一種產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株及其應(yīng)用。該產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株保藏編號(hào)為CCTCC?No.M2013627，保藏于位于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該菌株可應(yīng)用于高溫多聚半乳糖醛酸酶發(fā)酵生產(chǎn)。本發(fā)明保護(hù)的菌株所產(chǎn)的多聚半乳糖醛酸酶復(fù)合酶（粗酶液）在溫度為60℃時(shí)表現(xiàn)出最大反應(yīng)活性，反應(yīng)溫度為65℃時(shí)仍然保持約85%的酶活力，這至今未見相關(guān)報(bào)道，是一株產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株。
【專利說明】一種產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和工程領(lǐng)域，特別涉及從自然界中富含果膠類物質(zhì)的環(huán)境中篩選、分離、純化得到一株能產(chǎn)高溫多聚半乳糖醒酸酶的草酸青霉菌菌株
oxalicum )。
技術(shù)背景
[0002]果膠是一種主要由D-半乳糖酸經(jīng)α- (1，4)_糖苷鍵聚合而成的多糖類物質(zhì)，廣泛存在于高等植物組織中，尤其在果實(shí)，莖塊，漿果中含量最為豐富，是細(xì)胞間層和初生細(xì)胞壁的重要組成部分。一直以來，果膠類物質(zhì)的降解吸引著國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注和研究，特別是在果蔬汁加工工業(yè)中，果膠類物質(zhì)的存在會(huì)使液體的粘度增加，對(duì)果蔬汁的澄清度，過濾性能，出汁率等都會(huì)造成嚴(yán)重影響。
[0003]果膠酶是一類能夠降解果膠類物質(zhì)的復(fù)合酶的總稱。其廣泛存在于細(xì)菌、真菌、放線菌以及動(dòng)植物中。按照作用底物以及反應(yīng)方式的不同，果膠酶大致可以分為原果膠酶、果膠酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶。原果膠酶主要作用于不容性的原果膠，使其變成高聚合度的可溶性果膠；果膠酯酶主要通過水解果膠上的甲氧基而使果膠脫脂；多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶則分別通過水解作用和反式消除作用使果膠主鏈上D-半乳糖醛酸之間α- (1，4)_糖苷鍵發(fā)生斷裂，使高聚合度的果膠發(fā)生解聚。
[0004]果膠酶是一類具有重要應(yīng)用價(jià)值復(fù)合酶，是全球產(chǎn)銷量最大的工業(yè)酶制劑之一，主要應(yīng)用食品加工工業(yè)特別是果蔬汁、果酒的加工，能夠顯著提高壓榨果蔬汁的出汁率，降低果汁果酒的粘度，增加澄清效果，從而保證果汁果酒的品質(zhì)。多聚半乳糖醛酸酶是果膠酶的重要組成部分，也是一直以來人們研究最多的一種果膠酶。它通過外切和內(nèi)切的方式水解聚半乳糖醛酸(果膠酸)的糖苷鍵，隸屬于糖苷水解酶28家族(GH28)。多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶(endo-PG)只能裂開與羧基相鄰的糖苷鍵，以隨機(jī)的方式水解聚半乳糖醛，生成一系列的寡聚半乳糖醛酸，使底物的粘度迅速降低；多聚半乳糖醛酸外切酶(exo-PG)則從聚半乳糖醛酸非還原末端切下1-2半乳糖醛酸殘基，生成二半乳糖醛酸或半乳糖醛酸單體。
[0005]來源于微生物的多聚半乳糖醛酸酶是工業(yè)應(yīng)用中最重要的一種果膠酶，在果汁制造，果酒釀造、飼料加工、麻類脫膠、造紙等行業(yè)均有大量的報(bào)道。能產(chǎn)多聚半乳糖醛酸酶的微生物主要有曲霉、青霉、根霉、鐮刀霉等屬中的一些種。雖然國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均對(duì)這些種屬所產(chǎn)的多聚半乳糖醛酸酶的酶學(xué)特性已經(jīng)報(bào)道很多，然而，隨著果膠酶需求量和重要性的日益增加，篩選新的具有潛在應(yīng)用價(jià)值的果膠酶生產(chǎn)菌株仍極為必要。
[0006]具有高溫反應(yīng)特性的多聚半乳糖醛酸酶在工業(yè)應(yīng)用(特別是果汁加工)中尤其重要。因?yàn)楦邷夭粌H能夠減少有害的微生物的污染，而且還可以降低處理液的粘度，從而使剪切力及抽運(yùn)、離心、過濾費(fèi)用減少。目前，能夠產(chǎn)具有高溫反應(yīng)特性的多聚半乳糖醛酸酶的微生物種屬報(bào) 道相對(duì)較少，而能夠直接產(chǎn)該類復(fù)合酶的草酸青霉菌菌株更鮮有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種能夠產(chǎn)具有高溫反應(yīng)特性的多聚半乳糖醛酸酶的微生物菌株及其在多聚半乳糖醛酸酶發(fā)酵生產(chǎn)方面的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的方案為:一種產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株，該菌株保藏編號(hào)為CCTCC N0.M2013627。