抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白表達(dá)的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及靶向運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)基因的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，以及用所述dsRNA抑制TTR表達(dá)的方法。
【專利說明】抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白表達(dá)的組合物和方法
[0001]本申請是申請日為2009年10月20日和發(fā)明名稱為“抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白表達(dá)的組合物和方法”的200980141740.4號(hào)發(fā)明專利申請的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及靶向運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)基因的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，以及使用dsRNA抑制TTR表達(dá)的方法。
[0003]相關(guān)申請的交叉引用
[0004]本申請要求2008年10月20日提交的序號(hào)為61 / 106，956的美國臨時(shí)申請、2008年11月18日提交的序號(hào)為61 / 115，738的美國臨時(shí)申請、2009年3月2日提交的序號(hào)為61 / 156,670的美國臨 時(shí)申請、2009年6月9日提交的序號(hào)為61 / 185，545的美國臨時(shí)申請、2009年9月15日提交的序號(hào)為61 / 242，783的美國臨時(shí)申請和2009年9月22日提交的序號(hào)為61 / 244，794的美國臨時(shí)申請的權(quán)益，為所有目的，所有這些申請以引用方式全部合并于此。
[0005]序列表參考
[0006]本申請包括以名為16126PCT_Sequence_Listing、在2009年創(chuàng)建、大小為346，516字節(jié)的文本文件電子提交的序列表，該序列表以引用方式合并于此。
【背景技術(shù)】
[0007]運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)是一種分泌的甲狀腺激素-結(jié)合蛋白。TTR結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP) /維生素A及血漿和腦脊液中的血清甲狀腺素(T4)。
[0008]正常序列TTR和變異序列TTR均引起淀粉樣變性。正常序列TTR在老年人中引起心臟性淀粉樣變性，稱為老年性系統(tǒng)性淀粉樣變性(SSA)(也稱為老年性心臟性淀粉樣變性(SCA))。SSA通常伴有許多其他器官中的微小沉淀。TTR突變加速TTR淀粉體形成過程，并且是發(fā)展臨床上重要的TTR淀粉樣變性(也稱為ATTR(淀粉樣變性-運(yùn)甲狀腺素蛋白型))的最重要的危險(xiǎn)因素。已知超過85種淀粉樣蛋白形成TTR變體引起系統(tǒng)性家族性淀粉樣變性。肝臟是TTR表達(dá)的主要位置。其他重要的表達(dá)位置包括脈絡(luò)叢、視網(wǎng)膜和胰腺。
[0009]TTR淀粉樣變性表現(xiàn)為多種形式。當(dāng)更多地影響周圍神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)，該疾病稱為家族性的淀粉樣變性多神經(jīng)病(FAP)。當(dāng)主要涉及心臟而不是神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)，該疾病稱為家族性淀粉樣變性心肌病(FAC)。第三種主要類型的TTR淀粉樣變性稱為軟腦膜/ CNS (中樞神經(jīng)系統(tǒng))淀粉樣變性。
[0010]已顯示雙鏈RNA分子(dsRNA)以稱為RNA干擾(RNAi)的高度保守調(diào)節(jié)機(jī)制阻斷基因表達(dá)。W099 / 32619 (Fire等)公開了利用長度為至少25個(gè)核苷酸的dsRNA抑制秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中的基因表達(dá)。也顯示dsRNA降解其他有機(jī)體中的靶標(biāo)RNA，所述其他有機(jī)體包括植物(例如參見W099 / 53050，Waterhouse等；以及W099 / 61631, Heifetz等)、果蠅(例如參見Yang，D.，等Curr.Biol.(2000) 10 =1191-1200)和哺乳動(dòng)物(參見WOOO / 44895, Limmer ;和 DEIOIOO586.5, Kreutzer 等)。
[0011]U.S.20070207974 公開了功能性和超功能性 siRNA。U.S.20090082300 公開了針對(duì)TTR的反義分子。U.S.專利N0.7，250, 496公開了針對(duì)TTR的微RNA。
[0012]發(fā)明簡述
[0013]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有有義鏈和反義鏈，所述反義鏈含有與編碼運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)的mRNA的一部分互補(bǔ)的區(qū)域，其中所述互補(bǔ)區(qū)域的長度小于30個(gè)核苷酸，所述反義鏈含有 SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:450、SEQ ID NO:730 或 SEQ ID NO:1010 的 15 或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，所述有義鏈含有SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:449,SEQ ID NO:729或SEQ ID NO: 1009的15或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，所述有義鏈由SEQ ID NO:449組成，所述反義鏈由SEQ ID NO:450組成。在又一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，所述有義鏈由SEQ ID NO:729組成，所述反義鏈由SEQ ID NO:730組成。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，所述有義鏈由SEQ ID NO:1009組成，所述反義鏈由SEQ ID NO:1010組成。在又一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，所述dsRNA含有選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的有義鏈和選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的反義鏈。
[0014]在某些實(shí)施方式中，dsRNA的反義鏈與編碼運(yùn)甲狀腺素蛋白的mRNA之間的互補(bǔ)區(qū)域的長度是19個(gè)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，互補(bǔ)區(qū)域由SEQ ID NO:169組成。在其他實(shí)施方式中，dsRNA的各鏈的長度是19、20、21、22、23或24個(gè)核苷酸。在又一個(gè)實(shí)施方式中，各鏈的長度是21個(gè)核苷酸。
[0015]在某些實(shí)施方式中，用于抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白表達(dá)的dsRNA不在SEQ ID NO:1331的位置637上的腺嘌呤 核苷酸與SEQ ID NO:1331的位置638上的鳥嘌呤核苷酸之間切割TTR mRNA。在其他實(shí)施方式中，dsRNA在SEQ ID NO:1331的位置636上的鳥嘌呤核苷酸與SEQ ID NO:1331的位置637上的腺嘌呤核苷酸之間切割TTR mRNA。在某些實(shí)施方式中，dsRNA與SEQ ID NO:1331的位置628上的鳥嘌呤核苷酸和SEQ ID NO:1331的位置646上的尿嘧啶核苷酸之間的TTR mRNA退火。
[0016]在其它相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白表達(dá)的上述dsRNA，其中所述dsRNA含有一個(gè)或多個(gè)修飾核苷酸。在相關(guān)實(shí)施方式中，至少一個(gè)修飾核苷酸(或多個(gè)核苷酸)選自下組:2' -O-甲基修飾核苷酸、含有5'-硫代磷酸基團(tuán)的核苷酸、以及與膽固醇基衍生物或十二烷酸二癸基酰胺基相連的末端核苷酸。在另一相關(guān)實(shí)施方式中，所述修飾核苷酸選自下組:2'-脫氧-2'-氟代修飾核苷酸、2'-脫氧-修飾核苷酸、鎖核苷酸、脫堿基核苷酸、2'-氨基-修飾核苷酸、2'-烷基-修飾核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、和含有非天然堿基的核苷酸。在某些實(shí)施方式中，所述dsRNA含有至少一個(gè)W -O-甲基修飾核苷酸。
[0017]在其他實(shí)施方式中，用于抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白表達(dá)的上述dsRNA與配體偶聯(lián)，或配制在脂質(zhì)制劑中。在某些實(shí)施方式中，所述脂質(zhì)制劑可以是LNP制劑、LNPOl制劑、XTC-SNALP制劑或SNALP制劑。在相關(guān)實(shí)施方式中，XTC-SNALP制劑如下:以比例為57.1 /7.1 / 34.4 / 1.4 的 XTC / DPPC / 膽固醇 / PEG-cDMA 使用 2，2- 二亞油基 _4_ 二甲基氨基乙基-[I，3]- 二氧戍環(huán)(2, 2-Dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[l, 3]-dioxolane)(XTC)以及比例約為7的脂質(zhì):siRNA。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，所述dsRNA的有義鏈由SEQ ID NO:1009組成且反義鏈由SEQ ID NO: 1010組成，所述dsRNA配制成如下XTC-SNALP制劑:以比例為 57.1 / 7.1 / 34.4 / 1.4 的 XTC / DPPC / 膽固醇 / PEG-cDMA 使用 2，
2-二亞油基-4-二甲基氨基乙基-[I，3]-二氧戊環(huán)(XTC)以及比例約為7的脂質(zhì):siRNA?；蛘?，上述dsRNA可配制成如下LNP09制劑:使用比例為50 / 10 / 38.5 / 1.5mol%的XTC / DSPC /膽固醇/ PEG2000-CH以及比例約為11: I的脂質(zhì):siRNA。在另一種變形中，所述dsRNA配制成如下LNPll制劑:使用比例為50 / 10 / 38.5 / 1.5mol%的MC3 /DSPC /膽固醇/ PEG2000-CH以及比例約為11: I的脂質(zhì):siRNA。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且相對(duì)于PBS對(duì)照組，在0.3mg / kg的劑量時(shí)降低TTR mRNA水平約85到90%。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且相對(duì)于PBS對(duì)照組，在0.1mg / kg的劑量時(shí)降低TTR mRNA水平約50%。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且通過蛋白質(zhì)印跡測定，相對(duì)于PBS對(duì)照組以劑量依賴性方式降低TTR蛋白水平。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述dsRNA配制成如下SNALP制劑:以比例為57.1 / 7.1 / 34.4 / 1.4的DLinDMA /DPPC /膽固醇/ PEG2000-CDMA使用DLinDMA以及比例約為7的脂質(zhì):siRNA。[0018]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白表達(dá)的上述dsRNA，其中施用dsRNA至細(xì)胞導(dǎo)致通過實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)測得的約95%的TTR mRNA表達(dá)的抑制，其中所述細(xì)胞是HepG2細(xì)胞或Hep3B細(xì)胞，且其中dsRNA的濃度是ΙΟηΜ。在相關(guān)實(shí)施方式中，施用dsRNA至細(xì)胞導(dǎo)致通過分支DNA試驗(yàn)測得的約74%的TTR mRNA表達(dá)的抑制，其中所述細(xì)胞是H印G2細(xì)胞或H印3B細(xì)胞，且其中dsRNA的濃度是ΙΟηΜ。在其他相關(guān)實(shí)施方式中，dsRNA在H印G2細(xì)胞中的IC50小于ΙΟρΜ，其中dsRNA的濃度是ΙΟηΜ。在其他相關(guān)實(shí)施方式中，dsRNA的ED50約為Img / kg。在其他相關(guān)實(shí)施方式中，施用dsRNA能降低食蟹猴肝臟中的TTR mRNA約80%，其中dsRNA的濃度是3mg / kg。在其他相關(guān)實(shí)施方式中，通過IFN-α和TNF-a ELISA試驗(yàn)測定，施用dsRNA不導(dǎo)致人外周血單核細(xì)胞(PBMC)的免疫刺激活性。在其他相關(guān)實(shí)施方式中，施用dsRNA降低肝臟TTR mRNA水平約97%或血清TTR蛋白水平約90%，其中dsRNA的濃度是6mg / kg。在其他相關(guān)實(shí)施方式中，施用dsRNA降低肝臟TTRmRNA水平或血清TTR蛋白水平直到22天,其中dsRNA的濃度是6mg / kg或3mg / kg。在其他相關(guān)實(shí)施方式中，當(dāng)以Img / kg或3mg / kg施用于需要治療的受試者時(shí),dsRNA抑制血清TTR蛋白水平直到治療后第14天。在其他相關(guān)實(shí)施方式中，通過實(shí)時(shí)PCR測定，濃度為0.1nM的dsRNA使Hep3B細(xì)胞中的TTR表達(dá)降低98.9%。在其他相關(guān)實(shí)施方式中，通過實(shí)時(shí)PCR測定，濃度為IOnM的dsRNA使!fep3B細(xì)胞中的TTR表達(dá)降低99.4%。
[0019]在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有有義鏈和反義鏈，所述反義鏈含有與編碼運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)的mRNA的一部分互補(bǔ)的區(qū)域，其中所述互補(bǔ)區(qū)域的長度小于30個(gè)核苷酸，且其中所述dsRNA含有選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的有義鏈和選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的反義鏈。
