小麥抗穗發(fā)芽QTL位點(diǎn)QPhs.sicau-3B.1的分子標(biāo)記M3B-1a和M3B-2a及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了小麥分子育種領(lǐng)域的兩對(duì)用于篩選新的與小麥抗穗發(fā)芽相關(guān)的QTL位點(diǎn)的引物對(duì)及方法和應(yīng)用。經(jīng)過(guò)分析表明，開(kāi)發(fā)出的分子標(biāo)記M3B-1a和M3B-2a能準(zhǔn)確跟蹤斯卑爾脫小麥CSCR6的抗穗發(fā)芽主效QTL位點(diǎn)QPhs.sicau-3B.1，預(yù)測(cè)小麥的穗發(fā)芽抗性，從而更加方便地在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)抗穗發(fā)芽材料進(jìn)行鑒定和篩選。利用分子輔助育種技術(shù)能避免環(huán)境因素及人為因素對(duì)表型造成的影響，本發(fā)明中的主效QTL?QPhs.sicau-3B.1及開(kāi)發(fā)出的兩對(duì)與該QTL緊密連鎖的STS標(biāo)記M3B-1a和M3B-2a，能提供新的候選基因，提高抗穗發(fā)芽育種材料選擇的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)小麥抗穗發(fā)芽育種的目標(biāo)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】小麥抗穗發(fā)芽QTL位點(diǎn)QPhs.s icau-3B.1的分子標(biāo)記M3B-1 a和M3B-2a及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及小麥分子育種領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定和篩選小麥新抗穗發(fā)芽主效QTL位點(diǎn)QPhs.Sicau-3B.1的引物對(duì)、分子標(biāo)記、分子標(biāo)記方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥?zhǔn)侨虮黄毡榉N植的糧食作物，也是我國(guó)種植量?jī)H次于水稻的作物，小麥穗發(fā)芽(Pre-harvest Sprouting,PHS)是指小麥種子在收獲前期遇到連綿不斷的陰雨天氣而在穗上發(fā)芽的情況。穗發(fā)芽是一種世界性災(zāi)害。據(jù)報(bào)道，在北歐和西歐沿海、智利大部、阿根廷、巴西、南非、津巴布韋、加拿大薩斯坎切溫和曼尼托巴地區(qū)、新西蘭東部地區(qū)種植的小麥較容易受到穗發(fā)芽的危害，美國(guó)西太平洋州以及東部，加拿大的安大略省和澳大利亞的東部小麥帶都是穗發(fā)芽威脅特別嚴(yán)重的地區(qū)(肖世和，聞長(zhǎng)生，張海萍等，小麥穗發(fā)芽研究，北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2004年第I版:第5-8頁(yè))。我國(guó)受穗發(fā)芽危害的麥區(qū)約占全國(guó)小麥總面積的83%，在東北春麥區(qū)、西北春麥區(qū)、黃淮冬麥區(qū)、北部冬麥區(qū)、長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)、西南冬麥區(qū)均有不同程度的穗發(fā)芽情況的報(bào)道。其中，長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)是穗發(fā)芽嚴(yán)重危害的地區(qū)，西南冬麥區(qū)的四川盆地和陜南鄂西山地丘陵歷來(lái)是穗發(fā)芽的重災(zāi)區(qū)。
[0003]在小麥種子收獲前發(fā)生穗發(fā)芽會(huì)導(dǎo)致小麥子粒中相關(guān)水解酶活性迅速升高，降解子粒中的儲(chǔ)藏物質(zhì)，使容重(testing weight)、出粉率和面粉降落值(Falling number)下降，造成小麥各種食品加工品質(zhì)惡化，更會(huì)嚴(yán)重影響小麥的儲(chǔ)存和次年的播種質(zhì)量。這些都會(huì)對(duì)小麥的生產(chǎn)加工造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，發(fā)掘具有抗穗發(fā)芽能力的小麥資源對(duì)于小麥育種具有重要的意義。
[0004]分子標(biāo)記輔助育種選擇技術(shù)，即不依賴(lài)表型選擇，直接針對(duì)基因型進(jìn)行選擇，具有不受環(huán)境條件、基因間互作、基因型與環(huán)境互作影響等優(yōu)點(diǎn)，能夠快速高效地選育出目標(biāo)資源材料。DArT標(biāo)記是一項(xiàng)基于于DArT技術(shù)(Diversity arrays technology,多樣性微陣列技術(shù))來(lái)區(qū)分DNA多態(tài)性差異的分子標(biāo)記，其基本原理在于用相應(yīng)的探針組合與固定到芯片上的基因組限制性?xún)?nèi)切酶片段進(jìn)行雜交，只有與探針互補(bǔ)雜交的部分才有雜交信號(hào)，再通過(guò)掃描儀識(shí)別雜交信號(hào)的強(qiáng)弱和有無(wú)來(lái)獲得DArT標(biāo)記的多態(tài)性信息，是一種高通量的分子標(biāo)記技術(shù)。而簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSR)則是一類(lèi)廣泛存在與基因組上的由幾個(gè)核苷酸重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，在基因組上具有廣泛分布，多態(tài)性高，操作技術(shù)簡(jiǎn)單，費(fèi)用較低等特點(diǎn)。結(jié)合DArT標(biāo)記與SSR標(biāo)記進(jìn)行QTL定位不僅能有效地將主效QTL定位到較小的區(qū)段內(nèi)，結(jié)合物理圖譜更能比較方便地將目標(biāo)QTL錨定到相對(duì)準(zhǔn)確的位置，這大大減少 了目標(biāo)QTL的后續(xù)研究的工作量。因此，篩選出與抗穗發(fā)芽主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，并將該標(biāo)記開(kāi)發(fā)為能準(zhǔn)確鑒定特定QTL的STS標(biāo)記，對(duì)抗穗發(fā)芽材料選擇，在選育小麥抗穗發(fā)芽材料，提高小麥群體產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的意義。
[0005]小麥品種CSCR6屬于斯卑爾脫小麥(Ma J，Li H B, Zhang C Y, etal.1dentification and validation of a major QTL conferring crown rot resistancein hexaploid wheat[J].Theoretical and applied genetics, 2010, 120 (6):1119-1128.)，經(jīng)過(guò)穗發(fā)芽鑒定發(fā)現(xiàn)該品種具有較好的穗發(fā)芽抗性。利用該材料為抗源并與澳大利亞感穗發(fā)芽品種Lang構(gòu)建F7代重組自交系，并結(jié)合84對(duì)具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)和隨機(jī)選取的967個(gè)覆蓋小麥全基因組的DArT標(biāo)記數(shù)據(jù)構(gòu)建遺傳圖譜，同時(shí)還考察了 2011年、2012年兩年該重組自交系的穗發(fā)芽表型數(shù)據(jù)，通過(guò)軟件MapQTL5.0進(jìn)行QTL計(jì)算，最終在3B長(zhǎng)臂上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與穗發(fā)芽相關(guān)的主效QTL QPhs.sicau-3B.1位于wPt_3107和wPt_6785區(qū)間內(nèi)，該QTL能解釋15.4%的表型變異。針對(duì)該抗性主效QTL展開(kāi)進(jìn)一步研究，并將與主效QTL緊密連鎖的標(biāo)記開(kāi)發(fā)為可用于輔助育種選擇的STS標(biāo)記，能有效提高小麥育種中對(duì)抗穗發(fā)芽材料的選擇的效率和準(zhǔn)確性。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于提供與小麥CSCR6的抗穗發(fā)芽QTL QPhs.sicau-3B.1緊密連鎖的分子標(biāo)記。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供鑒定上述分子標(biāo)記的引物對(duì)。
[0008]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述分子標(biāo)記的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0010]本發(fā)明的新抗穗發(fā)芽主效QTL QPhs.sicau-3B.1來(lái)自斯卑爾脫小麥CSCR6，該QTL位于小麥的3B染色體長(zhǎng)臂，靠近端粒處，LOD值大于3.0，能解釋15.4%的表型變異。
[0011]本發(fā)明用于鑒定該QTL的分子標(biāo)記是根據(jù)與目標(biāo)QTL緊密連鎖的DArT標(biāo)記序列設(shè)計(jì)的特異性引物，并將其應(yīng)用于由CSCR6構(gòu)建的重組自交系中進(jìn)行篩選，結(jié)合表型分析，發(fā)現(xiàn)不同帶型對(duì)應(yīng)的穗發(fā)芽強(qiáng)弱差異達(dá)到了顯著或極顯著水平。
[0012]本發(fā)明用于鑒定該QTL的分子標(biāo)記的引物對(duì)的核苷酸序列如下:(如SEQ IDN0.1-N0.4 所示)。
[0013]M3B-la:
[0014]正向引物:5’一 3’ TGCAGCGTGGTTTGGG (SEQ ID N0.1)
[0015]反向引物:5’一 3’ TGCAGAGTCAAAGAACTATGATAG (SEQ ID N0.2)
[0016]M3B-2a:
[0017]正向引物:5’一 3’ TTAGTCCACTGAGAACATGGCG (SEQ ID N0.3)
[0018]反向引物:5’一 3’ ACGTGGGAGGATGTGCAAAG (SEQ ID N0.4)