該菌株是發(fā)明人用微生物學(xué)手段從柑橘園土壤中分離選育得到，已于2013年12月03日保藏于的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該中心位于中國(guó)湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC N0.M2013627。該菌株經(jīng)biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定后,確定其為草酸青霉菌(Penicillin? oxalicum)0其ITSDNA 序列與 Genbank 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)所列的oxalicum strain als2_d38 菌株的 ITSDNA 序列(KC344971.V), Penicillium oxalicum strain 114-2 菌株的 ITSDNA 序列(KF152942.1)具有99%的序列同源性。 [0009]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述的草酸青霉菌菌株發(fā)酵產(chǎn)得高溫多聚半乳糖醛酸酶的催化反應(yīng)溫度為55-65°C，在55-65°C條件下保持85%以上的酶活力。
[0010]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述的草酸青霉菌菌株發(fā)酵產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶穩(wěn)定期為發(fā)酵培養(yǎng)開始后第36-72小時(shí)。
[0011]一種產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株的應(yīng)用，保藏編號(hào)為CCTCCN0.M2013627產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株在高溫多聚半乳糖醛酸酶發(fā)酵生產(chǎn)方面的應(yīng)用。
[0012]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述的草酸青霉菌菌株發(fā)酵產(chǎn)得高溫多聚半乳糖醛酸酶的催化反應(yīng)溫度為55-65°C，該菌株所產(chǎn)生的多聚半乳糖醛酸酶最適反應(yīng)溫度為60°C，在55-65°C范圍均能保持85%以上的酶活力。
[0013]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述的草酸青霉菌菌株發(fā)酵產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶穩(wěn)定期為發(fā)酵培養(yǎng)開始后第36-72小時(shí)。
[0014]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述的草酸青霉菌菌株發(fā)酵所用培養(yǎng)基為:1-2%果膠，0.1-0.2%硫酸銨，0.01-0.05%硫酸鎂，0.1-0.3%磷酸二氫鉀，0.01-0.05%氯化鈣，0.5-1.0%硝酸鈉，0.1-0.5%吐溫80，初始pH值為5.0-6.0。作為培養(yǎng)基優(yōu)選方案，該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為:1%果膠，0.14%硫酸銨，0.03%硫酸鎂，0.2%磷酸二氫鉀，0.03%氯化鈣，0.5%硝酸鈉，0.1%吐溫80，初始pH值為5.5。
[0015]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述的草酸青霉菌菌株發(fā)酵條件為:30_37°C條件下，搖床轉(zhuǎn)速200-300rpm培養(yǎng)36-72小時(shí)。作為培養(yǎng)條件優(yōu)選方案，最佳培養(yǎng)條件為:300C，200rpm搖床培養(yǎng)60小時(shí)，該菌在培養(yǎng)60h時(shí)，發(fā)酵液中聚半乳糖醛酸酶活力達(dá)到最大值，約為3445.3u/ml。
[0016](I)為使本發(fā)明公開充分，本發(fā)明所保護(hù)的菌株分離和選育過程包括三步進(jìn)行:采樣、初篩、復(fù)篩和純化。
[0017]采樣:于廣西桂林市陽朔縣郊區(qū)柑橘園中采集的土壤，采集時(shí)間2013年10月，采
集者盧波。
[0018]初篩:制備初篩培養(yǎng)基(果膠30g、NaN035g、KC10.5g、MgSO40.3g、(MM)2SO4L 4g、CaCl20.3g、KH2P043.8g、瓊脂粉 20g、溴酚藍(lán) 0.2g、水 1000ml),起始 pH 值 5.5，121 °C 滅菌20min。步驟:從采集的土壤中隨機(jī)挑取約0.5g樣品，懸浮于IOml無菌水中，充分搖勻,靜置一段時(shí)間后取上清液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，均勻涂布于初篩培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)2-3天。挑取黃色水解圈較大的菌落做進(jìn)一步篩選。
