植物內(nèi)生蒙塔腔菌及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鹽生根系內(nèi)生蒙塔腔菌（Montagnulaceae?sp.）菌株及其用途，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體而言，本發(fā)明公開了一種真菌菌株，該菌株為蒙塔腔菌（Montagnulaceae?sp.）（菌株編號：JP-ROOT-44），保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址：中國科學(xué)院微生物研究所，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏日：2014年1月13號，保藏號：CGMCC?No.8756。該菌株能用于促進(jìn)植物的生長和/或提高其耐鹽性能。
【專利說明】植物內(nèi)生蒙塔腔菌及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鹽生根系內(nèi)生蒙塔腔菌(Montagnulaceae sp.)菌株及其用途,屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)是一類可定植在根、莖、葉、花、種子等各種組織器官，但并不引起宿主明顯的病癥的真菌類群。內(nèi)生真菌諸多生物學(xué)特性都區(qū)別于菌根真菌、根瘤固氮菌和弗蘭克氏菌。根系內(nèi)生真菌是植物根系微生物類群的重要組成部分，在某些環(huán)境中(如鹽脅迫、干旱等)根系內(nèi)生真菌可能比菌根真菌或其他微生物扮演著更加重要的生物學(xué)功能。自2007年美國領(lǐng)銜實(shí)施植物微生物組計(jì)劃(Plant Microbiome Project)以來，科學(xué)家一致認(rèn)為:一個(gè)植株不是單個(gè)生命體，而是“植物-共生菌”的超級生物體。共生菌對宿主植物的一系列性狀(生長、適逆和發(fā)育等)起到了關(guān)鍵調(diào)控作用；特定植物環(huán)境中有益微生物種群的遺傳多樣性能夠擴(kuò)展宿主的生態(tài)適應(yīng)性，從而協(xié)同植物形成更強(qiáng)的適逆能力。
[0003]我國鹽堿地面積約有14億多畝，廣泛分布于西北內(nèi)陸和濱海地區(qū)；多數(shù)鹽潰土還與荒漠干旱區(qū)相鄰或鑲嵌。這種極端環(huán)境不僅制約了農(nóng)業(yè)對土地資源的利用，而且造成植被不斷退化。生理育種和分子改良技術(shù)在創(chuàng)制新的耐旱耐鹽林木種質(zhì)資源方面發(fā)揮了重要作用。然而由于植物抗逆性狀由多個(gè)數(shù)量性狀基因(QTL)控制，導(dǎo)致傳統(tǒng)的育種方式進(jìn)展緩慢；抗逆型轉(zhuǎn)基因苗木也難以適應(yīng)復(fù)雜脅迫環(huán)境，在生產(chǎn)實(shí)踐中尚不能推廣應(yīng)用。
[0004]Rodriguez等(2 009)認(rèn)為有兩類內(nèi)生真菌參與調(diào)控植物的非生物脅迫反應(yīng):
[0005]I) Class 2 內(nèi)生菌:
[0006]主要特征:全局性侵染模式；宿主范圍較廣；垂直或水平傳播。華盛頓大學(xué)Rodriguez教授研究團(tuán)隊(duì)從生長在地?zé)嵬寥赖闹参?Dichanthelium Ianuginosum)中分離到一種內(nèi)生管突彎孢霉(Curvularia protuberata),該菌可以定殖在根、莖和葉片組織；接種試驗(yàn)表明植物-內(nèi)生真菌的共生關(guān)系使得彼此可以生長在高達(dá)65°C的環(huán)境中。該成果發(fā)表在Science雜志(Redman et al.，2002)。隨后，該研究小組從沿海植物-濱麥(Leymusmollis)中分離到一株內(nèi)生黃色鐮刀菌(Fusarium culmorum),該菌株能提高多種植物的耐鹽性能(Rodriguez and Redman, 2008)。利用這種“共生基因感化”(symbiogenic,symbio=symbiosis ；genic=gene influence)策略，使這些特殊生境下的內(nèi)生真菌可以幫助植物適應(yīng)由于氣候變化可能導(dǎo)致的干旱、鹽度增加和氣溫升高等惡劣環(huán)境，對提高農(nóng)作物的產(chǎn)量(如水稻等)意義重大(Redman et al., 2011;Woodward et al.，2012)。