[0019]所述分子標(biāo)記M3B_la和M3B_2a，是以小麥CSCR6和Lang的基因組DNA為底物進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的片段，與QPhs.sicau-3B.1之間遺傳距離分別為3.9cM和2.0cM0
[0020]發(fā)明人提供了一種鑒定小麥抗穗發(fā)芽QTL QPhs.sicau-3B.1的分子標(biāo)記方法，包括:以待鑒定材料的DNA作為模板，用上述的分子標(biāo)記的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，再用成像儀進(jìn)行檢測(cè)；能擴(kuò)增出與CSCR6相同片段的植株為含有抗穗發(fā)芽主效QTL QPhs.sicau-3B.1的植株。
[0021]上述步驟中PCR具體的步驟是:
[0022]I)以待鑒定材料DNA作為模板，利用SEQ ID N0.USEQ ID N0.2所示的引物對(duì)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0023]a.PCR 擴(kuò)增體系:2.5μ 110 XPCR buffer,0.75U plus Taq DNA 聚合酶、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各3 μ mol、模板DNA200ng、雙蒸水加至總量為25 μ I ;
[0024]b.PCR 程序:94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s、55°C退火 30s、72°C延伸 30s，共 35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min ；
[0025]c.PCR產(chǎn)物檢測(cè):PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，電極緩沖液為I X TAE，恒定電壓150伏；凝膠最后用成像儀檢測(cè)；
[0026]2)以待鑒定材料DNA作為模板，利用SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4所示的引物對(duì)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。[0027]a.PCR 擴(kuò)增體系:2.5μ 110 XPCR buffer,0.5U plus Taq DNA 聚合酶、0.2mmol/LdNTP、上下游引物各2 μ mol、模板DNA200ng、雙蒸水加至總量為25 μ I ;
[0028]b.PCR 程序:94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s、60°C退火 45s、72°C延伸 30s，共 35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ；
[0029]c.PCR產(chǎn)物檢測(cè):PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，電極緩沖液為I X TAE，恒定電壓150伏；凝膠最后用成像儀檢測(cè)；
[0030]3)鑒定結(jié)果為:能擴(kuò)增出與CSCR6相同片段的植株為含有抗穗發(fā)芽主效QTLQPhs.sicau-3B.1的植株。反之，能擴(kuò)增出與Lang相同片段的植株為不含有該主效QTL的植株。
[0031]所述鑒定小麥抗穗發(fā)芽的引物對(duì)或所述檢測(cè)小麥抗穗發(fā)芽能力強(qiáng)弱的方法在如下(a)-(e)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:
[0032](a)篩選抗穗發(fā)芽能力強(qiáng)的小麥品種。
[0033](b)篩選抗穗發(fā)芽能力弱的小麥品種。
[0034](c)培育抗穗發(fā)芽/強(qiáng)休眠性的小麥品種。
[0035](d)所述QTL在小麥特異抗穗發(fā)芽材料創(chuàng)制中的應(yīng)用。
[0036](e)所述分子標(biāo)記引物對(duì)在小麥特異抗穗發(fā)芽材料創(chuàng)制中的應(yīng)用。
[0037]本發(fā)明小麥CSCR6抗穗發(fā)芽QTL及其分子標(biāo)記是通過(guò)以下方法獲得的:
[0038]I)利用抗穗發(fā)芽小麥材料CSCR6為母本，以澳大利亞感穗發(fā)芽品種Lang為父本雜交，得到雜交種F1，按照單粒傳法構(gòu)建得到由92個(gè)子代夠成的重組自交系F7作圖群體。
[0039]2) RIL F7穗發(fā)芽鑒定
[0040]收獲小麥蠟熟期種子，將其懸掛于陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干7d后，進(jìn)行人工脫粒。在有蓋塑料培養(yǎng)皿中墊上用3-5ml蒸餾水潤(rùn)濕的濾紙進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子。每隔一天挑出已露白和已發(fā)霉的種子，并分別計(jì)數(shù)，種子發(fā)芽率以第7天發(fā)芽種子數(shù)占總種子數(shù)百分比表示，計(jì)算發(fā)芽率。
[0041]發(fā)芽率(％)=發(fā)芽種子數(shù)/ (種子總數(shù)-發(fā)霉數(shù))X 100%