[0019]復(fù)篩和純化:制備液體發(fā)酵培養(yǎng)基(1%果膠，0.14%硫酸銨，0.03%硫酸鎂，0.2%磷酸二氫鉀，0.03%氯化鈣，0.5%硝酸鈉，0.1%吐溫80)，起始PH值，5.5，1211:滅菌201^11。將初篩得到的菌落接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，200rpm搖床培養(yǎng)48小時(shí)，取發(fā)酵液測(cè)定多聚半乳糖醛酸酶活力以確定初篩得到的菌落能夠發(fā)酵產(chǎn)多聚半乳糖醛酸酶(酶促反應(yīng)條件為:0.5%聚半乳糖醛酸，pH4.8乙酸-乙酸鈉緩沖液，50°C反應(yīng)15min，以Imin水解底物產(chǎn)生Iug半乳糖醛酸殘基定義為一個(gè)酶活力單位)。然后將酶活力高的菌落做進(jìn)一步的分離純化后，篩選獲得一株生長(zhǎng)穩(wěn)定，產(chǎn)酶能力高的菌株，其聚半乳糖醛酸酶活力達(dá)到最大值約為3445.3u/ml，命名為PCl。
[0020](2)為使本發(fā)明公開充分，本發(fā)明所保護(hù)的菌株的分類鑒定包括分子鑒定和biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定。
[0021]分子鑒定過程:將PCl菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)5_6天后收集孢子，按IO6個(gè)孢子/ml的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，200rpm搖床培養(yǎng)48小時(shí)后收集菌體細(xì)胞，液氮冷凍研磨破碎后，用酚-氯仿法提取菌體的基因組DNA。以該DNA為模板，采用通用引物 ITSl (5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，)和 ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，擴(kuò)增該菌體的ITSDNA序列。50ul的反應(yīng)體系含PCR緩沖液5ul, ITSl 和 ITS4 引物各 2ul,各(1見132111，0嫩模板1111，了390嫩聚合酶0.3ul，ddH2037.7ul。反應(yīng)條件:94°C 5 min ；94°C 30s,55°C 30s, 72°C lmin。所得反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定分析，得到該菌株596pb的ITSDNA序列，將該序列在NCBI網(wǎng)站的Genbank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列比對(duì)分析搜索，結(jié)果表明，其ITSDNA序列與Genbank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)所列的Penicillium oxalicum strain als2_d38 菌株的 ITSDNA序列(KC344971.1),Penicilliumoxalicum strain 114-2 菌株的 ITSDNA 序列(KF152942.1)具有 99% 的序列同源性。
[0022]biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定:將該菌株接種于2%麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基中(20g麥芽汁干粉培養(yǎng)基，18g細(xì)菌級(jí)瓊脂，IL無菌水)，置于26°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至產(chǎn)孢(約5-6天)。用無菌接種棒粘取適量的孢子于廠家配置的FF-1F接種液中制成孢子懸浮液，將制備好的菌懸液接種至FF板上(每孔IOOul )，接種完畢后蓋上蓋子并將其放置于26°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，培養(yǎng)結(jié)束后使用MicrologTM 3軟件進(jìn)行結(jié)果分析。
[0023]綜合上述分析結(jié)果，鑒定所選育得到的產(chǎn)果膠酶的菌株P(guān)Cl為草酸青霉{Penicillium oxalicum、。
[0024](3)為使本發(fā)明公開充分，菌株的產(chǎn)酶時(shí)間及其所產(chǎn)多聚半乳糖醛酸酶的特性具體如下:
