細(xì)菌烯脂酰acp還原酶抑制劑的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種細(xì)菌烯脂酰ACP還原酶抑制劑的篩選方法，包括以下步驟：將糞腸球菌的fabK在大腸桿菌中表達(dá)，用三氯生抑制和不抑制大腸桿菌重組菌的FabI，構(gòu)建針對(duì)FabK的雙平板敏感差異篩選模型；構(gòu)建綠膿桿菌的fabI基因刪除突變株和fabV基因刪除突變株，以野生菌為對(duì)照，構(gòu)建針對(duì)FabI和FabV的三平板敏感差異篩選模型；將前兩個(gè)篩選模型組合一起篩選，并結(jié)合測定活性提取物對(duì)烯脂酰ACP還原酶的半抑制濃度和檢測烯脂酰ACP還原酶不同的表達(dá)菌株對(duì)活性提取物的敏感性差異的次級(jí)篩選。本發(fā)明的有益之處在于：不僅提高了篩選的效率，更容易篩選到廣譜的抑制劑，而且針對(duì)烯脂酰ACP還原酶的多樣性也無需建立多種藥物篩選模型；同時(shí)解決了假陽性高和篩選效率低的問題。
【專利說明】細(xì)菌烯脂酰ACP還原酶抑制劑的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抑制劑的篩選方法，具體涉及一種細(xì)菌烯脂酰ACP還原酶抑制劑的篩選方法，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]由于細(xì)菌對(duì)現(xiàn)有抗生素產(chǎn)生了耐藥性，而使其仍然嚴(yán)重威脅人類的健康，甚至出現(xiàn)了令全球恐慌的超級(jí)耐藥細(xì)菌。雖然科學(xué)界已經(jīng)非常熱衷于尋找作用于新的靶位點(diǎn)的新型抗生素，但是自上世紀(jì)60年代以來這些努力獲得的結(jié)果是有限的。盡管數(shù)以百計(jì)的細(xì)菌必需蛋白已經(jīng)被鑒定可作為潛在藥物作用靶點(diǎn)，但是其中僅有少數(shù)成為臨床治療藥物的靶點(diǎn)。在過去幾十年，通過對(duì)已有抗生素的骨架進(jìn)行化學(xué)修飾來提高它們的活性，這種策略開發(fā)出了有效的抗生素；然而，通過化學(xué)修飾來開發(fā)更為有效抗生素的難度越來越大。為了適應(yīng)緊急臨床的需要，尤其是克服不斷出現(xiàn)的細(xì)菌耐藥性，發(fā)現(xiàn)新穎的具有新作用方式的抗生素化學(xué)骨架對(duì)于挽救生命是至關(guān)重要的。
[0003]II型脂肪酸合成是細(xì)菌細(xì)胞生存所必需的，因此，它是新抗生素的潛在靶點(diǎn)。細(xì)菌脂肪酸合成途徑與哺乳動(dòng)物的相比，雖然生化反應(yīng)過程相似，但是二者在參與催化反應(yīng)的酶結(jié)構(gòu)和氨基酸序列上沒有同源性，屬不同的脂肪酸合成酶系。細(xì)菌和哺乳動(dòng)物之間脂肪酸合成系統(tǒng)的顯著差異以及脂肪酸在細(xì)胞中所扮演的特殊的角色，使該系統(tǒng)成為非常有吸引力的藥物篩選靶點(diǎn)。脂肪酸合成途徑中執(zhí)行循環(huán)反應(yīng)第四步的烯脂酰ACP還原酶是細(xì)菌脂肪酸合成所必需的，它已被證明是兩種在市場上銷售的抗菌劑三氯生(triclosan)和異煙肼(isoniazid)的作用靶點(diǎn)。雖然烯脂酰ACP還原酶的許多其它抑制劑已經(jīng)被報(bào)道，但是到目前為止市場上還沒有 出現(xiàn)以烯脂酰ACP還原酶為藥物靶點(diǎn)的新的已商品化的抗菌劑。在細(xì)菌中，烯脂酰ACP還原酶存在多樣性，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的烯脂酰ACP還原酶有4種。而目前抑制劑的篩選都是以單一一種烯脂酰ACP還原酶為藥物靶點(diǎn)，為此針對(duì)烯脂酰ACP還原酶的多樣性需要建立多種藥物篩選模型，這很大程度上影響了藥物篩選的速度。
[0004]因此，如果能建立一套針對(duì)烯脂酰ACP還原酶多樣性，即同時(shí)以多種烯脂酰ACP還原酶為藥物篩選靶點(diǎn)的篩選模型，將會(huì)提高藥物篩選的效率，這對(duì)具有新作用方式的新型抗生素的發(fā)現(xiàn)具有非常重要的意義。
[0005]烯脂酰ACP還原酶催化II型脂肪酸合成循環(huán)反應(yīng)的最后一個(gè)限速步驟反-2-烯脂酰ACP的還原，是篩選抗菌藥物的重要靶點(diǎn)。在不同細(xì)菌中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 4種不同烯脂酰ACP 還原酶，F(xiàn)abl、FabL、FabK 和 FabV，具體見表 I。
[0006]表1細(xì)菌烯脂酰ACP還原酶的多樣性
[0007]
【權(quán)利要求】
1.細(xì)菌烯脂酰ACP還原酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟: (一)、根據(jù)FabI是三氯生在大腸桿菌中的唯一作用靶點(diǎn)，將糞腸球菌的fabK在大腸桿菌中表達(dá)，用三氯生抑制和不抑制大腸桿菌重組菌的FabI，構(gòu)建針對(duì)FabK的雙平板敏感差異篩選模型； (二)、利用烯脂酰ACP還原酶的同工酶之間的差異性及可相互替代性，構(gòu)建綠膿桿菌的fab I基因刪除突變株和fabV基因刪除突變株，以野生菌為對(duì)照，構(gòu)建針對(duì)FabI和FabV的二平板敏感差異篩選模型； (三)、將步驟(一)和步驟(二)所構(gòu)建的篩選模型組合一起篩選，并結(jié)合測定活性提取物對(duì)烯脂酰ACP還原酶的半抑制濃度和檢測烯脂酰ACP還原酶不同的表達(dá)菌株對(duì)活性提取物的敏感性差異的次級(jí)篩選。