由Rodriguez教授創(chuàng)建的Symbiogenics公司已經(jīng)對Class 2內(nèi)生菌進(jìn)行商業(yè)化投產(chǎn)(www.adaptivesymbiotictechno1gies.com)。美國農(nóng)業(yè)部(USDA)Lucero 博士利用顯微技術(shù)、培養(yǎng)和高通量測序等方法發(fā)現(xiàn)在兩種旱生小灌木的葉片和根部都發(fā)現(xiàn)有大量內(nèi)生菌存在，而且在植物細(xì)胞表面會形成類似微生物膜(microbial biofilm)的結(jié)構(gòu)；組織培養(yǎng)證實(shí)這些內(nèi)生菌依然可以與宿主愈傷組織緊密結(jié)合(Lucero et al.，2011)。這種內(nèi)生菌-愈傷組織復(fù)合體還可以和多種非宿主植物建立共生關(guān)系，并提高其生長活力和抗逆性(Barrow etal.，2008; Lucero et al.，2008)。這種內(nèi)生真菌生物技術(shù)可能與傳統(tǒng)的抗逆育種和轉(zhuǎn)基因培育技術(shù)并駕齊驅(qū)(Barrow et al.，2008),應(yīng)用前景十分廣闊。目前國內(nèi)已有的林木微生物肥料還局限于菌根真菌、固氮菌等營養(yǎng)型接種劑，而專用于協(xié)同植物抗逆的微生物資源和菌劑研發(fā)還鮮見報(bào)道，缺乏系統(tǒng)研究，與國際同類研究相比差距較大。
[0007]2)、Class 4內(nèi)生菌。主要特征:局限在根系分布；宿主范圍較廣；水平傳播。暗色有隔內(nèi)生菌(DSEs, dark septate endophytes)是Class 4類群的主要代表。DSEs通常在宿主根部皮層細(xì)胞形成“微菌核”結(jié)構(gòu)(miciOslerotia)(劉茂軍等2009)微菌核”及其暗色菌絲含有的黑色素活性物質(zhì)具有很強(qiáng)的耐受性，這對植物適應(yīng)逆境可能是至關(guān)重要的(Zhang et al., 2008;Li et al., 2011;Zhan et al.，2011)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種源于鹽生植物(鹽地堿蓬)根系內(nèi)生真菌，該菌株能用于促進(jìn)植物的生長并提高其耐鹽性能。
[0009]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明一種真菌菌株:該菌株為蒙塔腔菌(Montagnulaceae sp.)(菌株編號:JP-R00T-44),保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址是:中國科學(xué)院微生物研究所，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號；保藏日:2014年I月13號，保藏號:CGMCC N0.8756。
[0010]作為本發(fā)明的真菌菌株的改進(jìn)，該菌株JP-R00T-44屬于真菌界Fungi，子囊菌門Ascomycota,座囊菌綱Dothideomycetes,格抱腔目Pleosporales,蒙塔腔菌科Montagnulaceae。
[0011]本發(fā)明還同時(shí)提供了上述真菌菌株的用途:能用于促進(jìn)植物的生長和/或提高其耐鹽性能。
·[0012]備注說明:促進(jìn)植物的生長表現(xiàn)在促進(jìn)植株增高、或促進(jìn)植株生物量。
[0013]作為本發(fā)明的真菌菌株的用途的改進(jìn):所述植物為水稻或黃瓜。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0015]圖1為菌株JP-R00T-44的培養(yǎng)特征圖。A:在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)10天；B:在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3周；C:在1.5%MEA培養(yǎng)3周。
[0016]圖2為基于LSU基因構(gòu)建的菌株JP-R00T-44的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0017]圖3為根系接種菌株JP-R00T-44后對水稻耐鹽性的影響對比圖。EF group:未接種水稻；EI group:接種菌株JP-R00T-44的水稻。