菌株的產(chǎn)酶時(shí)間的研究確定^fPCI菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為IO6個(gè)孢子/ml，200rpm，30°C搖床中培養(yǎng)，于不同培養(yǎng)時(shí)間段取樣測(cè)定多聚半乳糖醛酸酶的活力(酶促反應(yīng)條件為:0.5%聚半乳糖醛酸，pH4.8乙酸-乙酸鈉緩沖液，50°C反應(yīng)15min，以Imin水解底物產(chǎn)生Iug半乳糖醛酸殘基定義為一個(gè)酶活力單位)。結(jié)果表明:該菌在培養(yǎng)60h時(shí)，發(fā)酵液中聚半乳糖醛酸酶活力達(dá)到最大值，約為3445.3u/ml。36_72h為產(chǎn)酶穩(wěn)定期，72h后產(chǎn)酶能力顯著降低。與傳統(tǒng)菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定期在40-72h,本發(fā)明菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定期提前,菌株產(chǎn)酶效率相對(duì)傳統(tǒng)菌株高。[0025]最適反應(yīng)溫度的研究確定:將PCl菌株按IO6個(gè)孢子/ml接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，200rpm, 30°C培養(yǎng)48h，取發(fā)酵液8500rpm離心15min，取上清酶液稀釋一定倍數(shù)后分別于30°C，40°C，50°C，55°C，60°C，65°C，70V測(cè)定酶活力。結(jié)果表明:該酶的最適反應(yīng)溫度為60°C，溫度在55-65°C范圍時(shí)能夠保持85%以上的反應(yīng)活性，溫度超過65°C時(shí)，酶活力急劇下降，反應(yīng)溫度為70°C時(shí)，酶活力只有最高酶活的22.3%。而傳統(tǒng)酶在55-65°C范圍能保持85%以上的酶活力的至今未見報(bào)道。
[0026]最適反應(yīng)pH值的研究確定:將PCl菌株按IO6個(gè)孢子/ml接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，200rpm，30°C培養(yǎng)48h后，發(fā)酵液8500rpm離心15min，取上清酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后置于PH值分別為4.4,4.8,5.2,5.4,5.8,6.4,6.6乙酸-乙酸鈉緩沖溶液配制的0.5%聚半乳糖醛酸反應(yīng)體系中進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定酶活。結(jié)果表明:草酸青霉PCl所產(chǎn)的多聚半乳糖醛酸酶最適反應(yīng)PH為5.2，最適反應(yīng)pH范圍為4.8-5.4，pH值超過5.4時(shí)，酶活力急劇下降，表明該酶為酸性果膠酶，可廣泛用于酸性條件(4.8-5.4)下酶促反應(yīng)。
[0027]溫度穩(wěn)定性的研究:將PCl菌株按IO6個(gè)孢子/ml接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，200rpm，30°C培養(yǎng)48h后，取發(fā)酵液8500rpm離心15min，取上清液用ρΗ5.2乙酸-乙酸鈉緩沖液配制的0.5%聚半乳糖醛酸溶液稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，分別于50°C，55°C水浴中保溫，以未經(jīng)保溫處理的酶液作為對(duì)照，每間隔一定的時(shí)間段取樣并迅速冷卻，然后測(cè)定果膠酶活力。結(jié)果表明該果膠酶在50°C下保持15min、30mim,60min,90min時(shí),其剩余相對(duì)酶活力分別為=87.6%, 79.0%, 59.8%, 43.3%，溫度上升至55°C時(shí)，剩余相對(duì)酶活力分別為64.1%，34.5%, 25.4%, 27.6%，由此可見隨著溫度的升高及保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，酶的熱穩(wěn)定性下降。
[0028]本發(fā)明具備以下良好效果:提供了一株能夠產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株P(guān)CI (Penicillium oxalicum),該菌株所產(chǎn)生的多聚半乳糖醒酸酶最適反應(yīng)溫度為60°C，在55-65°C范圍均能保持85%以上的酶活力，這至今未見相關(guān)報(bào)道。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1: CCTCC N0.M2013627草酸青霉菌菌株P(guān)Cl的產(chǎn)酶時(shí)間。
[0030]圖2 =CCTCC N0.M2013627草酸青霉菌菌株P(guān)Cl所產(chǎn)多聚半乳糖醛酸酶最適反應(yīng)溫度。
[0031]圖3:CCTCC N0.M2013627草酸青霉菌菌株P(guān)Cl所產(chǎn)多聚半乳糖醛酸酶最適反應(yīng)pH值。
