡核苷酸是單鏈的，則可以通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)浇M 裝制備所述一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸。在一個(gè)其中寡核苷酸為雙鏈的實(shí)施方案中，所述一 個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸可以通過(guò)將雙鏈寡核苷酸連接在一起來(lái)制備。在組裝好所述一個(gè)或 多個(gè)雙鏈多核苷酸之后，將它們標(biāo)記產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記探針8。標(biāo)記可以用任何方便的 方式完成。例如，在某些情況下，可以通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記化學(xué)綴合于一個(gè)或多個(gè)雙鏈多 核苷酸來(lái)標(biāo)記探針，例如使用通用連接系統(tǒng)（Universal Linkage System) (ULS?，KREATECH Diagnostics;van Gijlswijk et al Universal Linkage System:versatile nucleic acid labeling technique Expert Rev.Mol.Diagn. 20011:81-91)。簡(jiǎn)而言之，ULSTM 標(biāo)記是基 于鉬（II)與核酸的穩(wěn)定結(jié)合性質(zhì)。ULS分子由與所選的可檢測(cè)分子偶聯(lián)的單功能鉬復(fù)合 體組成?；蛘?，標(biāo)記可以用缺口平移、隨機(jī)引發(fā)（random priming)、或任何其它在Ausubel 等，（Short Protocols in Molecular Biology,第三版，Wiley&Sons, 1995)或 Sambrook 等，（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版，（2001) Cold Spring Harbor, N. Y.)中描述的合適方法實(shí)現(xiàn)。在某些情況下，所述一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸的多個(gè)位點(diǎn)被標(biāo) 記，且不被通過(guò)末端標(biāo)記方式標(biāo)記。圖1所示的示例實(shí)施方案中圖解了一種已通過(guò)化學(xué)綴 合而被標(biāo)記的探針?？梢燥@見(jiàn)，本方法的使用其它標(biāo)記方法（例如缺口平移或隨機(jī)引發(fā)） 的實(shí)施方案會(huì)產(chǎn)生與圖1所不不同的產(chǎn)物。在該一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸被標(biāo)記之后，所 得的探針與完整染色體，例如從哺乳動(dòng)物細(xì)胞分離的完整中期或間期染色體原位雜交。所 得的探針與完整染色體的結(jié)合應(yīng)當(dāng)會(huì)產(chǎn)生結(jié)合模式10,可以對(duì)其進(jìn)行分析，從而可能鑒定 出染色體重排。
[0051] 如上文所指出的，在某些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸可以通過(guò)聚 合酶鏈?zhǔn)浇M裝由重疊的單鏈寡核苷酸組裝而成，其中如上文指出的，聚合酶鏈?zhǔn)浇M裝涉及 使多個(gè)重疊的單鏈寡核苷酸使用彼此作為模板經(jīng)歷多輪引物延伸（即在聚合酶和核苷酸 的存在下進(jìn)行多個(gè)連續(xù)的引物延伸、變性和復(fù)性的循環(huán)），由此產(chǎn)生產(chǎn)物分子，然后用與最 終的產(chǎn)物分子的末端位點(diǎn)結(jié)合的引物對(duì)該最終的產(chǎn)物分子進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)施聚合酶鏈?zhǔn)浇M裝 方法的不例條件可以在例如 Hughes 等（Methods in Enzymology2011498:277_309)和 Wu 等.（J.Biotechnol. (2006),124:496-503)中找到，它們均援引并入本文。如果使用聚合酶 鏈?zhǔn)浇M裝，那么產(chǎn)物雙鏈多核苷酸的長(zhǎng)度范圍可以是l〇〇bp_5kb，例如200bp-3kb。在這些 實(shí)施方案中，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)浇M裝產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸的連續(xù)核苷酸序列與靶 染色體中的序列可以有至少95%相同（例如至少98%或至少99%相同）。本方法中所用的 寡核苷酸的重疊末端可以是T m匹配的。