[0018]圖4為鹽脅迫下接種菌株JP-R00T-44后對水稻生物量的影響對比圖；
[0019]圖5為菌株JP-R00T-44菌絲在水稻根系部位的定植及侵染結(jié)構(gòu)圖。A:菌絲(H)在侵染水稻根系表面(RR) ；B:菌絲在根系皮層細(xì)胞形成的“類菌核”(S)結(jié)構(gòu)。
[0020]圖6為在非鹽脅迫培養(yǎng)、氮源為甘氨酸(Gly)條件下菌株JP-R00T-44對水稻生長的影響圖。
[0021]上圖為處理與對照組水稻幼苗在共培養(yǎng)基上生長情況；[0022]下圖為從上述培養(yǎng)基上取出處理與對照組水稻幼苗后的對比情況。
[0023]圖7為在非鹽脅迫、氮源為甘氨酸(Gly)條件下接種菌株JP_R00T_44對水稻生物量和株高的影響對比圖。
[0024]圖8為在非鹽脅迫、氮源為硝酸鈉(NaN03)、纈氨酸(Val)培養(yǎng)條件下接種菌株JP-R00T-44對黃瓜幼苗的生長影響。
[0025]圖9為在非鹽脅迫、氮源為硝酸鈉(NaN03)、纈氨酸(Val)培養(yǎng)條件下接種菌株JP-R00T-44對黃瓜幼苗鮮重的影響。EF:對照組(不接菌)；E1:處理組(接菌)。
[0026]a-a表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上差異不顯著；a_b表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上差異顯著。
[0027]圖10為不同溫度、鹽濃度和pH值條件下對菌株JP-R00T-44生長的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0028]為對本發(fā)明進(jìn)行更好的說明，結(jié)合附圖舉例如下:
[0029]實(shí)施例1、菌株JP-R00T-44的分離培養(yǎng)
[0030]1、菌株分離培養(yǎng)基:
[0031]I)、先制備 1.5%麥芽粉瓊脂培養(yǎng)基(malt extract agar，MEA):15g麥芽粉(Oxoid公司)，瓊脂粉20g，1000ml蒸餾水；高溫滅菌(為常規(guī)的高溫滅菌，一般為在1.1個(gè)大氣壓，121°C下滅菌 20min)。
[0032]2)、隨后在 上述1.5%麥芽粉瓊脂培養(yǎng)基中加入硫酸鏈霉素(sti^ptomycinsulfate)和鹽酸四環(huán)素(tetracycline hydrochloride)使其終濃度分別為50mg/L和20mg/L，用于抑制細(xì)菌生長；得菌株分離培養(yǎng)基。
[0033]2、培養(yǎng)菌株的馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA):
[0034]馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉20g，1000ml蒸餾水；高溫滅菌(為常規(guī)的高溫滅菌，一般為在1.1個(gè)大氣壓，121°C下滅菌20min)。
[0035]3、PDB 培養(yǎng)基:
[0036]馬鈴薯200g，葡萄糖20g，1000ml蒸餾水；高溫滅菌(為常規(guī)的高溫滅菌，一般為在
1.1個(gè)大氣壓，121°C下滅菌20min)。
[0037]4、在本實(shí)驗(yàn)中，按下列條件分離培養(yǎng)，即可獲得本發(fā)明所描述的蒙塔腔菌:
[0038]從山東東營沿海采集在灘涂生長的鹽地堿蓬(Suaeda salsa)，將根系用自來水沖洗干凈，去除土壤顆粒及雜物。首先在75%酒精(V/V)浸泡40秒，再在1% (質(zhì)量％)次氯酸鈉(NaClO)溶液中消毒10分鐘，隨后置入95% (V/V)酒精漂洗30秒，最后用無菌水清洗3次以上。用無菌剪刀將根系切成0.5cm長的根段，置入菌株分離培養(yǎng)基，25°C黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)至第5天，從組織切口邊緣處長出內(nèi)生真菌菌絲，用接種針小心將其挑出后轉(zhuǎn)接到新鮮PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)并記錄菌株編號。
[0039]所述純化培養(yǎng)為:用接種針切取菌落邊緣少許菌絲轉(zhuǎn)移至新鮮PDA培養(yǎng)基，重復(fù)上述操作3-4次；符合菌落顏色、形態(tài)勻一的作為下述實(shí)施例2所用的菌株。