[0042]3)基因型分析
[0043]a)基因組DNA提取:采用CTAB法提取親本CSCR6、Lang和F7代群體植株DNA。
[0044]b) SSR、DArT 分析
[0045]①親本之間多態(tài)性SSR分子標(biāo)記的篩選:選取GrainGenes數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //wheat, pw.usda.gov/cg1-bin/graingenes)上公布的覆蓋六倍體小麥A、B、D基因組的SSR引物，以親本CSCR6和Lang的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得84對(duì)多態(tài)性SSR分子標(biāo)記；[0046]②F7群體的SSR分析:以上述步驟獲得的84對(duì)具有多態(tài)性的標(biāo)記為引物，同時(shí)擴(kuò)增親本CSCR6和Lang以及F7群體植株的DNA，進(jìn)行基因型鑒定，獲得SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)。親本CSCR6的帶型記為a，親本Lang的帶型記為b。F7群體帶型來(lái)源于CSCR6的記為a，來(lái)源于Lang的記為b。
[0047]③F7群體的DArT分析:選取在小麥21條染色體上隨機(jī)分布的967個(gè)DArT標(biāo)記探針對(duì)親本CSCR6、Lang和F7代群體進(jìn)行匹配分析，獲得DArT標(biāo)記數(shù)據(jù)
[0048]④連鎖圖譜構(gòu)建:根據(jù)SSR和DArT標(biāo)記數(shù)據(jù)，利用作圖軟件JoinMap4.0構(gòu)建遺傳圖譜。軟件MapQTL 5.0的區(qū)間作圖模型(Interval Mapping)和多QTL作圖模型(MultipleQTL Model),并結(jié)合F7群體穗發(fā)芽表型數(shù)據(jù)定位抗穗發(fā)芽QTL。發(fā)現(xiàn)小麥CSCR6的3B染色體上顯著存在一個(gè)與抗穗發(fā)芽相關(guān)的主效QTL QPhs.sicau-3B.1，能解釋15.4%的表型變異，DArT標(biāo)記wPt-5769、wPt-6785與其緊密連鎖，遺傳距離分別為3.9cM、2.0cM0
[0049]4) STS標(biāo)記的開(kāi)發(fā)
[0050]為了方便對(duì)小麥抗穗發(fā)芽候選材料進(jìn)行該QTL位點(diǎn)Qphs.sicau_3B.1的鑒定和輔助選擇，同時(shí)為了降低育種成本和工作量，增強(qiáng)育種工作中的可操作性，需要將與目標(biāo)QTL緊密連鎖的DArT標(biāo)記探針序列開(kāi)發(fā)為基于常規(guī)分子生物學(xué)手段可用于鑒定和篩選的STS標(biāo)記，以下是相關(guān)STS標(biāo)記開(kāi)發(fā)過(guò)程中的主要步驟:
[0051]①引物設(shè)計(jì):
[0052]為開(kāi)發(fā)基于常規(guī)PCR技術(shù)的分子標(biāo)記，方便用于分子標(biāo)記輔助育種及應(yīng)用，本發(fā)明開(kāi)展了將與QTL位點(diǎn)QPhs.sicau-3B.1緊密連鎖的DArT標(biāo)記wPt-5769、wPt-6785的探針序列轉(zhuǎn)化為常規(guī)分子標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)已知的DArT標(biāo)記wPt-5769探針序列設(shè)計(jì)如下引物:·[0053]M3B-la:
[0054]正向引物:5’一 3’ TGCAGCGTGGTTTGGG (SEQ ID N0.1)
[0055]反向引物:5’一 3’ TGCAGAGTCAAAGAACTATGATAG (SEQ ID N0.2)
[0056]M3B-lb:
[0057]正向引物:5’一 3’ GTGGTTTGGGCAGTTGAGAT (SEQ ID N0.5)
[0058]反向引物:5’一 3，ACTATGATAGACTGATTGCAGGT (SEQ ID N0.6)
[0059]M3B-lc:
[0060]正向引物:5’一 3’ GTGGTTTGGGCAGTTGAGATT (SEQ ID N0.7)
[0061]反向引物:5’一 3’ AGAACTATGATAGACTGATTGCAGG (SEQ ID N0.8)
[0062]根據(jù)已知的DArT標(biāo)記wPt_6785探針序列設(shè)計(jì)如下引物:
[0063]M3B-2a:
[0064]正向引物:5’一 3’ TTAGTCCACTGAGAACATGGCG (SEQ ID N0.3)
[0065]反向引物:5’一 3，ACGTGGGAGGATGTGCAAAG (SEQ ID N0.4)
[0066]M3B-2b:
[0067]正向引物:5’一 3’ GTCCACTGAGAACATGGCGT (SEQ ID N0.9)
[0068]反向引物:5’一 3，AAGAGACGTGGGAGGATGTG (SEQ ID N0.10)
[0069]M3B-2c:
[0070]正向引物:5’一 3’ GTCCACTGAGAACATGGCGTC (SEQ ID N0.11)[0071]反向引物:5’一 3’ GAAAGGGAAGAGACGTGGGAG (SEQ ID N0.12)