[0052] 如上文所指出的，所述一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸可以由重疊雙鏈寡核苷酸通過(guò)將 雙鏈寡核苷酸的末端連接在一起組裝而成。在這些實(shí)施方案中，所述雙鏈寡核苷酸可以通 過(guò)對(duì)寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增加以制備，例如按照美國(guó)專(zhuān)利8, 034, 917所述。在這些情況下， 所述雙鏈寡核苷酸可以從寡核苷酸的混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述混合物中不同的寡核苷酸 根據(jù)下式(從5'至3'），其中乂 1和&為一對(duì)PCR引物提供結(jié)合位點(diǎn)（例如，乂1具 有與第一 PCR引物相同的序列，而X2具有與第二PCR引物互補(bǔ)的序列），且V是一個(gè)可變區(qū) 域，其具有與基因組中的獨(dú)特序列互補(bǔ)的可變的核苷酸序列。可變區(qū)一般對(duì)應(yīng)于基因組的 非重復(fù)區(qū)，可以用一對(duì)PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。在某些情況下，對(duì)于所有待組裝的寡核苷酸而言 &和X 2的核苷酸序列是相同的，從而單一一組寡核苷酸的所有可變區(qū)可以用單一一對(duì)PCR 引物來(lái)擴(kuò)增。在這些實(shí)施方案中，PCR產(chǎn)物\和&區(qū)可以含有IIS型限制酶的位點(diǎn)，從而 Xi和X 2的序列可以從PCR產(chǎn)物中移除，以產(chǎn)生一組在該方法的本實(shí)施方案中使用的重疊雙 鏈寡核苷酸。這些雙鏈寡核苷酸一旦產(chǎn)生，可以將它們?nèi)窟B接在一起，并如上所述地進(jìn)行 標(biāo)記。在這些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸的長(zhǎng)度范圍是300-5, 000個(gè)堿基對(duì)，盡 管在某些實(shí)施方案中，長(zhǎng)度可為超過(guò)5, 000個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)。由于該連接基本上是隨機(jī)的，因此 所述一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸的整個(gè)連續(xù)核苷酸序列與靶染色體中的序列可以具有小于 10%的序列同一性。然而，在通過(guò)本方法制備的一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸中，應(yīng)當(dāng)有數(shù)個(gè)較 短的序列（例如50-150個(gè)核苷酸）與靶序列有至少95% (例如至少98%或至少99%)的序 列同一性，并能夠和靶序列雜交。在這些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸中的探 針序列的順序是隨機(jī)的。圖2圖解了可以實(shí)施該基于連接酶的實(shí)施方案的一種方式。
[0053] 在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸與染色體中多個(gè)不同區(qū)域雜交，其中所述不同區(qū)域 被重復(fù)序列（repeat sequences)(例如在基因組中不獨(dú)特的序列（sequences),例如衛(wèi)星 DNA、LINES、SINES或原本在單倍體基因組的至少兩個(gè)部分中出現(xiàn)的序列，例如在同源基因 或已經(jīng)過(guò)復(fù)制的基因中出現(xiàn)的序列）所分隔。在這些實(shí)施方案中，可以分析基因組序列以 鑒定被重復(fù)序列（repeat sequences)所分隔的祀?yún)^(qū)域。在某些情況下，可以為每個(gè)祀?yún)^(qū)域 設(shè)計(jì)一組重疊的探針序列。例如，如果有兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)靶區(qū)域，則可以產(chǎn)生相等數(shù)目的 雙鏈多核苷酸，其中每個(gè)雙鏈多核苷酸對(duì)應(yīng)于單個(gè)靶區(qū)域。這些實(shí)施方案可以包括：為每個(gè) 靶區(qū)域設(shè)計(jì)一組重疊探針序列；合成多組包含所述重疊探針序列的寡核苷酸；和以一定方 式組裝這些重疊探針序列，使得為每個(gè)靶區(qū)域產(chǎn)生一個(gè)雙鏈多核苷酸。該實(shí)施方案在圖3 中圖示（其中圖3演示了本方法的該實(shí)施方案可以用聚合酶鏈?zhǔn)浇M裝完成的一種方式）。在 其它情況下，在鑒定出被重復(fù)序列分隔的靶區(qū)域之后，可以將各核苷酸序列彼此連結(jié)（即， 彼此相連形成含有每一個(gè)靶序列的單一序列，這些靶序列的順序可以和基因組中發(fā)現(xiàn)的順 序相同或不同）。