[0020]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有反義鏈，所述反義鏈含有與SEQ ID NO:1331的核苷酸618-648的15-30個(gè)核苷酸互補(bǔ)的區(qū)域，且其中所述反義鏈與SEQ ID NO:1331的位置628上的鳥嘌呤堿基配對(duì)。[0021]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供含有以上簡述中所述任何dsRNA的細(xì)胞。在某些其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供含有編碼以上簡述中所述任何dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列的載體。在某些實(shí)施方式中，該載體處于細(xì)胞中。
[0022]在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于抑制TTR基因表達(dá)的藥物組合物，其含有以上簡述中描述的任何dsRNA和藥學(xué)可接受的載體。在相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于抑制TTR基因表達(dá)的藥物組合物，其含有dsRNA和SNALP制劑，其中所述dsRNA包含長度小于30個(gè)核苷酸的反義鏈，所述反義鏈包含SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:450、SEQ ID NO:730或SEQ ID NO:1010的15或更多個(gè)連續(xù)核苷酸，且其中所述SNALP制劑包含各自比例為 57.1 / 7.1 / 34.4 / 1.4 的 DlinDMA、DPPC、膽固醇和 PEG2000_cDMA。
[0023]在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供抑制細(xì)胞中TTR表達(dá)的方法，所述方法包括:
(a)使細(xì)胞與以上簡述中描述的任何dsRNA接觸；和(b)將步驟(a)得到的細(xì)胞保持足以獲得TTR基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物降解的時(shí)間，從而抑制細(xì)胞中TTR基因的表達(dá)。
[0024]在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供由TTR表達(dá)介導(dǎo)的疾病的治療方法，包括將治療有效量的上述簡述中描述的任何dsRNA施用于需要這種治療的人。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述dsRNA以約0.01、0.1、0.5、1.0、2.5或5.0mg / kg施用于人。在又一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，所述dsRNA以約1.0mg / kg施用于人。在又一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，所治療的人患有運(yùn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性和/或肝臟疾病。在相關(guān)實(shí)施方式中，給該人進(jìn)一步提供肝臟移植。在又一個(gè)實(shí)施方式中，施用dsRNA能降低人類肝臟的TTR mRNA約80%，其中dsRNA的濃度是3mg / kg。在其他相關(guān)實(shí)施方式中，通過IFN-α和TNF-a ELISA試驗(yàn)測定，施用dsRNA不會(huì)導(dǎo)致人類的免疫刺激活性。在又一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，施用dsRNA降低肝臟TTR mRNA水平約97%或血清TTR蛋白水平約90%，其中dsRNA的濃度是6mg / kg。在又一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，施用dsRNA降低肝臟TTR mRNA水平和/或血清TTR蛋白水平直到22天，其中dsRNA的濃度是6mg / kg或3mg / kg。在又一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，所述dsRNA配制成如下LNP09 制劑:使用比例為 50 / 10 / 38.5 / 1.5mol% 的 XTC / DSPC / 膽固醇 / PEG2000-CH以及比例約為11: I的脂質(zhì):siRNA。在又一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，所述dsRNA配制成如下LNPll 制劑:使用比例為 50 / 10 / 38.5 / 1.5mol%的MC3 / DSPC / 膽固醇 / PEG2000-CH以及比例約為11: I的脂質(zhì):siRNA。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且相對(duì)于PBC對(duì)照組，在0.3mg / kg的劑量時(shí)降低TTR mRNA水平約85到90%。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述dsRNA配制成在LNP09制劑或LNPll制劑，并且相對(duì)于PBC對(duì)照組，在0.1mg / kg的劑量時(shí)降低TTR mRNA水平約50%。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且通過蛋白質(zhì)印跡測定，相對(duì)于PBC對(duì)照組以劑量依賴性方式降低TTR蛋白水平。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，當(dāng)以Img / kg或3mg /kg施用于人類時(shí)，dsRNA抑制血清TTR蛋白水平直到治療后第14天。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述dsRNA配制成如下SNALP制劑:以比例為57.1 / 7.1 / 34.4 / 1.4的DLinDMA /DPPC /膽固醇/ PEG2000-CDM A使用DlinDMA以及比例約為7的脂質(zhì):siRNA。
[0025]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供dsRNA在治療由TTR表達(dá)介導(dǎo)的疾病中的用途，包括將治療有效量的上述簡述中描述的任何dsRNA施用于需要這種治療的人。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述dsRNA以約0.01、0.1、0.5、1.0、2.5或5.0mg / kg施用于人。在特別相關(guān)的實(shí)施方式中，所述dsRNA以約1.0mg / kg施用于人。在又一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，所治療的人患有運(yùn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性和/或肝臟疾病。在本發(fā)明用途的又一個(gè)實(shí)施方式中，給所治療的人進(jìn)一步提供肝臟移植。
[0026]在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供dsRNA在抑制細(xì)胞中TTR表達(dá)的方法中的用途，所述方法包括:(a)使細(xì)胞與以上簡述中描述的dsRNA接觸；和(b)將步驟(a)得到的細(xì)胞保持足以獲得TTR基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物降解的時(shí)間，從而抑制細(xì)胞中TTR基因的表達(dá)。
[0027]具體地，本發(fā)明涉及以下各項(xiàng):
[0028]1、用于抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有有義鏈和反義鏈，所述反義鏈含有與編碼運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)的mRNA的一部分互補(bǔ)的區(qū)域，其中所述互補(bǔ)區(qū)域的長度小于30個(gè)核苷酸，所述反義鏈含有SEQ ID NO:170、SEQID NO:450, SEQ ID NO:730 或 SEQ ID NO:1010 的 15 或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。
[0029]2、第 I 項(xiàng)的 dsRNA，其中所述有義鏈含有 SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO:449、SEQ IDNO:729或SEQ ID NO:1009的15或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。
[0030]3、第I項(xiàng) 的dsRNA，其中所述有義鏈由SEQ ID NO:449組成，所述反義鏈由SEQ IDNO:450 組成。
[0031]4、第I項(xiàng)的dsRNA，其中所述有義鏈由SEQ ID NO:729組成，所述反義鏈由SEQ IDNO:730 組成。
[0032]5、第I項(xiàng)的dsRNA，其中所述有義鏈由SEQ ID NO:1009組成，所述反義鏈由SEQID NO:1010 組成。
[0033]6、第I項(xiàng)的dsRNA，其中所述dsRNA含有選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的有義鏈和選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的反義鏈。
[0034]7、第I或2或6項(xiàng)的dsRNA，其中所述互補(bǔ)區(qū)域的長度是19個(gè)核苷酸。
[0035]8、第I或2或6項(xiàng)的dsRNA，其中所述互補(bǔ)區(qū)域由SEQ ID NO:169組成。
[0036]9、第I或2或6項(xiàng)的dsRNA，其中所述dsRNA的各鏈長度是19、20、21、22、23或24個(gè)核苷酸。
[0037]10、第I或2或6項(xiàng)的dsRNA，其中各鏈長度是21個(gè)核苷酸。
[0038]11、第 1、2、3、4、5或6項(xiàng)的dsRNA，其中所述dsRNA不在SEQ ID NO:1331 的位置637上的腺嘌呤核苷酸與SEQ ID NO:1331的位置638上的鳥嘌呤核苷酸之間切割TTR mRNA。
[0039]12、第 1、2、3、4、5 或 6 項(xiàng)的 dsRNA,其中所述 dsRNA 在 SEQ ID NO: 1331 的位置 636上的鳥嘌呤核苷酸與SEQ ID NO:1331的位置637上的腺嘌呤核苷酸之間切割TTR mRNA。
[0040]13、第 1、2、3、4、5 或 6 項(xiàng)的 dsRNA，其中所述 dsRNA 與 SEQ ID NO: 1331 的位置 628上的鳥嘌呤核苷酸和SEQ ID NO:1331的位置646上的尿嘧啶核苷酸之間的TTR mRNA退火。
[0041]14、第1、2、3、4、5或6項(xiàng)的dsRNA，其中所述dsRNA含有至少一個(gè)修飾核苷酸。
[0042]15、第14項(xiàng)的dsRNA，其中至少一個(gè)所述修飾核苷酸選自下組:2' -O-甲基修飾的核苷酸、含有5'-硫代磷酸基團(tuán)的核苷酸、以及與膽固醇基衍生物或十二烷酸二癸基酰胺基相連的末端核苷酸。
[0043]16、第14項(xiàng)的dsRNA，其中所述修飾核苷酸選自下組:2'-脫氧-2'-氟代修飾核苷酸、2'-脫氧-修飾核苷酸、鎖核苷酸、脫堿基核苷酸、2'-氨基-修飾核苷酸、2'-烷基-修飾核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯、和含有非天然堿基的核苷酸。[0044]17、第14項(xiàng)的dsRNA，含有至少一個(gè)W -O-甲基修飾核苷酸。
[0045]18、第1、2、3、4、5或6項(xiàng)的dsRNA，其中所述dsRNA與配體偶聯(lián)。
[0046]19、第1、2、3、4、5或6項(xiàng)的dsRNA，其中所述dsRNA配制在脂質(zhì)制劑中。
[0047]20、第19項(xiàng)的dsRNA，其中所述dsRNA配制成LNP制劑、LNPOl制劑、XTC-SNALP制劑或SNALP制劑。
[0048]21、第19項(xiàng)的dsRNA，其中所述dsRNA配制成如下XTC-SNALP制劑:以比例為57.1 / 7.1 / 34.4 / 1.4 的 XTC / DPPC / 膽固醇 / PEG-cDMA 使用 2，2- 二亞油基 _4_ 二甲基氨基乙基_[1，3]_ 二氧戊環(huán)(XTC)以及比例約為7的脂質(zhì):siRNA。
[0049]22、第19項(xiàng)的dsRNA，其中所述有義鏈由SEQ ID NO:1009組成且所述反義鏈由SEQ ID NO:1010組成，所述dsRNA配制成如下XTC-SNALP制劑:以比例為57.1 / 7.1 /34.4 / 1.4的XTC / DPPC /膽固醇/ PEG-cDMA使用2，2-二亞油基-4-二甲基氨基乙基-[I，3]-二氧戊環(huán)(XTC)以及比例約為7的脂質(zhì):siRNA。
[0050]23、第19項(xiàng)的dsRNA，其中所述dsRNA配制成如下LNP09制劑:使用比例為50 /10 / 38.5 / L5mol% 的 XTC / DSPC / 膽固醇 / PEG2000-CH 以及比例約為 11: I 的脂質(zhì):siRNA。
[0051]24、第19項(xiàng)的dsRNA，其中所述dsRNA配制成如下LNPll制劑:使用比例為50 /10 / 38.5 / 1.5mol% 的 MC3 / DSPC / 膽固醇 / PEG2000-CH 以及比例約為 11: I 的脂質(zhì):siRNA。 [0052]25、第19項(xiàng)的dsRNA，其中所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且相對(duì)于PBS對(duì)照組，在0.3mg / kg的劑量時(shí)降低TTR mRNA水平約85到90%。
[0053]26、第19項(xiàng)的dsRNA，其中所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且相對(duì)于PBS對(duì)照組，在0.1mg / kg的劑量時(shí)降低TTR mRNA水平約50%。
[0054]27、第19項(xiàng)的dsRNA，其中所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且通過蛋白質(zhì)印跡測定，相對(duì)于PBS對(duì)照組以劑量依賴性方式降低TTR蛋白水平。
[0055]28、第19項(xiàng)的dsRNA，其中所述dsRNA配制成如下SNALP制劑:以比例為57.1 /7.1 / 34.4 / 1.4 的 DLinDMA / DPPC / 膽固醇 / PEG2000-cDMA 使用 DLinDMA 以及比例約為7的脂質(zhì):siRNA。
[0056]29、第1、2、3、4、5或6項(xiàng)的dsRNA，其中施用所述dsRNA至細(xì)胞導(dǎo)致通過實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)測得的約95%的TTR mRNA表達(dá)抑制，其中所述細(xì)胞是H印G2細(xì)胞或Hep3B細(xì)胞，且其中dsRNA的濃度是ΙΟηΜ。