[0032]圖4 =CCTCC N0.M2013627草酸青霉菌菌株P(guān)Cl所產(chǎn)多聚半乳糖醛酸酶溫度穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0033]以下結(jié)合實(shí)施例和描述本發(fā)明，這些描述并不是對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步的限定。
[0034]實(shí)施例1:菌株的分離選育
菌株分離和選育過程包括三步進(jìn)行:采樣、初篩、復(fù)篩和純化。
[0035]采樣:于廣西桂林市陽朔縣郊區(qū)柑橘園中采集合適的土壤。
[0036]初篩:制備初篩培養(yǎng)基( 果膠30g、NaN035g、KC10.5g、MgSO40.3g、(MM)2SO4L 4g、CaCl20.3g、KH2P043.8g、瓊脂粉 20g、溴酚藍(lán) 0.2g、水 1000ml),起始 pH 值 5.5，121 °C 滅菌20min。步驟:從采集的土壤中隨機(jī)挑取約0.5g樣品，懸浮于IOml無菌水中，充分搖勻,靜置一段時(shí)間后取上清液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，均勻涂布于初篩培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)2-3天。挑取黃色水解圈較大的菌落做進(jìn)一步篩選。
[0037]復(fù)篩和純化:制備液體發(fā)酵培養(yǎng)基(1%果膠，0.14%硫酸銨，0.03%硫酸鎂，0.2%磷酸二氫鉀，0.03%氯化鈣，0.5%硝酸鈉，0.1%吐溫80)，起始PH值，5.5，1211:滅菌201^11。將初篩得到的菌落接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，200rpm搖床培養(yǎng)48小時(shí)，取發(fā)酵液測(cè)定多聚半乳糖醛酸酶活力，將酶活力高的菌落做進(jìn)一步的分離純化后，篩選獲得一株生長(zhǎng)穩(wěn)定，產(chǎn)酶能力高的菌株，命名為PC1。
[0038]實(shí)施例2:菌株鑒定
對(duì)實(shí)施例1篩選得到的菌株P(guān)Cl菌株的分類鑒定包括分子鑒定和biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定。
[0039]分子鑒定過程:將PCl菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)5_6天后收集孢子，按IO6個(gè)孢子/ml的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，200rpm搖床培養(yǎng)48小時(shí)后收集菌體細(xì)胞，液氮冷凍研磨破碎后，用酚-氯仿法提取菌體的基因組DNA。以該DNA為模板，采用通用引物 ITSl (5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，)和 ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，擴(kuò)增該菌體的ITSDNA序列。50ul的反應(yīng)體系含PCR緩沖液5ul, ITSl 和 ITS4 引物各 2ul,各(1見132111，0嫩模板1111，了390嫩聚合酶0.3ul，ddH2037.7ul。反應(yīng)條件:94°C 5 min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin。所得反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定分析，得到該菌株596pb的ITSDNA序列，如序列表中SEQ ID NO:1序列所示，將該序列在NCBI網(wǎng)站的Genbank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列比對(duì)分析搜索，結(jié)果表明，其ITSDNA序列與Genbank 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)所列的 Penicillium oxalicum strain als2_d38 菌株的 ITSDNA序列(KC344971.1), Penicillium oxalicum strain 114-2 菌株的 ITSDNA 序列(KF152942.1)具有99%的序列同源性。`
[0040]biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定:將該菌株接種于2%麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基中(20g麥芽汁干粉培養(yǎng)基，18g細(xì)菌級(jí)瓊脂，IL無菌水)，置于26°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至產(chǎn)孢(約5-6天)。用無菌接種棒粘取適量的孢子于廠家配置的FF-1F接種液中制成孢子懸浮液，將制備好的菌懸液接種至FF板上(每孔IOOul )，接種完畢后蓋上蓋子并將其放置于26°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，培養(yǎng)結(jié)束后使用MicrologTM 3軟件進(jìn)行結(jié)果分析。
