用于檢測(cè)青花菜雜交種領(lǐng)秀純度的引物序列及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于檢測(cè)青花菜雜交種領(lǐng)秀純度的引物序列及方法，用于檢測(cè)青花菜雜交種領(lǐng)秀純度的引物序列由SEQ?ID?No.1所示的上游引物序列和SEQ?ID?No.2所示的下游引物序列組成。本發(fā)明建立了一套準(zhǔn)確、快速的室內(nèi)種子純度鑒定體系，利用該體系可明確區(qū)分青花菜雜交種領(lǐng)秀是否混入其它的雜種，為領(lǐng)秀品種的鑒定、品種保護(hù)和快速推廣提供技術(shù)支撐。本發(fā)明的方法不受環(huán)境條件的影響，操作簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。且不受樣本材料的限制，整個(gè)生育期，植物的任何組織都可采樣進(jìn)行鑒定。利用本方法對(duì)本所培育的青花菜雜交種領(lǐng)秀進(jìn)行純度鑒定，鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致，在青花菜種子純度鑒定上具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】用于檢測(cè)青花菜雜交種領(lǐng)秀純度的引物序列及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的涉及一種快速、準(zhǔn)確用于檢測(cè)青花菜雜交種領(lǐng)秀純度的引物序列及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]雜種優(yōu)勢(shì)的利用是目前青花菜商品種生產(chǎn)的主要途徑，但是在雜交制種的過程中，由于品種自身的特性和許多不良因素的影響，易造成種子的生物學(xué)混雜或機(jī)械混雜，種子純度的鑒定是保證種子質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，大田形態(tài)鑒定是目前普遍采用的方法，此方法直觀可靠，但周期長、成本高、易受環(huán)境條件的影響、表型特征會(huì)出現(xiàn)一定程度的偏差等問題，而且由于品種數(shù)量的日益增加，種質(zhì)基礎(chǔ)越來越窄，遺傳變異變小，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定已難以滿足實(shí)際需要。
[0003]品種的純度和真實(shí)性鑒定，歸根到底是品種間的基因型的差別鑒定。以遺傳物質(zhì)DNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)是通過直接分析遺傳物質(zhì)的多態(tài)性來診斷生物內(nèi)在基因的排布規(guī)律，比較品種基因組DNA的結(jié)構(gòu)與組成，通過鑒定DNA水平上的差異來鑒別品種。一個(gè)純合的品種，其基因型是一致的，這種基因型可以用某種分子標(biāo)記加以確定，即基因型與分子標(biāo)記組合具有對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用這一標(biāo)記就可將這一品種與其它品種區(qū)別開來。
[0004]SSRCSimple Sequence Repeat,簡單重復(fù)序列)又稱微衛(wèi)星DNA,是一類由幾個(gè)(多為1-6個(gè))核苷酸為單位串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，長度一般在IOObp以內(nèi)。這些短的串聯(lián)重復(fù)是在DNA復(fù)制過程中，由于DNA滑動(dòng)、復(fù)制時(shí)，滑動(dòng)鏈與互補(bǔ)鏈堿基錯(cuò)配，而產(chǎn)生的一個(gè)或幾個(gè)重復(fù)單位的插入或缺失。微衛(wèi)星基因序列中，重復(fù)基因的重復(fù)次數(shù)不同，且重復(fù)的基因序列不同，產(chǎn)生了簡單序列長度多態(tài)性和隨機(jī)擴(kuò)增微衛(wèi)星多態(tài)性，從而反映高度的等位基因多樣性。由于微衛(wèi)星位點(diǎn)兩側(cè)的DNA序列較為保守，根據(jù)兩側(cè)的這個(gè)保守序列設(shè)計(jì)特定的引物，并通過PCR擴(kuò)增，將其間的核心衛(wèi)星DNA序列擴(kuò)增出來，結(jié)合凝膠電泳技術(shù)，就可以對(duì)這些多態(tài)性進(jìn)行比較分析。`
[0005]SSR標(biāo)記具有穩(wěn)定可靠，操作簡單，時(shí)間短，效率高，對(duì)DNA質(zhì)量要求不高，不受自然條件的影響等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于基因定位、種子純度檢測(cè)、植物進(jìn)化及遺傳多樣性的研究。進(jìn)行種子純度檢測(cè)時(shí)，可以識(shí)別母本因微量花粉導(dǎo)致的自交、父本混雜、花粉污染、機(jī)械混雜等帶來的非雜交種，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于田間的形態(tài)鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種特異性好的用于檢測(cè)青花菜雜交種領(lǐng)秀純度的引物序列。
[0007]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種準(zhǔn)確、快速地用于檢測(cè)青花菜雜交種領(lǐng)秀純度的方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0009]用于檢測(cè)青花菜雜交種領(lǐng)秀純度的引物序列，所述引物序列由SEQ ID N0.1所示的上游引物序列和SEQ ID N0.2所示的下游引物序列組成。
[0010]用于檢測(cè)青花菜雜交種領(lǐng)秀純度的方法，包括以下步驟:
[0011](I)提取待測(cè)青花菜基因組DNA ；
[0012](2)以待測(cè)青花菜基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.1所示核苷酸序列為上游引物，以SEQ ID N0.2所示核苷酸序列為下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0013](3)在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，在2%的瓊脂糖凝膠I X TAE中電泳分離，電泳結(jié)束后凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析；