[0057]30、第1、2、3、4、5或6項(xiàng)的dsRNA，其中施用dsRNA至細(xì)胞導(dǎo)致通過分支DNA試驗(yàn)測得的約74%的TTR mRNA表達(dá)抑制，其中所述細(xì)胞是H印G2細(xì)胞或Hep3B細(xì)胞，且其中dsRNA的濃度是ΙΟηΜ。
[0058]31、第1、2、3、4、5或6項(xiàng)的dsRNA，其中所述dsRNA在！fepG2細(xì)胞中的IC50小于ΙΟρΜ，且其中dsRNA的濃度是ΙΟηΜ。
[0059]32、第 1、2、3、4、5 或 6 項(xiàng)的 dsRNA，其中所述 dsRNA 的 ED50 約為 Img / kg。
[0060]33、第1、2、3、4、5或6項(xiàng)的dsRNA，其中施用dsRNA降低食蟹猴肝臟中的TTR mRNA約80%,其中dsRNA的濃度是3mg / kg。
[0061]34、第1、2、3、4、5或6項(xiàng)的dsRNA，其中通過IFN-α和TNF-a ELISA試驗(yàn)測定，施用dsRNA不導(dǎo)致人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的免疫刺激活性。
[0062]35、第1、2、3、4、5或6項(xiàng)的dsRNA，其中施用dsRNA降低肝臟TTR mRNA水平約97%或血清TTR蛋白水平約90%，其中dsRNA的濃度是6mg / kg。
[0063]36、第1、2、3、4、5或6項(xiàng)的dsRNA，其中施用dsRNA降低肝臟TTR mRNA水平和/或血清TTR蛋白水平直到22天,其中dsRNA的濃度是6mg / kg或3mg / kg。
[0064]37、第1、2、3、4、5或6項(xiàng)的dsRNA,其中當(dāng)以Img / kg或3mg / kg施用于需要治療的受試者時(shí)，dsRNA抑制血清TTR蛋白水平直到治療后第14天。
[0065]38、第1、2、3、4、5或6項(xiàng)的dsRNA，其中通過實(shí)時(shí)PCR測定，濃度為0.1nM的dsRNA使!fep3B細(xì)胞中的TTR表達(dá)降低98.9%。
[0066]39、第1、2、3、4、5或6項(xiàng)的dsRNA，其中通過實(shí)時(shí)PCR測定，濃度為IOnM的dsRNA使!fep3B細(xì)胞中的TTR表達(dá)降低99.4%。
[0067]40、用于抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有有義鏈和反義鏈，所述反義鏈含有與編碼運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)的mRNA的一部分互補(bǔ)的區(qū)域，其中所述互補(bǔ)區(qū)域的長度小于30個(gè)核苷酸，且其中所述dsRNA含有選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的有義鏈和選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的反義鏈。
[0068]41、用于抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有反義鏈，所述反義鏈含有與SEQ ID NO:1331的核苷酸618-648的15-30個(gè)核苷酸互補(bǔ)的區(qū)域，且其中所 述反義鏈與SEQ ID NO:1331的位置628上的鳥嘌呤堿基配對(duì)。
[0069]42、含有第1-41項(xiàng)的dsRNA的細(xì)胞。
[0070]43、含有編碼第1-41項(xiàng)的dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列的載體。
[0071]44、含有第43項(xiàng)的載體的細(xì)胞。
[0072]45、用于抑制TTR基因表達(dá)的藥物組合物，其含有第1_41項(xiàng)的dsRNA和藥學(xué)可接受的載體。
[0073]46、用于抑制TTR基因表達(dá)的藥物組合物，其含有dsRNA和SNALP制劑，其中所述dsRNA包含長度小于30個(gè)核苷酸的反義鏈，該反義鏈包含SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:450、SEQ ID NO:730或SEQ ID NO: 1010的15或更多個(gè)連續(xù)核苷酸，且其中所述SNALP制劑包含各自比例為 57.1 / 7.1 / 34.4 / 1.4 的 DlinDMA、DPPC、膽固醇和 PEG2000_cDMA。
[0074]47、抑制細(xì)胞中TTR表達(dá)的方法，所述方法包括:
[0075](a)使細(xì)胞與第1-41項(xiàng)的dsRNA接觸；和
[0076](b)將步驟(a)得到的細(xì)胞保持足以獲得TTR基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物降解的時(shí)間，從而抑制細(xì)胞中TTR基因的表達(dá)。
[0077]48、治療由TTR表達(dá)介導(dǎo)的疾病的方法，包括將治療有效量的第1_41項(xiàng)的dsRNA施用于需要這種治療的人。
[0078]49、第 48 項(xiàng)所述的方法，其中所述 dsRNA 以約 0.01、0.1、0.5、1.0、2.5 或 5.0mg /
kg施用于人。
[0079]50、第48-49項(xiàng)的方法，其中所述dsRNA以約1.0mg / kg施用于人。
[0080]51、第48-50項(xiàng)的方法，其中所述的人患有運(yùn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性。
[0081]52、第48-51項(xiàng)的方法，其中所述的人患有肝臟疾病。
[0082]53、第48-52項(xiàng)的方法，其中所述的人還進(jìn)行肝臟移植。[0083]54、第48-53項(xiàng)的方法，其中施用dsRNA降低人肝臟的TTR mRNA約80 %，其中dsRNA的濃度是3mg / kg。
[0084]55、第48-54項(xiàng)的方法，其中通過IFN- α和TNF- a ELISA試驗(yàn)測定，施用dsRNA不會(huì)導(dǎo)致人的免疫刺激活性。
[0085]56、第48-55項(xiàng)的方法，其中施用dsRNA降低肝臟TTR mRNA水平約97%或血清TTR蛋白水平約90%，其中dsRNA的濃度是6mg / kg。
[0086]57、第48-56項(xiàng)的方法，其中施用dsRNA降低肝臟TTR mRNA水平和/或血清TTR蛋白水平直到22天,其中dsRNA的濃度是6mg / kg或3mg / kg。
[0087]58、第48-57項(xiàng)的方法，其中所述dsRNA配制成如下LNP09制劑:使用比例為50 /10 / 38.5 / L5mol% 的 XTC / DSPC / 膽固醇 / PEG2000-CH 以及比例約為 11: I 的脂質(zhì):siRNA。
[0088]59、第48-58項(xiàng)的方法，其中所述dsRNA配制成如下LNPll制劑:使用比例為50 /10 / 38.5 / 1.5mol% 的 MC3 / DSPC / 膽固醇 / PEG2000-CH 以及比例約為 11: I 的脂質(zhì):siRNA。
[0089]60、第48-59項(xiàng)的方法，其中所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且相對(duì)于PBC對(duì)照組，在 0.3mg / kg的劑量時(shí)降低TTR mRNA水平約85%到90%。
[0090]61、第48-60項(xiàng)的方法，其中所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且相對(duì)于PBC對(duì)照組，在0.1mg / kg的劑量時(shí)降低TTRmRNA水平約50%。
[0091]62、第48-61項(xiàng)的方法，其中所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且通過蛋白質(zhì)印跡測定，相對(duì)于PBC對(duì)照組，其以劑量依賴性方式降低TTR蛋白水平。
[0092]63、第48-62項(xiàng)的方法,其中當(dāng)以Img / kg或3mg / kg施用于人時(shí)，dsRNA抑制血清TTR蛋白水平直到治療后第14天。
[0093]64、第48-63項(xiàng)的方法，其中所述dsRNA配制成如下SNALP制劑:以比例為57.1 /
7.1 / 34.4 / 1.4 的 DLinDMA / DPPC / 膽固醇 / PEG2000_cDMA 使用 DLinDMA 以及比例約為7的脂質(zhì):siRNA。
[0094]65、dsRNA在治療由TTR表達(dá)介導(dǎo)的疾病中的應(yīng)用，包括將治療有效量的第1_41項(xiàng)的dsRNA施用于需要這種治療的人。
[0095]66、第 65 項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述 dsRNA 以約 0.01、0.1、0.5、1.0、2.5 或 5.0mg / kg
施用于人。
[0096]67、第65-66項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述dsRNA以約1.0mg / kg施用于人。
[0097]68、第65-67項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述的人患有運(yùn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性。
[0098]69、第65-68項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述的人患有肝臟疾病。
[0099]70、第65-69項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述人還進(jìn)行肝臟移植。
[0100]71、dsRNA在抑制細(xì)胞中TTR表達(dá)中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括:
[0101](a)使細(xì)胞與第1-41項(xiàng)的dsRNA接觸；和
[0102](b)將步驟(a)得到的細(xì)胞保持足以獲得TTR基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物降解的時(shí)間，從而抑制細(xì)胞中TTR基因的表達(dá)。
[0103]本發(fā)明的一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方式的細(xì)節(jié)在以下詳述中闡明。本發(fā)明的其他特征、目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)將從說明書、附圖和權(quán)利要求書中變得明顯?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0104]圖1是轉(zhuǎn)染TTR siRNA后，培養(yǎng)的人類PBMC中TNFa和IFNa的水平圖。
[0105]圖2A和2B分別是H印G2細(xì)胞中AD-18324和AD-18328的劑量響應(yīng)曲線。
[0106]圖3是H印G2細(xì)胞中AD-18246的劑量響應(yīng)曲線。
[0107]圖4A和圖4B分別顯示靜脈濃注施用以LNPOI配制的TTR-dsRNA (AD-18324、AD-18328 和 AD-18246)的轉(zhuǎn)基因 H129_mTTR-K0 / iN0S-K0 / hTTR 小鼠中肝臟 mRNA 和血漿蛋白質(zhì)水平的抑制。[0108]圖5是靜脈輸注以SNALP配制的TTR-dsRNA (AD-18324和AD-18328) 15分鐘后，非人靈長類動(dòng)物肝臟中的TTR mRNA水平的測定值的匯總圖。
[0109]圖6A和圖6B分別顯示靜脈濃注施用SNALP-18328的轉(zhuǎn)基因小鼠中的人V30M TTR肝臟mRNA和血清蛋白水平的抑制。測定組平均值，對(duì)PBS對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化，然后繪圖。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。顯示SNALP-1955和SNALP-18328組相對(duì)于PBS的組平均值的降低百分比。(***ρ〈ο.001,單向方差分析,具有Dunn事后檢驗(yàn))。
[0110]圖7Α和圖7Β分別顯示單次靜脈濃注施用SNALP-18328后22天內(nèi)，轉(zhuǎn)基因小鼠中的人V30M TTR肝臟mRNA和血清蛋白水平的降低持久性。測定組平均值，TTR/GAPDHmRNA水平對(duì)第O天的水平標(biāo)準(zhǔn)化并繪圖。計(jì)算并顯示SNALP-18328組在各時(shí)間點(diǎn)相對(duì)于SNALP-1955的標(biāo)準(zhǔn)化TTR mRNA水平的降低百分比。(#*p〈0.001，單向方差分析，具有Dunn事后檢驗(yàn))。
[0111]圖8顯示單次15分鐘靜脈輸注SNALP-18328后的14天內(nèi)，非人靈長類動(dòng)物中TTR血清蛋白水平的時(shí)間進(jìn)程。
[0112]圖9顯示靜脈濃注施用SNALP-18328后，人V30M TTR / HSF-1敲除小鼠的多種組織中的TTR-免疫反應(yīng)性的降低。E，食道；S，胃；11，腸/十二指腸；14，腸/結(jié)腸；N，神經(jīng)；D，背根神經(jīng)節(jié)。
[0113]圖10顯示15分鐘靜脈輸注XTC-SNALP-18328后，非人靈長類動(dòng)物肝臟中TTRmRNA水平的測定值。
[0114]圖1lA和IlB分別顯示15分鐘靜脈輸注LNP09-18328或LNPl 1-18328后，非人靈長類動(dòng)物肝臟中TTR mRNA和血清蛋白水平的測定值。圖1IC顯示15分鐘靜脈輸注0.3mg /kg LNP09-18328后的28天內(nèi)TTR血清蛋白水平較之PBS對(duì)照組的時(shí)間進(jìn)程。
[0115]圖12 顯示人 TTR mRNA (參考 Seq.ΝΜ_000371.3，SEQ ID NO:1331)的序列。
[0116]圖13A和13B分別是人類和大鼠TTR mRNA的序列。圖13A是人類TTR mRNA (參考 Seq.ΝΜ_000371.2，SEQ ID NO:1329)的序列。圖 13B 是大鼠 TTR mRNA(參考 Seq.NM_012681.1，SEQ ID NO:1330)的序列。
[0117]圖14顯示匪_000371.3、匪_000371.2和六0-18328的核苷酸比對(duì)。
[0118]圖15說明與家族性淀粉樣變性神經(jīng)病、家族性淀粉樣變性心肌病和CNS淀粉樣變性有關(guān)的TTR癥狀和突變。
[0119]圖16顯示用SNALP-18534進(jìn)行不同輸注時(shí)間的肝臟中TTR mRNA水平的降低。各組動(dòng)物(η = 4 /組)經(jīng)過15分鐘或1、2、或3小時(shí)輸注，施用Img / kg的SNALP-18534。48小時(shí)后，處死大鼠并獲得肝臟。使用Quantigene bDNA試驗(yàn)從肝臟溶解產(chǎn)物中測定TTR和GAPDH mRNA水平。計(jì)算各動(dòng)物的TTR比GAPDH mRNA水平的比例。測定組平均值并對(duì)PBS對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化，然后繪圖。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。(***p〈0.001，單向方差分析，具有Bonferroni事后檢驗(yàn),相對(duì)于PBS)。