[0041]綜合上述分析結(jié)果，鑒定所選育得到的產(chǎn)果膠酶的菌株P(guān)Cl為草酸青霉{Penicillium oxalicum、。
[0042]實(shí)施例3:菌株特性實(shí)驗(yàn)
菌株按IO6個(gè)孢子/ml接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基(含1%果膠，0.14%硫酸銨，0.03%硫酸鎂，0.2%磷酸二氫鉀，0.03%氯化鈣，0.5%硝酸鈉，0.1%吐溫80，初始pH值5.5，121。。滅菌2011^11。)，301:，200印111搖瓶培養(yǎng)。酶促反應(yīng)條件為:0.5%聚半乳糖醛酸底物，pH4.8乙酸-乙酸鈉緩沖液，50°C反應(yīng)15min，以Imin水解底物產(chǎn)生Iug半乳糖醛酸殘基定義為一個(gè)酶活力單位。結(jié)果表明:該菌在培養(yǎng)60h時(shí)，發(fā)酵液中聚半乳糖醛酸酶活力達(dá)到最大值，約為3445.3u/ml。36_72h為產(chǎn)酶穩(wěn)定期，72h后產(chǎn)酶能力顯著降低，如附圖1所示。
[0043]菌株按IO6個(gè)孢子/ml接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基(含1%果膠，0.14%硫酸銨，
0.03%硫酸鎂，0.2%磷酸二氫鉀，0.03%氯化鈣，0.5%硝酸鈉，0.1%吐溫80，初始pH值5.5，121°C滅菌20min)，30 °C，200rpm搖瓶培養(yǎng)48小時(shí)后，發(fā)酵液8500rpm離心15min，上清液用蒸餾水稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后進(jìn)行酶促反應(yīng)(反應(yīng)條件:0.5%聚半乳糖醛酸底物，pH4.8乙酸-乙酸鈉緩沖液，反應(yīng)時(shí)間15min)，以最高的反應(yīng)酶活力為參照，測(cè)定其相對(duì)酶活力。結(jié)果表明:該酶的最適反應(yīng)溫度為60 V，溫度在55-65 °C范圍時(shí)能夠保持85%以上的反應(yīng)活性，溫度超過65°C時(shí)，酶活力急劇下降，反應(yīng)溫度為70°C時(shí)，酶活力只有最高酶活的
22.3%。，如附圖2所示。
[0044]菌株按IO6個(gè)孢子/ml接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基(含1%果膠，0.14%硫酸銨，0.03%硫酸鎂，0.2%磷酸二氫鉀，0.03%氯化鈣，0.5%硝酸鈉，0.1%吐溫80，起始pH值5.5，121°C滅菌20min)，30 °C，200rpm搖瓶培養(yǎng)48小時(shí)后，發(fā)酵液8500rpm離心15min，取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后置于不同PH值乙酸-乙酸鈉緩沖溶液配制的0.5%聚半乳糖醛酸反應(yīng)體系中進(jìn)行酶促反應(yīng)，反應(yīng)溫度60°C，反應(yīng)時(shí)間15min，以最高的反應(yīng)酶活作為參照，測(cè)定其相對(duì)酶活力。結(jié)果表明:草酸青霉PCl所產(chǎn)的多聚半乳糖醛酸酶最適反應(yīng)pH為5.2，最適反應(yīng)PH范圍為4.8-5.4，pH值超過5.4時(shí)，酶活力急劇下降，表明該酶為酸性果膠酶，如附圖3所示。
[0045]菌株按IO6個(gè)孢子/ml接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基(含1%果膠，0.14%硫酸銨，0.03%硫酸鎂，0.2%磷酸二氫鉀，0.03%氯化鈣，0.5%硝酸鈉，0.1%吐溫80，初始pH值5.5，121°C滅菌20min)，30°C，200rpm搖瓶培養(yǎng)48小時(shí)后，發(fā)酵液8500rpm離心15min，取上清液用pH5.2乙酸-乙酸鈉緩沖液配制的0.5%聚半乳糖醛酸溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后于不同溫度和保溫時(shí)間處理，然后進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未經(jīng)保溫處理作為參照，測(cè)定其相對(duì)酶活力。結(jié)果表明該果膠酶在50°C下保持15min、30mim,60min,90min時(shí),其剩余相對(duì)酶活力分別為:87.6%, 79.0%, 59.8%, 43.3%，溫度上升至55°C時(shí)，剩余相對(duì)酶活力分別為64.1%, 34.5%，25.4%, 27.6%，由此可見 隨著溫度的升高及保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，酶的熱穩(wěn)定性下降，如附圖4所示。
[0046]實(shí)施例4:菌株的應(yīng)用
利用實(shí)施例1分離選育得到的菌株用于發(fā)酵制備產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶，步驟如