[0014](4)依據(jù)各待測(cè)樣品在凝膠上的140bp和ISObp處同時(shí)具有條帶，鑒定為青花菜領(lǐng)秀雜交種。
[0015]本發(fā)明建立了一套準(zhǔn)確、快速的室內(nèi)種子純度鑒定體系，利用該體系可明確區(qū)分青花菜雜交種領(lǐng)秀是否混入其它的雜種，為領(lǐng)秀品種的快速鑒定、品種保護(hù)和快速推廣提供技術(shù)支撐。本發(fā)明的方法相對(duì)于傳統(tǒng)技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):不受環(huán)境條件的影響，操作簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。傳統(tǒng)的田間鑒定方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，采用本方法僅需5-6個(gè)小時(shí)就可完成一個(gè)批次的鑒定，且不受樣本材料的限制，整個(gè)生育期，植物的任何組織都可采樣進(jìn)行鑒定。利用本方法對(duì)本所培育的青花菜中領(lǐng)秀雜交種進(jìn)行純度鑒定，鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致，在青花菜種子純度鑒定上具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
[0016]本發(fā)明提供的引物序列及檢測(cè)方法只適用于青花菜雜交種領(lǐng)秀的真實(shí)性及純度檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為青花菜雜交種領(lǐng)秀PCR`擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜。
[0018]圖中M為DNA Marker ；P1為領(lǐng)秀父本，P2為領(lǐng)秀母本，1_9為待測(cè)青花菜樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述。
[0020]實(shí)施例1
[0021]用于檢測(cè)青花菜雜交種領(lǐng)秀純度的方法，包括以下步驟:
[0022](I) CTAB法提取9個(gè)待測(cè)青花菜種子發(fā)芽36小時(shí)的幼苗基因組DNA ；
[0023](2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增:在PCR擴(kuò)增專用薄壁管中加入步驟(1)獲得的基因組DNA15ng為模板，以SEQ ID N0.1所示核苷酸序列15ng為上游引物，以SEQ ID N0.2所示核苷酸序列15ng為下游引物，I倍的含Mg2+的PCR緩沖液，dNTP2mM, Taq DNA聚合酶0.5單位，加無菌雙蒸水至20 μ L ;PCR程序?yàn)?94°C預(yù)變性120s ;然后94°C變性15s，55°C退火20s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸60s，擴(kuò)增完成；
[0024](3)在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液[30mM EDTA、36%(v/v)甘油、0.05%(g/mL)二甲苯青FF、0.05%(g/mL)溴酚藍(lán)]，混勻，在2% (g/mL)的瓊脂糖凝膠I X TAE中電泳分離，120V恒電壓電泳至溴酚藍(lán)達(dá)到凝膠的另一端時(shí)停止電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察、照相，見圖1。以DNA Marker DL-2000為分子量標(biāo)準(zhǔn)，電泳結(jié)束后凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析；
[0025](4)依據(jù)各待測(cè)樣品在凝膠上的相對(duì)位置，通過下述特征鑒定青花菜中領(lǐng)秀雜交種的純度:在140bp和180bp處同時(shí)具有條帶的為青花菜中領(lǐng)秀雜交種。只有140bp或ISObp的條帶，或者二者都`沒有的，不是該品種。經(jīng)檢測(cè)9個(gè)樣品均為青花菜雜交種領(lǐng)秀。
【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)青花菜雜交種領(lǐng)秀純度的引物序列，其特征在于所述引物序列由SEQIDN0.1所示的上游引物序列和SEQ ID N0.2所示的下游引物序列組成。
2.用于檢測(cè)青花菜雜交種領(lǐng)秀純度的方法，其特征包括以下步驟: (1)提取待測(cè)青花菜基因組DNA； (2)以所述待測(cè)青花菜基因組DNA為模板，以SEQID N0.1所示核苷酸序列為上游引物，以SEQ ID N0.2所示核苷酸序列為下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3)在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，在2%的瓊脂糖凝膠IX TAE中電泳分離，電泳結(jié)束后凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析； (4)依據(jù)各待測(cè)樣品在凝膠上的140bp和ISObp處同時(shí)具有條帶，鑒定為青花菜領(lǐng)秀雜交種。`
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103773886SQ201410049825
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年2月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月13日
【發(fā)明者】江漢民, 孫德嶺, 李寬, 姚星偉, 單曉政, 劉莉莉, 文正華 申請(qǐng)人:天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司