在這些實(shí)施方案中，連結(jié)起來(lái)的核苷酸序列可以被分成（split into)多 個(gè)具有限定長(zhǎng)度（例如長(zhǎng)度范圍是500bp-5kb)的區(qū)域，并且可以為該多個(gè)區(qū)域的每一個(gè)設(shè) 計(jì)一組探針序列。與上文一致，該方法可以涉及合成多組包含探針序列的重疊寡核苷酸；和 以一定方式組裝這些探針序列，使得為所述多個(gè)區(qū)域中的每一個(gè)產(chǎn)生一個(gè)可以被標(biāo)記的雙 鏈多核苷酸，如上所述。圖4圖解了該方法的這個(gè)實(shí)施方案可以通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)浇M裝實(shí)現(xiàn) 的一種方式。
[0054] 可以顯見(jiàn)，對(duì)應(yīng)于基因組不同區(qū)域中的不同雙鏈多核苷酸可以用相同的標(biāo)記物 (例如相同的熒光團(tuán)）標(biāo)記，在某些情況下，可以在標(biāo)記之前將不同的雙鏈多核苷酸組合。 在某些情況下，不同的雙鏈多核苷酸可以用不同的標(biāo)記物（例如不同的熒光團(tuán)）標(biāo)記。
[0055] 在某些實(shí)施方案中，對(duì)象中使用的寡核苷酸可以在陣列上提供。在某些實(shí)施方案 中，陣列可以用原位合成方法合成，其中核苷酸單體被順次添加到生長(zhǎng)中的核苷酸鏈，其中 所述核苷酸鏈附接于呈陣列形式的固體支持物。這些原位制造方法包括在下列文獻(xiàn)中描述 的那些：美國(guó)專(zhuān)利Nos. 5,449, 754和6, 180, 351，以及公開(kāi)的PCT申請(qǐng)No. W098/41531，和其 中引證的參考文獻(xiàn)，以及多種其他出版物。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法中所用的寡核苷酸可以 如此制備：使用原位合成方法制造寡核苷酸陣列，并從陣列中切出寡核苷酸。
[0056] 適合用作本方法中的標(biāo)記物的熒光染料（熒光團(tuán)）可以從許多適合于成 像應(yīng)用的染料中任意選擇。有若干種染料可以從各種來(lái)源商購(gòu)，例如Molecular Probes (Eugene, Oreg.)和Exciton (Dayton, Ohio)，這為選擇一組具有期望的光譜性質(zhì)的 染料提供了極大的靈活性。熒光團(tuán)的實(shí)例包括，但不僅限于，4-乙酰胺基-4'-異硫氰酸 芪-2, 2' -二磺酸；吖啶和其衍生物，如吖啶，吖啶橙，吖啶黃，吖啶紅，和吖啶異硫氰酸酯； 5- (2 ' -氨乙基）氨基萘-1-磺酸（EDANS );4-氨基-N- [3-乙烯砜基/苯基]萘酰亞胺-3, 5 二石黃酸酉旨（amin〇-N-[3-vinylsulfonyl)phenyl]naphthalimide-3, 5disulfonate)(突光 黃 VS) ;N-(4-氨基-1-萘酰）馬來(lái)酰亞胺（N-(4-amin〇-l-naphthyl)maleimide);鄰氨基 苯甲酰胺；亮黃（Brilliant Yellow);香豆素及衍生物，如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素 (八皿(3，香豆素12())，7-氨基-4-三氟甲基香豆素（(>)111]^1311151) ;花青及衍生物，如焰紅染 料（cyanosine)，Cy3，Cy5，Cy5. 5,和 Cy7 ;4'，6_ 二脒基-2-苯基吲哚（DAPI) ;5'，5"-二溴 鄰苯三酚-磺酞(溴鄰苯三酚紅);7_二乙氨基-3-(4'-異硫氰酸苯基）-4-甲基香豆素；二 乙氨基香豆素；二亞乙基三胺五乙酸；4, 4'-二異硫氰酸二氫-芪-2, 2'-二磺酸；4, 4'-二 異硫氰酸芪_2,2' -二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯（DNS，丹酰氯）；4-(4' -二甲氨 基苯偶氮基）苯甲酸（DABCYL) ;4_二甲氨基苯偶氮基苯基-4' -異硫氰酸酯（DABITC); 曙紅及衍生物，如曙紅和曙紅異硫氰酸酯；藻紅及衍生物，如藻紅B和藻紅異硫氰酸酯；乙 啡啶；熒光素及衍生物，如5-羧基熒光素（FAM)、5_ (4, 6-二氯三嗪-2-基）氨基熒光素 (0丁八朽、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基熒光素〇(^)、熒光素異硫氰酸酯$11'〇、熒 光素氯三嗪、萘基熒光素、和QFITC(XRITC);熒光胺；IR144;IR1446;麗絲胺（Lissamine) ?;麗絲胺羅丹明、突光黃（Lucifer yellow);異硫氰基孔雀石綠（Malachite Green isothiocyanate) ;4-甲基傘形酮；鄰甲酚酞；硝基酪氨酸；堿性副品紅；尼羅紅；俄勒岡 綠；酚紅；B-藻紅蛋白；鄰苯二醛；芘及其衍生物，如芘、芘丁酸酯和琥珀酰亞氨基-1-芘丁 酸酯；活性紅4(Cibacr 〇n?