[0120]圖17顯示15分鐘靜脈輸注LNP07-18534或LNP08-18534后大鼠肝臟中TTR mRNA水平的測定值。
[0121]圖18 顯示 15 分鐘靜脈輸注 LNP09-18534 或 LNPl 1-18534 后，Sprague-Dawley 大鼠肝臟中內(nèi)源TTR mRNA水平的體內(nèi)抑制。各組動(dòng)物(n=4 /組)經(jīng)過15分鐘輸注靜脈施用0.01、0.03、0.I 或 0.3mg / kg 的 LNP09-18534、LNP-11-18534 ;或 PBS。48 小時(shí)后，處死動(dòng)物并獲得肝臟。使用Quantigene bDNA試驗(yàn)從肝臟活檢組織溶解產(chǎn)物中測定TTR和GAPDHmRNA水平。計(jì)算各動(dòng)物的TTR比GAPDH mRNA水平的比例。測定組平均值并對(duì)PBS對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化，然后繪圖。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0122]發(fā)明詳述
[0123]本發(fā)明提供dsRNA和利用dsRNA抑制細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中TTR基因表達(dá)的方法，其中dsRNA靶向TTR基因。本發(fā)明也提供用于治療哺乳動(dòng)物中由TTR基因表達(dá)所引起的病理學(xué)病癥和疾病例 如TTR淀粉樣變性的組合物和方法。dsRNA通過稱為RNA干擾(RNAi)的過程引導(dǎo)mRNA的序列特異性降解。
[0124]本發(fā)明組合物的dsRNA包括RNA鏈(反義鏈)，其具有長度小于30個(gè)核苷酸、通常長度為19-24個(gè)核苷酸的區(qū)域，且該區(qū)域和TTR基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分基本上互補(bǔ)。使用這些dsRNA使得涉及與哺乳動(dòng)物中TTR表達(dá)有關(guān)的病理學(xué)的基因的mRNA的靶向降解成為可能。極低劑量的TTR dsRNA特別可以特異且有效地介導(dǎo)RNAi，導(dǎo)致TTR基因表達(dá)的顯著抑制。使用基于細(xì)胞的試驗(yàn)，本發(fā)明人證明靶向TTR的dsRNA可以特異且有效地介導(dǎo)RNAi，導(dǎo)致TTR基因表達(dá)的顯著抑制。因此，含有這些dsRNA的方法和組合物可用于治療可由下調(diào)TTR介導(dǎo)的病理過程，例如治療肝臟疾病或TTR淀粉樣變性，例如FAP。
[0125]含有TTR dsRNA的方法和組合物可用于治療由TTR表達(dá)介導(dǎo)的病理過程，例如TTR淀粉樣變性。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療由TTR表達(dá)介導(dǎo)的疾病的方法包括將治療有效量的靶向TTR的dsRNA施用于需要這種治療的人。在一個(gè)實(shí)施方式中，dsRNA以約0.01、0.1,0.5、1.0、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25mg / kg施用于人。
[0126]以下詳細(xì)說明公開了如何制備并使用包含dsRNA的組合物抑制TTR基因表達(dá)，以及用于治療由該基因表達(dá)所引起的疾病和病癥的組合物和方法。本發(fā)明的藥物組合物包含具有反義鏈的dsRNA和藥學(xué)可接受的載體，所述反義鏈含有長度小于30個(gè)核苷酸、通常長度為19-24個(gè)核苷酸的互補(bǔ)區(qū)域，且該區(qū)域和TTR基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分基本上互補(bǔ)。本發(fā)明的組合物也包含具有反義鏈的dsRNA，所述反義鏈含有長度小于30個(gè)核苷酸、通常長度為19-24個(gè)核苷酸的互補(bǔ)區(qū)域，且該區(qū)域和TTR基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分基本上互補(bǔ)。
[0127]dsRNA 的有義鏈可以包括 SEQ ID NO: 169,SEQ ID NO:449、SEQ ID NO:729 或 SEQID NO:1009的15、16、17、18、19、20、21或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。dsRNA的反義鏈可以包括SEQID NO:170,SEQ ID NO:450、SEQ ID NO:730 或 SEQ ID NO:1010 的 15、16、17、18、19、20、21或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，dsRNA的有義鏈可由SEQ ID NO:449或其片段組成，反義鏈可以由SEQ ID NO:450或其片段組成。在一個(gè)實(shí)施方式中，dsRNA的有義鏈可由SEQ ID NO:729或其片段組成，反義鏈可以由SEQ ID NO:730或其片段組成。在一個(gè)實(shí)施方式中，dsRNA的有義鏈可由SEQ ID NO:1009或其片段組成，反義鏈可以由SEQ ID NO:1010或其片段組成。
[0128]在一個(gè)實(shí)施方式中，dsRNA可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)修飾核
苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，修飾核苷酸可包括2' -O-甲基修飾核苷酸、含有5'-硫代磷酸基團(tuán)的核苷酸、和/或與膽固醇基衍生物或十二烷酸二癸基酰胺基相連的末端核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，修飾核苷酸可包括W -脫氧-2'-氟代修飾核苷酸、2'-脫氧-修飾核苷酸、鎖核苷酸、脫堿基核苷酸、2'-氨基-修飾核苷酸、2'-烷基-修飾核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯、和/或含有非天然堿基的核苷酸。
[0129]在一個(gè)實(shí)施方式中，dsRNA的互補(bǔ)區(qū)域的長度至少為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或更多個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，互補(bǔ)區(qū)域包括SEQ ID NO:169的10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。
[0130]在一個(gè)實(shí)施方式中，dsRNA的各鏈長度為 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，dsRNA包含選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的有義鏈，或其10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個(gè)核苷酸片段，和選自表3A、3B、4、6A、6B、7 和 16 的反義鏈，或其 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或 21 個(gè)核苷
酸片段。
[0131]在一個(gè)實(shí)施方式 中，由實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)測定，dsRNA施用于細(xì)胞導(dǎo)致約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或以上的 TTR mRNA 表達(dá)的抑制。在一個(gè)實(shí)施方式中，由實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)測定，dsRNA施用于細(xì)胞導(dǎo)致約40 %到45 %、45 %到50 %、50% 到 55%、55% 到 60%、60% 到 65%、65% 到 70%、70% 到 75%、75% 到 80%、80% 到85%、85%到90%、90%到95%或以上的111? mRNA表達(dá)的抑制。在一個(gè)實(shí)施方式中，由分支 DNA 試驗(yàn)測定，dsRNA 施用于細(xì)胞導(dǎo)致約 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或以上的TTR mRNA表達(dá)的抑制。在一個(gè)實(shí)施方式中，由分支DNA試驗(yàn)測定，dsRNA施用于細(xì)胞導(dǎo)致約40%到45%、45%到50%、50%到55%、55%到60%、60%到65%,65%IlJ 70%、70%到 75%、75%到 80%、80%到 85%、85%到 90%、90%到 95%或以上的TTR mRNA表達(dá)的抑制。
[0132]在一個(gè)實(shí)施方式中，dsRNA的 IC50 小于 0.01ρΜ、0.ΙρΜ、1ρΜ、5ρΜ、ΙΟρΜ、IOOpM 或ΙΟΟΟρΜ。在一個(gè)實(shí)施方式中，dsRNA 的 ED50 約為 0.01、0.1、1、5 或 IOmg / kg。
[0133]在一個(gè)實(shí)施方式中，施用dsRNA可以降低食蟹猴中的TTR mRNA約40 %、45 %、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或以上。在一個(gè)實(shí)施方式中，施用 dsRNA可以降低肝臟 TTR mRNA 水平約 40% ,45% ,50% ,55% ,60% ,65% ,70% ,75% ,80% ,90%,95% 或以上，或血清 TTR 蛋白水平約 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或以上。在一個(gè)實(shí)施方式中，施用dsRNA降低肝臟TTR mRNA水平和/或血清TTR蛋白水平直到 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多天。
[0134]在一個(gè)實(shí)施方式中，dsRNA配制成 LNP 制劑并在 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7、
0.8、0.9或Img / kg劑量下相對(duì)于PBC對(duì)照組降低TTR mRNA水平約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或以上。在一個(gè)實(shí)施方式中，dsRNA配制成LNP制劑并通過蛋白質(zhì)印跡測得相對(duì)于PBC對(duì)照組降低TTR蛋白水平約40 %、45 %、50 %、55 %、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或以上。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)施用于需要治療的受試者時(shí)，dsRNA 在 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25mg / kg的劑量下抑制血清TTR蛋白水平直到治療后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25 天。
[0135]因此，在一些方面，含有TTR dsRNA和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物、使用該組合物抑制TTR基因表達(dá)的方法和使用該藥物組合物治療由TTR基因表達(dá)引起的疾病的方法是本發(fā)明的特征。
[0136]1.定義
[0137]為方便起見，下文 提供用于說明書、實(shí)施例和權(quán)利要求書中的某些術(shù)語和短語的意思。如果本說明書其他部分中術(shù)語的用法和本節(jié)提供的定義有著明顯的差異，采用本節(jié)的定義。
[0138]通常"G"、" C"、" A"和"U"各自代表分別含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作為堿基的核苷酸。“T”和“dT”在本文中可互換使用，指的是核堿基是胸腺嘧啶的脫氧核糖核苷酸，例如脫氧核糖胸腺嘧啶。然而，應(yīng)理解術(shù)語“核糖核苷酸”或“核苷酸”或“脫氧核糖核苷酸”也可指下文進(jìn)一步詳述的修飾核苷酸，或取代替換部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可被其他部分取代，而基本上不改變含有攜帶這種替換部分的核苷酸的寡核苷酸的堿基配對(duì)性質(zhì)。例如但不限于，含有次黃嘌呤核苷作為其堿基的核苷酸可以和含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸堿基配對(duì)。因此，本發(fā)明核苷酸序列中含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被含有例如次黃嘌呤核苷的核苷酸替換。含有這種替換部分的序列是本發(fā)明的實(shí)施方式。
[0139]如本文所使用，“運(yùn)甲狀腺素蛋白”(“TTR”)指的是細(xì)胞中的基因。TTR又名ATTR、HsT2651、PALB、前清蛋白、TBPA和運(yùn)甲狀腺素蛋白(前清蛋白，淀粉樣變性類型I)。人TTRmRNA轉(zhuǎn)錄物的序列可在NM_000371中發(fā)現(xiàn)。小鼠TTR mRNA序列可在NM_013697.2中發(fā)現(xiàn)，大鼠TTR mRNA的序列可在NM_012681.1中發(fā)現(xiàn)。
[0140]如本文所使用，“目標(biāo)序列”指的是在TTR基因的轉(zhuǎn)錄期間形成的mRNA分子的核苷酸序列的連續(xù)部分，包括為初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA加工產(chǎn)物的mRNA。
[0141]如本文所使用，術(shù)語“含有序列的鏈”指的是含有由相當(dāng)于使用標(biāo)準(zhǔn)核苷酸命名法描述的序列的核苷酸鏈的寡核苷酸。
[0142]如本文所使用，除非另有陳述，術(shù)語“互補(bǔ)”當(dāng)用于相對(duì)于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列時(shí)，指的是含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定條件下和含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交并形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。這種條件例如可以是嚴(yán)格條件，其中嚴(yán)格條件可以包括:400mM NaCl,40mM PIPESpH6.4，ImM EDTA，50°C或70°C放置12-16小時(shí)，然后清洗。可以應(yīng)用其他條件，例如有機(jī)體內(nèi)可能遇到的生理學(xué)相關(guān)條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能根據(jù)雜交核苷酸的最終應(yīng)用決定最適合于兩個(gè)序列的互補(bǔ)性測試的這套條件。