[0072]M3B-2d:
[0073]正向引物:5’一 3，ATTTAGTCCACTGAGAACATGGC (SEQ ID N0.13)
[0074]反向引物:5’一 3’ GTGGGAGGATGTGCAAAGGA (SEQ ID N0.14)
[0075]M3B-2e:
[0076]正向引物:5’一 3’ TTAGTCCACTGAGAACATGGC (SEQ ID N0.15)
[0077]反向引物:5’一 3’ GACGTGGGAGGATGTGCAA (SEQ ID N0.16)
[0078]M3B-2f:
[0079]正向引物:5’一 3’ TGCAGTAACAAATGACCAGTT (SEQ ID N0.17)
[0080]反向引物:5’一 3，GCAGAAAGGGAAGAGACG (SEQ ID N0.18)
[0081 ] 以CSC6和Lang基因組DNA為模板，分別利用以上引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，M3B-la能夠特異并穩(wěn)定地在親本CSCR6中擴(kuò)增出大小片段為400bp左右的條帶，而M3B-lb不能擴(kuò)增出任何條帶，M3B-lc雖能擴(kuò)增出條帶但片段大小在1000bp左右，而探針wPt-5769序列僅為400bp，因此擴(kuò)增出的也不是目的條帶。將用M3B-la擴(kuò)增出的片段與wPt-5769探針序列進(jìn)行比對(duì)，二者比對(duì)結(jié)果一致，因此選定M3B_la引物對(duì)作為擴(kuò)增該標(biāo)記wPt-5769的引物。
`[0082]另外，利用根據(jù)探針wPt-6785設(shè)計(jì)的6對(duì)引物在以CSC6和Lang基因組DNA為模板擴(kuò)增時(shí)，發(fā)現(xiàn)M3B-2b和M3B-2c產(chǎn)生了大量非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致泳道帶型不清晰，M3B_2d和M3B-2f不能擴(kuò)增出任何條帶，M3B-2d雖然能擴(kuò)增出特異性條帶，但是擴(kuò)增出條帶僅為700bp左右，將擴(kuò)增出的片段測(cè)序并與探針wPt-6785進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)相似性很低，且將該引物在作圖群體中擴(kuò)增出的條帶無(wú)法準(zhǔn)確反應(yīng)子代基因型不對(duì)應(yīng)。僅有M3B-2a能夠穩(wěn)定地在感穗發(fā)芽親本Lang中擴(kuò)增出大小片段為1000bp左右的條帶，將擴(kuò)增出的片段與探針wPt-6785序列進(jìn)行比對(duì)，相似度達(dá)到了 100%，而其余引物均不能擴(kuò)增出目的條帶或產(chǎn)生較多非特異性擴(kuò)增，因此選定M3B-2a引物對(duì)作為擴(kuò)增標(biāo)記wPt-6785的引物。
[0083]②PCR擴(kuò)增程序優(yōu)化
[0084]進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度分別設(shè)置45°C _65°C的梯度，擴(kuò)增完成后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)引物對(duì)M3B-la在退火溫度梯度在45°C _52°C的溫度區(qū)間內(nèi)時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量非特異性雜帶出現(xiàn)，53°C _58°C時(shí)在親本中存在有差異的特異性擴(kuò)增條帶，在55°C時(shí)該特異的擴(kuò)增條帶亮度最大，而當(dāng)退火溫度高于58°C時(shí)，該特異性擴(kuò)增條帶較弱甚至無(wú)帶。因此確定55°C為標(biāo)記M3B-la的最佳退火溫度。引物對(duì)M3B_2a的退火溫度梯度在45°C _57°C的溫度區(qū)間內(nèi)時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量非特異性雜帶出現(xiàn)，58°C _61°C時(shí)在親本中存在有差異的特異性擴(kuò)增條帶，在60°C時(shí)該特異的擴(kuò)增條帶亮度最大，而當(dāng)退火溫度高于62°C時(shí)，該特異性擴(kuò)增條帶較弱甚至無(wú)帶。最后確定60°C為標(biāo)記M3B-2a的最佳退火溫度。
[0085]③PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化
[0086]體系優(yōu)化主要針對(duì)DNA模板、引物和DNA聚合酶含量的多少進(jìn)行調(diào)整，以減少非特異性擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNA模板、引物、DNA聚合酶含量的不同都會(huì)影響擴(kuò)增質(zhì)量。M3B-la體系實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了 8組不同含量擴(kuò)增體系組合，如下表所示:
[0087]表1標(biāo)記M3B_la體系優(yōu)化內(nèi)容
【權(quán)利要求】