下:
O菌種活化
菌種以斜面保存在4°c冰箱或以凍干品保存在-80°c冰箱。利用CCTCC No:M2013627
草
酸青霉菌菌株P(guān)Cl發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶時(shí)，先將保藏的菌種取出冰箱恢復(fù)常溫，接種PDA瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml, pH自然，121°C滅菌20min)，30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6天至產(chǎn)孢，收集孢子并制備孢子懸液，用于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)。
[0047]2)產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)
孢子懸液按IO6個(gè)孢子/ml接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基(含1%果膠，0.14%硫酸銨，
0.03%硫酸鎂，0.2%磷酸二氫鉀，0.03%氯化鈣，0.5%硝酸鈉，0.1%吐溫80，起始pH值5.5，121°C滅菌20min)中培養(yǎng)48-60h，收集培養(yǎng)液，8500rpm離心15min，所得上清即為菌株P(guān)Cl所產(chǎn)的多聚半乳糖醛酸酶粗酶液。
[0048]本發(fā)明上述實(shí)施例方案僅是對(duì)本發(fā)明的說明而不能限制本發(fā)明，權(quán)利要求中指出了本發(fā)明保護(hù)主題，因此，在與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。`
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株，其特征在于，該草酸青霉菌菌株保藏編號(hào)為 CCTCC N0.M2013627。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株，其特征在于，所述的草酸青霉菌菌株發(fā)酵產(chǎn)得高溫多聚半乳糖醛酸酶的催化反應(yīng)溫度為55-65°C，在55-65°C條件下保持85%以上的酶活力。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株，其特征在于，所述的草酸青霉菌菌株發(fā)酵產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶穩(wěn)定期為發(fā)酵培養(yǎng)開始后第36-72小時(shí)。
4.一種產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株的應(yīng)用，其特征在于，保藏編號(hào)為CCTCC N0.M2013627產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株在高溫多聚半乳糖醛酸酶發(fā)酵生產(chǎn)方面的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株的應(yīng)用，其特征在于，所述的草酸青霉菌菌株發(fā)酵產(chǎn)得高溫多聚半乳糖醛酸酶的催化反應(yīng)溫度為55-65°C，在55-65°C條件下保持85%以上的酶活力。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株的應(yīng)用，其特征在于，所述的草酸青霉菌菌株發(fā)酵所用培養(yǎng)基為:1-2%果膠，0.1-0.2%硫酸銨，0.01-0.05%硫酸鎂，0.1-0.3%磷酸二氫鉀，0.01-0.05%氯化鈣，0.5-1.0%硝酸鈉，0.1-0.5%吐溫80，初始 PH 值為 5.0-6.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株的應(yīng)用，其特征在于，所述的草酸青霉菌菌株發(fā)酵條件為:30-37°C條件下，搖床轉(zhuǎn)速200-300rpm培養(yǎng)。
8.根 據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶的草酸青霉菌菌株的應(yīng)用，其特征在于，所述的草酸青霉菌菌株發(fā)酵產(chǎn)高溫多聚半乳糖醛酸酶穩(wěn)定期為發(fā)酵培養(yǎng)開始后第36-72小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK103773700SQ201410048791
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年2月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月12日
【發(fā)明者】盧波, 陳東, 程忠, 張穗生, 蘆志龍, 吳仁智, 陸琦, 彭立新, 黃日波 申請(qǐng)人:廣西科學(xué)院