[0143]這包括在第一和第二核苷酸序列的整個(gè)長度上使含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸和含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸堿基配對(duì)。這樣的序列在此可以稱為相對(duì)于彼此“完全互補(bǔ)”。然而，當(dāng)?shù)谝恍蛄性诖朔Q為相對(duì)于第二序列“基本上互補(bǔ)”時(shí)，兩個(gè)序列可以完全互補(bǔ)，或它們在雜交時(shí)可以形成一個(gè)或多個(gè)，但通常不超過4、3或2個(gè)錯(cuò)配堿基對(duì)，而保持在與它們的最終應(yīng)用最相關(guān)的條件下雜交的能力。然而，當(dāng)兩個(gè)寡核苷酸設(shè)計(jì)成在雜交時(shí)形成一個(gè)或多個(gè)單鏈突出端時(shí)，這樣的突出端時(shí)將不會(huì)被認(rèn)為是關(guān)于互補(bǔ)性測定的錯(cuò)配。例如，一種dsRNA含有一個(gè)長度為21個(gè)核苷酸的寡核苷酸和另一個(gè)長度為23個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其中較長的寡核苷酸包含與較短的寡核苷酸完全互補(bǔ)的21個(gè)核苷酸序列，則基于本文描述的目的，該dsRNA仍然可以稱為“完全互補(bǔ)”。
[0144]本文使用的“互補(bǔ)”序列也可以包括，或完全由以下堿基對(duì)形成:非-Watson-Crick堿基對(duì)和/或由非天然和修飾核苷酸形成的堿基對(duì),只要滿足上述關(guān)于其雜交能力的要求。這種非-Watson-Crick堿基對(duì)包括但不限于:G:U擺動(dòng)(Wobble)或Hoogstein喊基配對(duì)。
[0145]本文的術(shù)語“互補(bǔ)”、“完全互補(bǔ)”和“基本上互補(bǔ)”可相對(duì)于dsRNA的有義鏈和反義鏈之間，或dsRNA的反義鏈和目標(biāo)序列之間的堿基配對(duì)使用，如將從其使用的上下文理解。
[0146]如本文所使用，與信使RNA(mRNA) “的至少一部分基本上互補(bǔ)”的多核苷酸指的是與包括5，UTR、開放閱讀框(ORF)或3' UTR的目標(biāo)mRNA (例如，編碼TTR的mRNA)的連續(xù)部分基本上互補(bǔ)的多核苷酸。例如，如果該序列與編碼TTR的mRNA的非中斷部分基本上互補(bǔ)，則多核苷酸和TTR mRNA的至少一部分互補(bǔ)。
[0147]本文使用的術(shù)語“雙鏈RNA”或“dsRNA”指的是核糖核酸分子復(fù)合物，其具有含有兩個(gè)反平行的并如上定義基 本上互補(bǔ)的核酸鏈的雙鏈結(jié)構(gòu)。通常，各鏈的大多數(shù)核苷酸是核糖核苷酸，但如本文詳細(xì)描述，每一條鏈或者兩條鏈也可以包括至少一個(gè)非核糖核苷酸，例如，脫氧核糖核苷酸和/或修飾核苷酸。另外，如說明書中所使用，“dsRNA”可以包括對(duì)核苷酸的化學(xué)修飾，包括多個(gè)核苷酸的實(shí)質(zhì)性修飾并包括本文公開或現(xiàn)有技術(shù)已知的所有類型的修飾。為本說明書和權(quán)利要求書的目的，“dsRNA”包括任何這樣的修飾，如siRNA型分子中使用的。
[0148]形成雙鏈結(jié)構(gòu)的兩條鏈可以是一條較大的RNA分子的不同部分，或它們可以是分離的RNA分子。當(dāng)這兩條鏈?zhǔn)且粭l較大分子的一部分，且因此通過形成雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈的3'端和相應(yīng)另一條鏈的5’端之間的核苷酸的連續(xù)鏈相連時(shí)，連接的RNA鏈稱為“發(fā)夾環(huán)”。當(dāng)這兩條鏈通過不同于形成雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈的3'端和相應(yīng)另一鏈的5’端之間的核苷酸的連續(xù)鏈的手段共價(jià)相連時(shí)，該連接結(jié)構(gòu)稱為“連接子”。該RNA鏈可以具有相同或不同數(shù)目的核苷酸。堿基對(duì)的最大數(shù)目是dsRNA的最短鏈的核苷酸數(shù)減去存在于雙鏈體中的任何突出端。除雙鏈結(jié)構(gòu)之外，dsRNA還可以包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸突出端。術(shù)語“siRNA”在本文中也用于指上述的dsRNA。
[0149]如本文所使用，當(dāng)dsRNA的一條鏈的:V端延伸超過另一條鏈的Y端時(shí)，或反之亦然，“核苷酸突出端”指的是未配對(duì)的核苷酸或從dsRNA的雙鏈結(jié)構(gòu)中突出的核苷酸?！捌降摹被颉捌蕉恕敝傅氖莇sRNA的這一端沒有未配對(duì)的核苷酸，即，沒有核苷酸突出端。“平端” dsRNA是在其全長上為雙鏈的dsRNA，即，在分子的任一端沒有核苷酸突出端。
[0150]術(shù)語“反義鏈”指的是包括與目標(biāo)序列基本上互補(bǔ)的區(qū)域的dsRNA鏈。如本文所使用，術(shù)語“互補(bǔ)區(qū)域”指的是與一個(gè)序列，例如本文定義的目標(biāo)序列，基本上互補(bǔ)的反義鏈上的區(qū)域。當(dāng)互補(bǔ)區(qū)域不與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)時(shí)，末端區(qū)域最能容忍錯(cuò)配，如果存在，錯(cuò)配通常在末端區(qū)域或，例如在Y和/或:V端的6、5、4、3或2個(gè)核苷酸內(nèi)。
[0151]本文所使用的術(shù)語“有義鏈”指的是含有與反義鏈區(qū)域基本上互補(bǔ)的區(qū)域的dsRNA鏈。
[0152]如本文所使用，術(shù)語“SNALP”指的是穩(wěn)定的核酸-脂質(zhì)顆粒。SNALP代表包有減少的含水內(nèi)部的脂質(zhì)囊泡，所述含水內(nèi)部含有核酸例如dsRNA或dsRNA由此轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒。SNALP例如描述在美國專利申請公布說明書Nos.20060240093、20070135372和2008年4月15日提交的USSN61 / 045,228。這些申請以引用方式合并于此。
[0153]當(dāng)指dsRNA時(shí)，“引入細(xì)胞內(nèi)”意思是促進(jìn)攝入或者吸收到細(xì)胞內(nèi)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的。dsRNA的吸收或攝入可通過未受幫助的擴(kuò)散或主動(dòng)細(xì)胞代謝過程發(fā)生，或通過助劑或裝置發(fā)生。該術(shù)語的意思不限于體外細(xì)胞，也可以將dsRNA“引入細(xì)胞內(nèi)”，其中該細(xì)胞是活的有機(jī)體的部分。在這種情況下，引入細(xì)胞內(nèi)將包括遞送到有機(jī)體。例如，對(duì)于體內(nèi)遞送，可將dsRNA注入組織部位或全身施用。體外引入細(xì)胞內(nèi)包括本領(lǐng)域已知方法,例如電穿孔法和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法。其他方法在本文描述或是本領(lǐng)域已知的。
[0154]當(dāng)涉及TTR基因時(shí)，本文的術(shù)語“沉默”、“抑制表達(dá)”、“下調(diào)表達(dá)”、“抑制表達(dá)”等指的是TTR基因表達(dá)的至少部分抑制，表現(xiàn)為可以從第一細(xì)胞或細(xì)胞群中分離的mRNA的量相對(duì)于第二細(xì)胞或細(xì)胞群的減少，所述第一細(xì)胞或細(xì)胞群中TTR基因被轉(zhuǎn)錄，并且已經(jīng)經(jīng)過處理，以致TTR基因的表達(dá)被抑制，所述第二細(xì)胞或細(xì)胞群與第一細(xì)胞或細(xì)胞群基本上相同，但其沒有經(jīng)過如此處理(對(duì)照細(xì)胞)。抑制程度通常用以下公式表示:
[0155]
(對(duì)照細(xì)胞中的m—)-(處理細(xì)胞中的.100%
(對(duì)照細(xì)胞中的°
[0156]或者，抑制程度可以根據(jù)與TTR基因表達(dá)功能相關(guān)的參數(shù)的降低給出，例如，所述參數(shù)是由細(xì)胞分泌的TT R基因編碼的蛋白質(zhì)的量，或顯示某種表型例如細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的數(shù)目。原則上，TTR基因沉默可在組成型地或通過基因工程表達(dá)靶標(biāo)的任何細(xì)胞中通過任何適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)來確定。然而，當(dāng)需要參考以確定給定的dsRNA是否以某種程度抑制TTR基因的表達(dá)，且因此包括在本發(fā)明中時(shí)，以下實(shí)施例提供的試驗(yàn)將作為這樣的參考。
[0157]例如，在某些情況下，通過施用本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸抑制TTR基因的表達(dá)至少約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或 50%。在一些實(shí)施方式中，通過施用本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸抑制TTR基因至少約60%、70%或80%。在一些實(shí)施方式中，通過施用本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸抑制TTR基因至少約85 %、90%或95 %。
[0158]如TTR表達(dá)的上下文所使用，術(shù)語“治療”等指的是緩解或減輕由TTR表達(dá)介導(dǎo)的病理過程。在本發(fā)明上下文范圍內(nèi)，它涉及下文記載的任何其他病癥(除了由TTR表達(dá)介導(dǎo)的病理過程)，術(shù)語“治療”等指的是緩解或減輕與這種病癥有關(guān)的至少一種癥狀，或延緩或逆轉(zhuǎn)這種病癥的進(jìn)展，例如延緩TTR淀粉樣變性例如FAP的進(jìn)展。TTR淀粉樣變性的癥狀包括感官神經(jīng)病(例如遠(yuǎn)肢感覺異常、感覺減退)、自主神經(jīng)病(例如，胃腸功能失調(diào)，如胃潰瘍，或體位性低血壓)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病、癲癇發(fā)作、癡呆、脊髓病、多神經(jīng)病、腕管綜合征、自主缺陷、心肌病、玻璃體混池、腎功能不全、腎病、mBMI實(shí)質(zhì)降低(體重指數(shù)改變)、腦神經(jīng)機(jī)能障礙和格子狀角膜營養(yǎng)不良。
[0159]如本文所使用，短語“治療有效量”和“預(yù)防有效量”指的是在治療、預(yù)防或控制由TTR表達(dá)介導(dǎo)的病理過程或由TTR表達(dá)介導(dǎo)的病理過程的明顯癥狀中提供治療學(xué)效益的量。治療有效的具體量可由普通開業(yè)醫(yī)生容易地確定，并可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的因素而改變，所述因素例如由TTR表達(dá)介導(dǎo)的病理過程的種類、病人的病史和年齡、由TTR表達(dá)介導(dǎo)的病理過程的階段，以及由TTR表達(dá)試劑介導(dǎo)的其他抗病理過程的施用。
[0160]如本文所使用，“藥物組合物”包含藥理學(xué)有效量的dsRNA和藥學(xué)可接受的載體。如本文所使用，“藥理學(xué)有效量”、“治療有效量”或僅“有效量”指的是有效產(chǎn)生預(yù)定藥理學(xué)、治療學(xué)或預(yù)防結(jié)果的RNA的量。例如，如果與疾病或病癥有關(guān)的可測定參數(shù)有至少25%的降低，給定的臨床治療被認(rèn)為是有效的，那么治療該疾病或病癥的藥物治療有效量是導(dǎo)致那些參數(shù)減少至少25%所需的量。例如，靶向TTR的dsRNA的治療有效量可以降低TTR血清水平至少25%。在另一個(gè)例子中，靶向TTR的dsRNA的治療有效量可以改善肝功能或腎功能至少25%。
[0161]術(shù)語“藥學(xué)可接受的載體”指的是用于施用治療劑的載體。這種載體包括但不限于:鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其組合。該術(shù)語特別排除細(xì)胞培養(yǎng)基。對(duì)于口服施用，藥學(xué)可接受的載體包括但不限于:藥學(xué)可接受的賦形劑例如惰性稀釋劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑。適當(dāng)?shù)亩栊韵♂寗┌ㄌ妓徕c和碳酸鈣、磷酸鈉和磷酸鈣、和乳糖，而玉米淀粉和藻酸是適當(dāng)?shù)谋澜鈩?。粘合劑可以包括淀粉和凝膠，而潤滑劑，如果存在，通常是硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。如果需要，藥片可以包衣有一種材料例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，以延緩胃腸道中的吸收。
[0162]如本文所使 用，“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”是已引入可表達(dá)dsRNA分子的載體的細(xì)胞。
[0163]I1.雙鏈核糖核酸(dsRNA)
[0164]如本文更詳細(xì)的描述，本發(fā)明提供用于抑制細(xì)胞中或哺乳動(dòng)物例如患有TTR淀粉樣變性的人的TTR基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含反義鏈，該反義鏈具有與TTR基因表達(dá)中形成的mRNA的至少一部分互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)域，且其中所述互補(bǔ)區(qū)域的長度小于30個(gè)核苷酸，通常長度為19-24個(gè)核苷酸，且其中當(dāng)與表達(dá)所述TTR基因的細(xì)胞接觸時(shí)，通過例如PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法測定，或通過基于蛋白質(zhì)的方法例如蛋白質(zhì)印跡法測定，所述dsRNA抑制所述TTR基因的表達(dá)至少30%。當(dāng)通過以下實(shí)施例描述的試驗(yàn)測定時(shí)，TTR基因的表達(dá)可以降低至少30%。例如，細(xì)胞培養(yǎng)物(例如H印3B細(xì)胞)中TTR基因的表達(dá)可以通過測定TTRmRNA水平(例如通過bDNA或TaqMan試驗(yàn))或通過測定蛋白水平(例如通過ELISA試驗(yàn))來測定。本發(fā)明dsRNA還可以包括一個(gè)或多個(gè)單鏈核苷酸突出端。