[0040]所得的菌株進(jìn)行了保藏:該菌株為蒙塔腔菌(Montagnulaceae sp.)(菌株編號:JP-R00T-44)，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址是:中國科學(xué)院微生物研究所，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。保藏日:2014年I月13號，保藏號:CGMCC N0.8756。[0041]實(shí)施例2、菌株JP-R00T-44的分子生物學(xué)鑒定
[0042]I)、基因組DNA提取
[0043]將菌株接種在JP-R00T-44在PDA平板上25°C黑暗培養(yǎng)一周。用接種針挑取少量菌絲塊于1.5ml無菌離心管中，放入直徑Imm和5mm的鋼珠各5粒，在液氮中浸泡I分鐘，隨后在JXFSTPRP冷凍研磨機(jī)(上海凈信科技有限公司)上充分研磨樣品。使用DN41-真菌基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)進(jìn)行提取基因組DNA。加入400 μ I API和4μ1 RNaseA(10mg/ml)，漩渦振蕩。隨后在65°C水浴孵育20分鐘，充分裂解樣本。加入130 μ I ΑΡ2，充分混勻，在冰浴上放置5分鐘。HOOOrpm離心8分鐘，小心吸取上清液到一個(gè)新的1.5ml無菌離心管中，加入1.5倍體積的AP3/E，用槍頭進(jìn)行吹打混勻得到混合液，先加650 μ I混合液加入一個(gè)吸附柱AC中(吸附柱放在收集管中)，13000rpm離心40秒，倒掉收集管中的廢液，重復(fù)上述步驟直至加完所有混合液。在吸附柱中加入600 μ I漂洗液WB，12000rpm離心30秒，棄廢液。將吸附柱AC重新放回收集管中，13000rpm離心2分鐘，盡量除去殘留的漂洗液。取出吸附柱AC放入新的1.5ml無菌離心管中，在吸附膜的中間部位加入100 μ I洗脫緩沖液ΕΒ，室溫放置5分鐘，12000rpm離心I分鐘，即獲得DNA樣品，在_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0044]2)、PCR 擴(kuò)增
[0045]對菌株JP-R00T-44的核糖體28S大亞基(LSU)、核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、RNA聚合酶次大亞基基因(RPB2)和翻譯延長因子1-α (tefl-α )等用于真菌系統(tǒng)發(fā)育和分子鑒定的基因序列進(jìn)行測定。菌株JP-R00T-44的ITS\LSU\R0PB2\TEF基因的PCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)體系見表1和表2。四個(gè)基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2分鐘；94°C變性30秒，55°C退火40秒，72°C延伸50秒(LSU\RPB2\TEF基因的延伸時(shí)間為90秒)，35次循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。
[0046]表1、PCR擴(kuò)增弓丨物·名稱及序列
[0047]
【權(quán)利要求】
1.真菌菌株，其特征是:該菌株為蒙塔腔菌(Montagnulaceaesp.)(菌株編號:JP-R00T-44)，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址:中國科學(xué)院微生物研究所，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號；保藏日:2014年I月13號，保藏號:CGMCC N0.8756。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真菌菌株的用途，其特征是:用于促進(jìn)植物的生長和/或提高其耐鹽性能。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的真菌菌株的用`途，其特征`是:所述植物為水稻或黃瓜。
【文檔編號】C12R1/645GK103849571SQ201410045895
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年2月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月10日
【發(fā)明者】袁志林, 孫海菁 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所