1.兩個(gè)用于鑒定小麥新抗穗發(fā)芽主效QTLQPhs.Sicau-3B.1的分子標(biāo)記M3B-la和M3B-2a，其特征在于，所述分子標(biāo)記與QPhs.sicau-3B.1之間的遺傳距離分別為3.9cM和2.0cM0
2.擴(kuò)增權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于，該兩個(gè)分子標(biāo)記的上游引物序列和下游引物序列分別如SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.4所示。
3.鑒定權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的方法，其特征在于， 以待鑒定材料的DNA作為模板，分別用如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2所示的引物對(duì)及SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4所示的引物對(duì)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 分析PCR產(chǎn)物； 能擴(kuò)增出與CSCR6相同片段的鑒定材料為含有抗穗發(fā)芽主效QTL QPhs.sicau-3B.1的植株，反之則為不含有抗穗發(fā)芽主效QTL QPhs.sicau-3B.1的植株。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步驟: O以待鑒定材料DNA作為模板，利用SEQ ID N0.USEQ ID N0.2所示的引物對(duì)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增: a.PCR 擴(kuò)增體系:2.5 μ 110XPCR buffer,0.75U plus Taq DNA 聚合酶、0.2mmol/LdNTP、上下游引物各3 μ mol、模板DNA200ng、雙蒸水加至總量為25 μ I ; b.PCR程序:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s、55°C退火30s、72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 7min `； c.PCR產(chǎn)物檢測(cè):PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，電極緩沖液為I X150伏；凝膠最后用成像儀檢測(cè)； 2)以待鑒定材料DNA作為模板，利用SEQID N0.3、SEQ ID N0.4所示的引物對(duì)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 a.PCR 擴(kuò)增體系:2.5μ 110XPCR buffer,0.5U plus Taq DNA 聚合酶、0.2mmol/LdNTP、上下游引物各2 μ mol、模板DNA200ng、雙蒸水加至總量為25 μ I ; b.PCR程序:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s、6(TC退火45s、72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 IOmin ； c.PCR產(chǎn)物檢測(cè):PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，電極緩沖液為I X150伏；凝膠最后用成像儀檢測(cè)； 3)鑒定結(jié)果為:能擴(kuò)增出與CSCR6相同片段的植株為含有抗穗發(fā)芽主效QTLQPhs.sicau-3B.1的植株；反之，能擴(kuò)增出與Lang相同片段的植株為不含有該主效QTL的植株。
5.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記或權(quán)利要求2所述的引物對(duì)在小麥抗穗發(fā)芽材料創(chuàng)制中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記或權(quán)利要求2所述的引物對(duì)在分子標(biāo)記輔助小麥抗穗發(fā)芽育種中的應(yīng)用。
7.含有權(quán)利要求2所述的引物對(duì)的試劑盒。
8.權(quán)利要求7所述的試劑盒在小麥抗穗發(fā)芽材料創(chuàng)制中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求7所述的試劑盒在分子標(biāo)記輔助小麥抗穗發(fā)芽育種中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103866006SQ201410049031
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年2月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月12日
【發(fā)明者】王際睿, 劉亞西, 劉宇嬌, 毛雙雙, 江千濤, 蒲至恩, 陳國(guó)躍, 魏育明, 鄭有良 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)