[0165]所述dsRNA可以通過本領(lǐng)域已知以及下文進(jìn)一步討論的標(biāo)準(zhǔn)方法來合成，例如，通過利用例如可從例如Biosearch、Applied Biosystems公司買到的自動(dòng)化DNA合成儀合成。所述dsRNA包含充分互補(bǔ)從而能夠雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)的兩條RNA鏈。所述dsRNA的一條鏈(反義鏈)包含與由TTR基因表達(dá)期間形成的mRNA序列得到的目標(biāo)序列基本上互補(bǔ)、通常完全互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)域，另一條鏈(有義鏈)包含與反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，這樣當(dāng)在適宜條件下結(jié)合時(shí)，兩條鏈雜交并形成雙鏈結(jié)構(gòu)。通常，雙鏈結(jié)構(gòu)的長度為15到30或25到30、或18到25、或19到24、或19到21、或19、20、或21個(gè)堿基對(duì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該雙鏈體的長度是19個(gè)堿基對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該雙鏈體的長度是21個(gè)堿基對(duì)。當(dāng)兩個(gè)不同的siRNA結(jié)合使用時(shí)，雙鏈體的長度可以相同或可以不同。[0166]本發(fā)明的dsRNA的各鏈長度通常為15到30、或18到25、或18、19、20、21、22、23、
24或25個(gè)核苷酸。在其他實(shí)施方式中，各鏈長度為25-30個(gè)核苷酸。所述雙鏈體的各鏈長度可以相同或不同。當(dāng)兩個(gè)不同的siRNA結(jié)合使用時(shí)，各siRNA的各鏈長度可以相同或可以不同。
[0167]本發(fā)明dsRNA可以包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的一個(gè)或多個(gè)單鏈突出端。在一個(gè)實(shí)施方式中，dsRNA的至少一端具有I到4個(gè)、通常I或2個(gè)核苷酸的單鏈核苷酸突出端。在另一個(gè)實(shí)施方式中，dsRNA的反義鏈在3’端和5’端各具有超出有義鏈的1-10個(gè)核苷酸的突出端。在另一個(gè)實(shí)施方式中，dsRNA的有義鏈在3’端和5’端各具有超出反義鏈的1-10個(gè)核苷酸的突出端。
[0168]具有至少一個(gè)核苷酸突出端的dsRNA比平端對(duì)應(yīng)物具有意外的更好的抑制性質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，僅一個(gè)核苷酸突出端的存在加強(qiáng)dsRNA的干擾活性，而不影響它的總穩(wěn)定性。已經(jīng)證實(shí)只具有一個(gè)突出端的dsRNA在體內(nèi)以及各種細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)基、血和血清中特別穩(wěn)定和有效。通常，單鏈突出端位于反義鏈的3,端，或者，在有義鏈的3,端。所述dsRNA也可以具有平端，通常位于反義鏈的5’端。這種dsRNA可具有提高的穩(wěn)定性和抑制活性，因此允許以低劑量施用，即，小于每天5mg / kg接受者體重。通常，dsRNA的反義鏈在3’端具有核苷酸突出端，且5’端為平端。在另一個(gè)實(shí)施方式中，突出端中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸用核苷硫代磷酸替換。[0169]在一個(gè)實(shí)施方式中，TTR基因是人TTR基因。在具體的實(shí)施方式中，dsRNA的有義鏈?zhǔn)沁x自表3A、3B、4、6A、6B或7的有義序列之一，以及反義鏈?zhǔn)沁x自表3A、3B、4、6A、6B或7的反義序列之一。靶向表3A、3B、4、6A、6B或7提供的目標(biāo)序列中的其它地方的替代反義試劑可以通過使用目標(biāo)序列和側(cè)翼TTR序列容易地確定。
[0170]技術(shù)人員很了解具有20到23個(gè)、特別是21個(gè)堿基對(duì)的雙鏈結(jié)構(gòu)的dsRNA在誘導(dǎo)RNA干擾中特別有效(Elbashir等，EMB02001，20:6877-6888)。然而，其他人發(fā)現(xiàn)較短或較長的dsRNA也是有效的。在上述實(shí)施方式中，依靠表3A、3B、4、6A、6B或7提供的寡核苷酸序列的性質(zhì)，本發(fā)明的dsRNA可以包含至少一條具有本文描述的長度的鏈。可以合理預(yù)期，具有表3A、3B、4、6A、6B或7的一個(gè)序列、僅在一端或兩端減去幾個(gè)核苷酸的較短dsRNA較之上述的dsRNA可能有著相似的效果。因此，本發(fā)明可以預(yù)期這樣的dsRNA:它含有表3、4、6或7的一個(gè)序列的至少15、16、17、18、19、20或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的部分序列，并且在以下所述試驗(yàn)中抑制TTR基因表達(dá)的能力較之含有完整序列的dsRNA相差不超過5、10、15、20、25或30%抑制。另外，在所需TTR目標(biāo)序列中切割的dsRNA可以通過使用相應(yīng)的TTR反義序列和互補(bǔ)的有義序列容易地制備。
[0171 ] 另外，表3A、3B、4、6A、6B或7提供的dsRNA識(shí)別TTR中對(duì)RNAi基切割敏感的位點(diǎn)。同樣地，本發(fā)明的特征還在于靶向由本發(fā)明的一種試劑靶向的序列內(nèi)的dsRNA。如本文所使用，如果第二 dsRNA切割與第一 dsRNA的反義鏈互補(bǔ)的mRNA內(nèi)無論何處的信使，則稱該第二 dsRNA靶向第一 dsRNA序列內(nèi)。這種第二 dsRNA通常由表3A、3B、4、6A、6B或7中提供的一個(gè)序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸組成，所述序列與取自與TTR基因中選定序列相鄰的區(qū)域的其他核苷酸序列偶聯(lián)。
[0172] 本發(fā)明的dsRNA可以包含與目標(biāo)序列的一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的dsRNA包含不超過3個(gè)錯(cuò)配。如果dsRNA的反義鏈包含與目標(biāo)序列的錯(cuò)配，優(yōu)選錯(cuò)配區(qū)域不位于互補(bǔ)區(qū)域的中心。如果dsRNA的反義鏈包含與目標(biāo)序列的錯(cuò)配，優(yōu)選錯(cuò)配限于距任一末端的5個(gè)核苷酸,例如距互補(bǔ)區(qū)域的5’或3’端的5、4、3、2或I個(gè)核苷酸。例如，對(duì)于與TTR基因區(qū)域互補(bǔ)的23個(gè)核苷酸的dsRNA鏈，通常dsRNA在中心的13個(gè)核苷酸中不包含任何錯(cuò)配。本發(fā)明描述的方法可用于確定包含與目標(biāo)序列的錯(cuò)配的dsRNA在抑制TTR基因的表達(dá)中是否有效?？紤]具有錯(cuò)配的dsRNA在抑制TTR基因表達(dá)中的效果是重要的，特別是如果已知TTR基因的特定互補(bǔ)區(qū)域在種群內(nèi)具有多態(tài)性序列變異。
[0173]修飾
[0174]另一個(gè)實(shí)施方式中，化學(xué)修飾dsRNA以提高穩(wěn)定性。本發(fā)明核酸可以通過本領(lǐng)域良好建立的方法合成和/或修飾，例如“Current protocols in nucleic acidchemistry, ^Beaucage, S.L.等(Eds.), John ffiley&Sons, Inc.,New York, NY, USA 中所描述的那些，其以引用方式合并于此。用于本發(fā)明的dsRNA化合物的具體例子包括含有修飾骨架或不含天然核苷間鍵的dsRNA。如本說明書所定義，具有修飾骨架的dsRNA包括在骨架中保持有磷原子的dsRNA以及在骨架中不含有磷原子的dsRNA。為本說明書目的，以及如現(xiàn)有技術(shù)中有時(shí)提到的，其核苷間骨架中不含有磷原子的修飾dsRNA也被認(rèn)為是寡核苷酸。
[0175]修飾的dsRNA骨架例如包括硫代磷酸、手性硫代磷酸、二硫代磷酸、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基及其他烷基磷酸酯，包括3'-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亞膦酸酯、氨基磷酸酯，包括3 '-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和具有正常3' -5'鍵、2' -5'連接類似物的硼磷酸酯，以及具有反極性的那些，其中相鄰的核苷單元對(duì)是3' -5'到5' -3'或2' -5'到5' -2'連接。也包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。
[0176]教導(dǎo)制備上述含磷鍵的制備的典型美國專利包括但不限于美國專利Nos.3，687，808 ;4，469，8 63 ;4，476，301 ;5，023，243 ;5，177，195 ;5，188，897 ;5，264，423 ；5，276，019 ;5，278，302 ;5，286，717 ;5，321，131 ;5，399，676 ;5，405，939 ;5，453，496 ；5，455，233 ;5，466，677 ;5，476，925 ;5，519，126 ;5，536，821 ;5，541，316 ;5，550，111 ；5，563，253 ;5，571，799 ;5，587，361 ;和 5，625，050，各專利以引用方式合并于此。
[0177]其中不含有磷原子的修飾dsRNA骨架具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵形成的骨架。這些包含具有嗎啉代鍵的骨架(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物，亞砜和砜骨架；甲?；?formacetyl)和硫代甲酰基骨架；亞甲基甲?；土虼柞；羌?；含鏈烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；及其他具有N、O、S和CH2組成部分的骨架。
[0178]教導(dǎo)制備上述寡核苷酸的典型美國專利包括但不限于美國專利Nos.5，034，506 ；5，166，315 ;5，185，444 ;5，214，134 ;5，216，141 ;5，235，033 ;5，64，562 ;5，264，564 ；5，405，938 ;5，434，257 ;5，466，677 ;5，470，967 ;5，489，677 ;5，541，307 ;5，561，225 ；5，596，086 ;5，602，240 ;5，608，046 ;5，610，289 ;5，618，704 ;5，623，070 ;5，663，312 ；5，633，360 ;5，677，437 ;和5，677，439，各專利以引用方式合并于此。
[0179]在其他適當(dāng)?shù)膁sRNA模擬物中，核苷酸單元的糖和核苷間鍵兩者，即，骨架，用新基團(tuán)替換。保持堿基單元用于與適當(dāng)?shù)暮怂崮繕?biāo)化合物雜交。已經(jīng)顯示具有優(yōu)異雜交性質(zhì)的一種這樣的寡聚化合物，dsRNA模擬物，稱為肽核酸(PM)。在PNA化合物中，dsRNA的糖骨架被含酰胺骨架替換，特別是被氨基乙基甘氨酸骨架替換。核堿基被保持并直接或間接結(jié)合至骨架的酰胺部分的氮雜氮原子。教導(dǎo)制備上述PNA化合物的典型美國專利包括但不限于美國專利5，539，082 ;5，714，331 ;和5，719，262，各專利以引用方式合并于此。PNA化合物的其他教導(dǎo)可在Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500中發(fā)現(xiàn)。
[0180]本發(fā)明其他實(shí)施方式是具有硫代磷酸骨架和具有雜原子骨架的寡核苷酸的dsRNA,以及特別是以上引用的美國專利N0.5，489，677的一CH2—NH—CH2—、-CH2-N (CH3) -O-CH2-[稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI骨架]、—CH2—O—N (CH3) -CH2-,—CH2—N(CH3) —N(CH3) —CH2—和一N(CH3) —CH2—CH2—[其中天然磷酸二脂骨架表不為--O--P--O--CH2--],以及以上引用的美國專利N0.5，602，240的酰胺骨架。以上引用的美國專利N0.5，034, 506中的具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的dsRNA也是優(yōu)選的。
[0181]修飾dsRNA也可以包含一個(gè)或多個(gè)取代的糖部分。優(yōu)選的dsRNA在W位置包含以下基團(tuán)的一種:0H ；F ;0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1到Cltl烷基或C2到Cltl烯基和炔基。特別優(yōu)選的是 O [ (CH2) n0] mCH3、O (CH2) n0CH3、O (CH2) nNH2、0 (CH2) nCH3、0 (CH2) n0NH2和0(CH2)nON[(CH2)nCH3]]2，其中n和m是I到約10。其他優(yōu)選的dsRNA在2'位置包含以下基團(tuán)中的一種=C1到Cltl低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3> 0CN、Cl、Br、CN、CF3> OCF3> SOCH3> S02CH3> ONO2, NO2, N3> NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基團(tuán)、報(bào)道基團(tuán)、嵌入劑、用于改善dsRNA的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)、或用于改善dsRNA的藥效性質(zhì)的基團(tuán)、及其他具有類似性質(zhì)的取代基。 優(yōu)選的修飾包括2'-甲氧基乙氧基(2' -O--CH2CH2OCH3，也稱為2' -0-(2-甲氧基乙基)或 2' -Μ0Ε) (Martin 等 Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)，SP，烷氧基-烷氧基。其他優(yōu)選的修飾包括2' -二甲基氨基氧基乙氧基，即O (CH2)2ON(CH3)2基團(tuán)，又名2' -DMA0E，如以下實(shí)施例所描述，和2' -二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領(lǐng)域中又名 2’ _0_二甲基氣基乙氧基乙基或 2 ' _DMAE0E)，即 2' _0一CH2一O一CH2一N(CH2)2，也在以下實(shí)施例中描述。
[0182]其他優(yōu)選的修飾包括2 '-甲氧基(2 ' -OCH3)、2 '-氨基丙氧基(.2' -OCH2CH2CH2NH2)和V -氟代(2' -F)。類似的修飾也可在dsRNA的其他位置上進(jìn)行，特別是3'端核苷酸上的糖的3'位置或2' -5'連接的dsRNA中和5'端核苷酸的5'位置。DsRNA也可以含有糖模擬物例如環(huán)丁基部分代替戊呋喃基糖。教導(dǎo)制備這種修飾糖結(jié)構(gòu)的典型美國專利包括但不限于美國專利Nos.4，981，957 ;5，118，800 ;5，319，080 ；5，359，044 ;5，393，878 ;5，446，137 ;5，466，786 ;5，514，785 ;5，519，134 ;5，567，811 ；5，576，427 ;5，591，722 ;5，597，909 ;5，610，300 ;5，627，053 ;5，639，873 ;5，646，265 ；5，658，873 ;5，670，633 ;和5，700，920，它們中的一些由本 申請人:擁有，各專利以引用方式全部合并于此。