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌烯脂酰ACP還原酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，步驟(一)包括以下子步驟: (1)PCR擴(kuò)增糞腸球菌的fabK、綠膿桿菌的fabl和fabV，并分別克隆到pET28b載體上，構(gòu)建蛋白表達(dá)純化載體，在大腸桿菌中表達(dá)； (2)將糞腸球菌fabK、綠膿桿菌fabl和fabV分別從pET28b重組載體亞克隆至pBluescript載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655，構(gòu)建高表達(dá)糞腸球菌fabK、綠膿桿菌fabl和fab V的大腸桿菌重組菌MBlueK、MBlueI和MblueV,將空載體pBluescript轉(zhuǎn)化MG1655構(gòu)建大腸桿菌重組菌Mblue ； (3)將pET28b載體上糞腸球菌的fabK和綠膿桿菌fabV，亞克隆至低拷貝表達(dá)載體PHSG575上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌野生型菌株MG1655，構(gòu)建低表達(dá)糞腸球菌FabK和綠膿桿菌FabV的大腸桿菌重組菌MGK和MGV，分別用于構(gòu)建針對(duì)FabK和FabV的雙平板敏感差異篩選模型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌烯脂酰ACP還原酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，步驟(二)包括以下子步驟: 以綠膿桿菌基因組DNA為模板分別PCR擴(kuò)增fabl和fabV的上下游序列，通過重疊延伸PCR或酶切連接的方法構(gòu)建基因刪除盒Λ fabl和Λ fab V,從質(zhì)粒p34s_Gm上酶切GmR基因，連接到基因刪除盒Λ fabl和Λ fabV的一側(cè)，構(gòu)建基因敲除盒Λ fab 1-GmR和Λ fabV-GmR,克隆至自殺載體pK18mobsacB上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17-1構(gòu)建重組菌,并通過接合作用將重組自殺性載體導(dǎo)入綠膿桿菌，結(jié)合抗性篩選、蔗糖篩選和PCR鑒定，獲得fabl和fabV無抗性篩選標(biāo)記的基因刪除突變株，分別命名為PAO-1和PA0-V，以野生型菌株為對(duì)照，構(gòu)建針對(duì)FabI和FabV的三平板敏感差異篩選模型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌烯脂酰ACP還原酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，步驟(三)包括以下子步驟: (1)、初級(jí)篩選:從植物 和微生物中提取活性提取物，提取物用紙片法或杯碟法進(jìn)行抑菌活性測定； (2)、次級(jí)篩選:檢測烯脂酰ACP還原酶不同的表達(dá)菌株對(duì)初篩獲得的活性提取物的敏感性差異，檢測初篩獲得的活性提取物對(duì)烯脂酰ACP還原酶的半抑制濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)菌烯脂酰ACP還原酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，在所述次級(jí)篩選中，通過活性提取物的抗菌譜及最小抑菌濃度的測定檢測烯脂酰ACP還原酶不同的表達(dá)菌株對(duì)活性提取物的敏感性差異。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)菌烯脂酰ACP還原酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，在所述次級(jí)篩選中，檢測初篩獲得的活性提取物對(duì)烯脂酰ACP還原酶的半抑制濃度，包括以下步驟: (1)、將已構(gòu)建的蛋白表達(dá)純化載體，在大腸桿菌中表達(dá)，利用6Xhis-tag蛋白分離純化技術(shù)，純化大腸桿菌的Fabl、糞腸球菌的FabK、綠膿桿菌的FabI和FabV ； (2)、以丁烯酰-Cok或反-2-辛酰-N-乙酰半胱胺為底物，添加酶蛋白、NADH或NADPH和活性提取物，體外重建烯脂酰ACP還原酶催化的還原反應(yīng)，測量反應(yīng)過程中NADH或NADPH的吸光度OD34tl的變化，每IOsec讀數(shù)一次，記錄數(shù)據(jù)，在反應(yīng)過程中保持體系溫度為37°C，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD340為縱坐標(biāo)，繪制曲線，擬合出線性回歸方程，計(jì)算斜率； (3)、活性提取物對(duì)烯脂酰ACP還原酶的抑制活性IC(%) =IOOX [1_(活性提取物存在時(shí)的斜率/空白對(duì)照的斜率)]，以活性提取物的濃度為橫坐標(biāo)、抑制活性為縱坐標(biāo)繪制曲線，通過曲線求得ic5(l。
【文檔編號(hào)】C12N15/74GK103805678SQ201410051932
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月14日
【發(fā)明者】成娟麗, 林金水, 王紅 申請(qǐng)人:運(yùn)城學(xué)院