亮紅3B-A);羅丹明及衍生物，如6-羧基-X-羅丹明（R0X)、 6_羧基羅丹明（R6G)、4,7-二氯羅丹明麗絲胺、羅丹明B磺酰氯、羅丹明（Rhod)、羅丹明B、 羅丹明123、羅丹明X異硫氰酸酯、磺基羅丹明B、磺基羅丹明101、磺基羅丹明101磺酰氯 衍生物（德克薩斯紅）、Ν，Ν，Ν'，Ν'-四甲基-6-羧基羅丹明（TAMRA)、四甲基羅丹明、和四 甲基羅丹明異硫氰酸酯（TRITC);核黃素；玫瑰酸和鋱螯合物衍生物；氧雜蒽；Alexa-Fluor 染料（例如 Alexa Fluor350、Alexa Fluor430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor647、Alexa Fluor660> Alexa Fluor680> Alexa Fluor700> Alexa Fluor750) > Pacific Blue> Pacific Orange、Cascade Blue>Cascade Yellow ;Quantum Dot 染料（Quantum Dot Corporation)； 來(lái)自 Pierce 的 Dylight 染料（Rockford，IL)，包括 Dylight800、Dylight680、Dylight649、 Dylight633、Dylight549、Dylight488、Dylight405 ;或其組合。也可以使用其它本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的突光團(tuán)或其組合，例如可以從Molecular Probes(Eugene，Oreg.)和 Exciton (Dayton, Ohio)獲得的那些。
[0057] 下面的表1提供了可以和2、3或4組合使用的熒光團(tuán)的示例性組合。該表格不是 全面性的。在表1中，指示了 20種不同的二染料組合、9種不同的三染料組合、和8種不同 的四染料組合（縱向閱讀；填充了黑色的框指示組合中的染料）。
[0058] 表 1 染料組合實(shí)例（AF=Alexa Fluor)
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種方法，包括： (a) 合成包含與染色體中的獨(dú)特序列雜交的探針序列的一組重疊的寡核苷酸； (b) 以一定方式組裝這些重疊的寡核苷酸，從而產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸，每一個(gè) 均包含多個(gè)探針序列； (c) 標(biāo)記該一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記探針；和 (d) 將所述標(biāo)記探針與完整染色體原位雜交。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述組裝是通過(guò)將多個(gè)雙鏈寡核苷酸彼此連接，或者通過(guò) 聚合酶鏈?zhǔn)浇M裝而完成的。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述標(biāo)記是通過(guò)隨機(jī)引發(fā)、缺口平移，或通過(guò)將一個(gè)或多個(gè) 標(biāo)記物綴合于所述一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸而完成的。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述探針序列的長(zhǎng)度范圍是10-150個(gè)核苷酸。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸的長(zhǎng)度范圍是300-5, 000個(gè) 喊基對(duì)。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中所述探針序列在所述一個(gè)或多個(gè)雙鏈多核苷酸中的順序是 隨機(jī)的。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中所述一組寡核苷酸與染色體中的多個(gè)不同區(qū)域雜交，其中 所述不同區(qū)域被重復(fù)序列所分隔。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中所述染色體是哺乳動(dòng)物染色體。
9. 權(quán)利要求1的方法，還包括： (e) 使用顯微鏡閱讀步驟（d)的產(chǎn)物以生成雜交模式。
10. 權(quán)利要求9的方法，還包括： (f) 將所述雜交模式與對(duì)照雜交模式進(jìn)行比較。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104099409SQ201410045228
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年2月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月5日
【發(fā)明者】S.陳, M.魯沃洛, E.M.萊普魯斯特 申請(qǐng)人:安捷倫科技有限公司