[0183]dsRNA也可以包含核堿基(通常在本領(lǐng)域中簡稱為“堿基”)修飾或取代。如本發(fā)明所使用，“未修飾的”或“天然”核堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核堿基包括其他合成的和天然的核堿基例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5_羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-炔丙基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代，特別是5-溴代、5-三氟甲基及其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤和3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。其他核堿基包括公開在美國專利N0.3，687，808中的那些，公開在The ConciseEncyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages858-859, Kroschwitz,J.L, ed.John ffiley&Sons, 1990 中的那些，公開在 Englisch 等，Angewandte Chemie,International Edition, 1991, 30,613 中的那些，以及公開在 Sanghvi, Y S., Chapter 15,DsRNA Research and Applications, pages289_302, Crooke, S.T 和 Lebleu, B., Ed., CRCPress, 1993中的那些。這些核堿基中的某些對(duì)增加本發(fā)明寡聚化合物的結(jié)合親和力特別有用。這些包括5-取代嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙腺嘌呤、5-炔丙基尿嘧啶和5-炔丙基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代顯示使核酸雙鏈體穩(wěn)定性增加 0.6-1.2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T.and Lebleu, B., Eds., DsRNA Research andApplications,CRC Press,Boca Raton, 1993,pp.276-278)并且是不范性的喊基取代，更特別是當(dāng)與2' -O-甲氧基乙基糖修飾結(jié)合時(shí)。
[0184]教導(dǎo)制備某些上述修飾的核堿基以及其他修飾的核堿基的典型的美國專利包括但不限于上述提到的美國專利N0.3，687,808,以及美國專利Nos.4，845，205 ;5，130，30 ；5，134，066 ;5，175，273 ;5，367，066 ;5，432，272 ;5，457，187 ;5，459，255 ;5，484，908 ；5，502，177 ;5，525，711 ;5，552，540 ;5，587，469 ;5，594，121，5，596，091 ;5，614，617 ；和 5，681，941，各專利以引用方式合并于此，且美國專利N0.5，750，692也以引用方式合并于此。
[0185]偶聯(lián)物
[0186]本發(fā)明dsRNA的另一個(gè)修飾包括將dsRNA化學(xué)連接到提高dsRNA的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝入的一個(gè)或多個(gè)部分或偶聯(lián)物上。這種部分包括但不限于脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分(Letsinger 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1989,86:6553)、膽酸(Manoharan 等，Bioorg.Med.Chem.Lett., 1994,4:1053)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(beryl-S-tritylthiol) (Manoharan 等，Ann.N.Y.Acad.Sc1., 1992,660:306 ；Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let., 1993,3:2765)、疏基膽固醇(Oberhauser 等，Nucl.AcidsRes., 1992, 20:533-538)、脂肪鏈，例如十二燒二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等，EMBO J,1991，10:1111-1118 ；Kabanov 等，F(xiàn)EBS Lett.，1990，259:327-330 ；Svinarchuk等，Biochimie, 1993，75:49-54)、磷脂，例如二-十六烷基_rac_甘油或三乙基-銨1，2_ 二 -O-十六烷基-rac-甘油-3-氫亞憐酸鹽(Manoharan 等，Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654 ;Shea 等，Nucl.Acids Res.，1990，18:3777-3783)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan 等，Nucleosides&Nucleotides, 1995,14:969-973)、或金剛燒乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654)、掠櫚基部分(Mishra 等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264:229-237)、或十八烷基胺或己氨基-羰氧基膽固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996, 277:923-937)。
[0187]教導(dǎo)制備這種dsRNA偶聯(lián)物的典型美國專利包括但不限于:美國專利 Nos.4，828，979 ；4, 948，882 ；5, 218，105 ；5, 525，465 ；5, 541，313 ；5, 545，730 ；5，552，538 ；5, 578，717,5, 580, 731 ；5, 591，584 ；5, 109, 124 ；5, 118，802 ；5, 138，045 ；5，414，077 ；5, 486，603 ；5, 512，439 ；5, 578，718 ；5, 608，046 ；4, 587，044 ；4, 605，735 ；4，667，025 ；4, 762，779 ；4, 789，737 ；4, 824，941 ；4, 835，263 ；4, 876，335 ；4, 904，582 ；4，958，013 ；5, 082，830 ；5, 112，963 ；5, 214，136 ；5, 082，830 ；5, 112，963 ；5, 214，136 ；5，245，022 ；5, 254，469 ；5, 258，506 ；5, 262，536 ；5, 272，250 ；5, 292，873 ；5, 317，098 ；5，371，241，5，391，723 ；5, 416，203，5，451，463 ；5, 510，475 ；5, 512，667 ；5, 514，785 ；5，565，552 ；5, 567，810 ；5, 574，142 ；5, 585，481 ；5, 587，371 ；5, 595，726 ；5, 597，696 ；5，599，923 ；5, 599，928和5，688，941，各專利以引用方式合并于此。
[0188]不需要在給定化合物的所有位置進(jìn)行相同的修飾，且事實(shí)上可以在單個(gè)化合物或甚至在dsRNA的單個(gè)核苷內(nèi)結(jié)合一種以上上述修飾。本發(fā)明還包括為嵌合化合物的dsRNA化合物。本發(fā)明上下文中的“嵌合的”dsRNA化合物或“嵌合體”是這樣一種dsRNA化合物，特別是dsRNA，其含有兩個(gè)或更多個(gè)化學(xué)上不同的區(qū)域，每個(gè)由至少一個(gè)單體單元組成，SP，在dsRNA化合物的情況下由核苷酸組成。這些dsRNA通常含有至少一個(gè)dsRNA修飾的區(qū)域，從而賦予該dsRNA增加的對(duì)核酸酶降解的抗性、增加的細(xì)胞攝入和/或增加的對(duì)于目標(biāo)核酸的結(jié)合親和力。dsRNA的其他區(qū)域可以作為能切割RNA =DNA或RNA =RNA雜交體的酶的底物。例如，RNase H是細(xì)胞核酸內(nèi)切酶，其切割RNA =DNA雙鏈體的RNA鏈。因此RNase H的活化導(dǎo)致RNA靶標(biāo)的切割，因此極大地增強(qiáng)了 dsRNA抑制基因表達(dá)的效果。因此，當(dāng)使用嵌合的dsRNA時(shí),與雜交至相同目標(biāo)區(qū)域的硫代磷酯脫氧dsRNA相比,使用較短的dsRNA通常能得到可比的結(jié)果。
[0189]RNA靶標(biāo)的切割可以通過本領(lǐng)域已知的凝膠電泳以及如有必要結(jié)合核酸雜交技術(shù)按常規(guī)檢測。dsRNA的靶標(biāo)mRNA上的切割位點(diǎn)可以使用通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測定，例如，Soutschek 等，Nature ;2004，Vol.432，pp.173-178 描述的 5，-RACE 法(為所有目的其以引用方式合并 于此)。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用Soutschek等的5’-RACE法，確定 ALN-18328 在 SEQ ID NO: 1331 (NM_000371.3)的位置 636 的鳥苷酸核苷酸和 SEQ ID NO:1331的位置637的腺嘌呤核苷酸之間切割TTR mRNA。在一個(gè)實(shí)施方式中，確定ALN-18328不在SEQ ID NO:1331的位置637的腺嘌呤核苷酸和SEQ ID NO: 1331的位置638的鳥苷酸核苷酸之間切割TTR mRNA。
[0190]在某些情況下，dsRNA可以通過非配體基團(tuán)修飾。將許多非配體分子偶聯(lián)到dsRNAs上以提高dsRNA的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝入，且用于進(jìn)行這種偶聯(lián)的方法可在科學(xué)文獻(xiàn)中得到。這種非配體部分包括脂質(zhì)部分，例如膽固醇(Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1989,86:6553)、膽酸(Manoharan 等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994,4:1053)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan 等，Ann.N.Y.Acad.Sc1.，1992,660:306 ；Manoharan 等，Bioorg.Med.Chem.Let., 1993,3:2765)、疏基膽固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.，1992，20:533-538)、脂肪鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras 等，EMBO J, 1991, 10:1111-1118 ;Kabanov 等，F(xiàn)EBS Lett.，1990，259:327-330 ；Svinarchuk 等,Biochimie, 1993, 75:49-54)、憐脂,例如二 -十六烷基-rac-甘油或三乙基-銨1，2_ 二 -O-十六烷基-rac-甘油-3-H-亞憐酸鹽(Manoharan等,TetrahedronLett.，1995，36:3651-3654 ；Shea 等，Nucl.Acids Res.，1990，18:3777-3783)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan 等，Nucleosides&Nucleotides, 1995,14:969-973)、或金剛燒乙酸(Manoharan 等，Tetrahedron Lett.，1995, 36:3651-3654)、掠櫚基部分(Mishra 等，Biochim.Biophys.Acta, 1995，1264:229-237)、或十八烷基胺或己氨基-羰氧基膽固醇部分(Crooke 等,J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996,277:923-937)。教導(dǎo)制備這種 dsRNA 偶聯(lián)物的典型的美國專利已經(jīng)列在上文。典型的偶聯(lián)方法包括合成在序列的一個(gè)或多個(gè)位置上攜帶氨基連接子的dsRNA。然后使該氨基與使用適當(dāng)?shù)呐悸?lián)劑或活化劑偶聯(lián)的分子反應(yīng)。偶聯(lián)反應(yīng)也可以用仍然與固體支持體結(jié)合的dsRNA或在溶液相中切割后的dsRNA進(jìn)行。通過HPLC純化dsRNA偶聯(lián)物通常得到純的偶聯(lián)物。
[0191]載體編碼的dsRNA
[0192]在另一個(gè)方面，TTR dsRNA分子由插入DNA或RNA載體中的轉(zhuǎn)錄單元表達(dá)(例如參見 Couture, A,等，TIG.(1996)，12:5-10 ；Skinern, A.，等，國際 PCT 公布說明書N0.WOOO / 22113，Conrad，國際 PCT 公布說明書 N0.WOOO / 22114，和 Conrad，美國專利N0.6，054，299)?？梢砸脒@些轉(zhuǎn)基因作為線性構(gòu)建體、環(huán)狀質(zhì)?；虿《据d體，其可作為轉(zhuǎn)基因被結(jié)合和遺傳整合入宿主基因組中。可以構(gòu)建該轉(zhuǎn)基因以使其作為染色體外質(zhì)粒被遺傳(Gassmann,等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1995) 92: 1292)。
[0193]dsRNA的各鏈可以通過兩個(gè)分離的表達(dá)載體上的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄并共轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞中?；蛘遜sRNA的各鏈可 以通過均位于相同表達(dá)質(zhì)粒上的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方式中，dsRNA表示為通過連接多核苷酸序列連接的反向重復(fù)，以至dsRNA具有莖和環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0194]重組dsRNA表達(dá)載體通常是DNA質(zhì)?；虿《据d體。表達(dá)dsRNA的病毒載體可以基于以下非限制性的病毒構(gòu)建:腺伴隨病毒(綜述見Muzyczka,等，Curr.Topics Micr0.Tmmunol.(1992) 158:97-129))、腺病毒(例如參見 Berkner,等，BioTechniques (1998) 6:616)， Rosenfeld 等(1991， Science252:431-434)和 Rosenfeld 等(1992)， Cell68:143-155))、或甲病毒以及本領(lǐng)域已知的其他病毒。在體外和/體內(nèi)已經(jīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒將各種基因引入許多不同的細(xì)胞類型包括上皮細(xì)胞中(例如參見Eglitis，等，Science(1985) 230:1395-1398 ；Danos 和 Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(1998) 85:6460-6464 ;Wilson 等，1988，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:3014-3018 ;Armentano 等，1990，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:61416145 ；Huber 等，1991，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:8039-8043 ；Ferry 等，1991，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:8377-8381 ；Choffdhury 等，1991，Science254:1802-1805 ；van Beusechem.等，1992, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:7640-19 ；Kay 等，1992, Human Gene Therapy3:641-647 ；Dai 等，1992, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10892-10895 ;Hwu 等，1993，J.1mmunol.150:4104-4115 ;美國專利 N0.4,868，116 ;美國專利 N0.4，980，286 ；PCT 申請 W089 / 07136 ；PCT 申請 W089 / 02468 ；PCT 申請 W089 / 05345 ；和PCT申請W092 / 07573)。能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)并表達(dá)插入細(xì)胞基因組中的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以通過將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組轉(zhuǎn)染入適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系例如PA317和Ps1-CRIP來制備(Comette 等，1991, Human Gene Therapy2:5-10 ；Cone 等，1984, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6349)。重組腺病毒載體可用于感染易感宿主(例如大鼠、倉鼠、狗和黑猩猩)中的多種細(xì)胞和組織(Hsu等，1992，J.1nfectious Disease, 166:769)，并且也具有不需要有絲分裂活性細(xì)胞進(jìn)行感染的優(yōu)點(diǎn)。
[0195]可以使用能夠接受要表達(dá)的dsRNA分子的編碼序列的任何病毒載體，例如源自腺病毒(AV);腺伴隨病毒(AAV);逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒(LV)、彈狀病毒、鼠白血病病毒)；皰疹病毒等的載體。病毒載體的向性可以通過用包膜蛋白或來自其他病毒的其他表面抗原假型包裝載體，或視情況通過取代不同的病毒衣殼蛋白來改變。
[0196]例如，本發(fā)明的慢病毒載體可以用選自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、Mokola病毒等的表面蛋白來假型包裝?？梢酝ㄟ^工程化載體以表達(dá)不同的衣殼蛋白血清型來使本發(fā)明的AAV載體靶向不同細(xì)胞。例如，在血清型2基因組上表達(dá)血清型2衣殼的AAV載體稱為AAV2 / 2。該AAV2 / 2載體中的血清型2衣殼基因可以由血清型5衣殼基因取代，從而生成AAV2 / 5載體。表達(dá)不同的衣殼蛋白血清型的AAV載體的構(gòu)建技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員范圍之內(nèi)；例如參見Rabinowitz J E等(2002)，J Virol76 =791-801,其全部公開內(nèi)容以引用方式合并于此。
[0197]適用于本發(fā)明的重組病毒載體的選擇、向載體中插入用于表達(dá)dsRNA的核酸序列的方法和遞送病毒載體到目標(biāo)細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍之內(nèi)，例如參見 Dornburg R(1995), Gene Therap.2:301-310 ；Eglitis M A(1988), Biotechniques6:608-614 ；Miller A D(1990),Hum Gene Therap.1:5-14 ；Anderson W F(1998),Nature392:25-30 ;和Rubinson D A等，Nat.Genet.33:401_406，其全部公開內(nèi)容以引用方式合并于此。
[0198]病毒載體可以源自于AV和AAV。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的dsRNA以來源于重組AAV載體的兩個(gè)分離、互補(bǔ)的單鏈RNA分子表示，所述載體例如具有U6或HlRNA啟動(dòng)子，或巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。
[0199]用于表達(dá)本發(fā) 明的dsRNA的適當(dāng)?shù)腁V載體、構(gòu)建重組AV載體的方法和將載體遞送入靶細(xì)胞的方法描述在Xia H等(2002), Nat.Biotech.20:1006-1010中。
[0200]用于表達(dá)本發(fā)明的dsRNA的適當(dāng)?shù)腁AV載體、構(gòu)建重組AV載體的方法和將載體遞送入靶細(xì)胞的方法描述在 Samulski R 等(1987)，J.Virol.61:3096-3101 ；Fisher K J 等(1996)，J.Virol, 70:520-532 ；Samulski R 等(1989)，J.Virol.63:3822-3826 ;美國專利N0.5，252，479 ;美國專利N0.5，139，941 ;國際專利申請N0.W094 / 13788 ;和國際專利申請N0.W093 / 24641中，其全部公開內(nèi)容以引用方式合并于此。
[0201]驅(qū)動(dòng)dsRNA在本發(fā)明的DNA質(zhì)?；虿《据d體中表達(dá)的啟動(dòng)子可以是真核RNA聚合酶I (例如，核糖體RNA啟動(dòng)子),RNA聚合酶II (例如，CMV早期啟動(dòng)子或肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或UlsnRNA啟動(dòng)子)或通常是RNA聚合酶III啟動(dòng)子(例如U6snRNA或7SK RNA啟動(dòng)子)或原核啟動(dòng)子，例如T7啟動(dòng)子，條件是表達(dá)質(zhì)粒也編碼由T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄所需的T7RNA聚合酶。啟動(dòng)子也可將轉(zhuǎn)基因表達(dá)引導(dǎo)至胰腺(例如參見，用于胰腺的胰島素調(diào)節(jié)序列(Bucchini等，1986，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:2511-2515))。
[0202]另外，轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以例如通過使用誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)序列和表達(dá)系統(tǒng)(例如對(duì)某些生理調(diào)節(jié)劑例如循環(huán)葡萄糖水平或激素敏感的調(diào)節(jié)序列)來精確調(diào)節(jié)(Docherty等，1994,FASEB J.8:20-24)。適于控制轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞或在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的這種誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)包括通過蛻皮激素、通過雌激素、黃體酮、四環(huán)素、二聚化化學(xué)誘導(dǎo)物和異丙基-β-Dl-硫代半乳糖苷(EPTG)來調(diào)節(jié)?；赿sRNA轉(zhuǎn)基因的預(yù)定用途，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能選擇適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)/啟動(dòng)子序列。
[0203]通常，能夠表達(dá)dsRNA分子的重組載體如下文所述遞送并存在于靶細(xì)胞中?；蛘?，可以使用導(dǎo)致dsRNA分子的瞬時(shí)表達(dá)的病毒載體。根據(jù)需要，可以重復(fù)施用這些載體。一旦表達(dá)，dsRNA與目標(biāo)RNA結(jié)合并調(diào)節(jié)其功能或表達(dá)。表達(dá)dsRNA的載體的遞送可以是全身性的，例如通過靜脈或肌內(nèi)施用，通過施用至從病人移出的靶細(xì)胞，然后再引入病人，或者通過允許引入所需靶細(xì)胞的任何其他方法。
[0204]通常將sRNA表達(dá)DNA質(zhì)粒作為與陽離子脂質(zhì)載體(例如Oligofectamine)或非陽離子脂質(zhì)基載體(例如Transit-ΤΚΟΤΜ)的復(fù)合物轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞中。本發(fā)明也可預(yù)期在一周或更長時(shí)期內(nèi)用于針對(duì)單個(gè)TTR基因或多個(gè)TTR基因不同區(qū)域的dsRNA介導(dǎo)的降低(knockdowns)的多次脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。載體向宿主細(xì)胞中的成功引入可以通過使用多種已知方法來監(jiān)控。例如，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可用報(bào)道子例如熒光標(biāo)記物、例如綠色熒光蛋白(GFP)來顯示。細(xì)胞在體外的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可通過使用使轉(zhuǎn)染細(xì)胞具有對(duì)特定環(huán)境因素(例如抗生素和藥物)的抗性例如潮霉素B抗性的標(biāo)記物來確保。
[0205]TTR特異性dsRNA分子也可插入載體并用作人類患者的基因治療載體。基因治療載體例如可通過靜脈注射、局部施用(參見美國專利5，328，470)或通過立體定位注射(例如參見 Chen 等(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:3054-3057)遞送給受試者。基因治療載體的藥物制劑可以包含可接受的稀釋劑中的基因治療載體，或可以包含其中包埋有基因遞送載體的緩釋基質(zhì)?；蛘撸?dāng)完整的基因遞送載體例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以由重組細(xì)胞完整地產(chǎn)生時(shí)，所述藥物制劑可以包含產(chǎn)生基因遞送系統(tǒng)的一種或多種細(xì)胞。[0206]II1.包含dsRNA的藥物組合物
[0207]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供含有本文所述的dsRNA和藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物。所述含有dsRNA的藥物組合物用于治療與TTR基因的表達(dá)或活性有關(guān)的疾病或病癥，例如由TTR表達(dá)介導(dǎo)的病理過程。這樣的藥物組合物基于遞送方式來配制。一個(gè)例子是為了經(jīng)由非腸道遞送例如通過靜脈(IV)遞送進(jìn)行全身施用而配制的組合物。另一個(gè)例子是用于直接遞送到腦實(shí)質(zhì)，例如通過輸注到腦，如通過連續(xù)泵輸注而配制的組合物。
[0208]本發(fā)明的藥物組合物以足以抑制TTR基因表達(dá)的劑量施用。
[0209]通常，dsRNA的適當(dāng)劑量為每天每公斤接受者體重0.01到200.0mg,通常在每天每公斤體重I到50mg范圍內(nèi)。例如dsRNA可以每單劑量0.0059mg / kg、0.01mg / kg、0.0295mg / kg、0.05mg / kg、0.0590mg / kg、0.163mg / kg、0.2mg / kg、0.3mg / kg、
0.4mg / kg、0.5mg / kg、0.543mg / kg、0.5900mg / kg、0.6mg / kg、0.7mg / kg、0.8mg /kg、0.9mg / kg、Img / kg、1.1mg / kg、L2mg / kg、1.3mg / kg、L4mg / kg、1.5mg / kg、
1.628mg / kg、2mg / kg、3mg / kg、5.0mg / kg、10mg / kg、20mg / kg、30mg / kg、40mg /kg 或 50mg / kg 施用。
[0210]在一個(gè)實(shí)施方式中，劑量為0.01到0.2mg / kg。例如，dsRNA可以以下劑量施用:0.01mg / kg、0.02mg / kg、0.3mg / kg、0.04mg / kg、0.05mg / kg、0.06mg / kg、0.07mg / kg、0.08mg / kg、0.09mg / kg、0.1Omg / kg、0.1lmg / kg、0.12mg / kg、0.13mg /kg、0.14mg / kg、0.15mg / kg、0.16mg / kg、0.17mg / kg、0.18mg / kg、0.19mg / kg 或
0.20mg / kgo
[0211]在一個(gè)實(shí)施方式中，劑量為0.005mg / kg到1.628mg / kg。例如，dsRNA可以0.0059mg / kg、0.0295mg / kg、0.0590mg / kg、0.163mg / kg、0.543mg / kg、0.5900mg /kg或1.628mg / kg的劑量施用。[0212]在一個(gè)實(shí)施方式中，劑量為0.2mg / kg到1.5mg / kg。例如，dsRNA可以以下劑量施用:0.2mg / kg、0.3mg / kg、0.4mg / kg、0.5mg / kg、0.6mg / kg、0.7mg / kg、0.8mg /kg、0.9mg / kg、Img / kg、1.1mg / kg、L2mg / kg、1.3mg / kg、L4mg / kg 或 1.5mg /
kg o
[0213]所述藥物組合物可以一天施用一次，或者dsRNA可以在全天以適當(dāng)間隔分兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)亞劑量施用，或者甚至使用連續(xù)輸注或通過控釋制劑遞送。在這種情況下，各亞劑量中含有的dsRNA必須相應(yīng)變小，以達(dá)到每日總劑量。也可以混合劑量單元，以在幾天內(nèi)遞送，例如，使用在幾天時(shí)期內(nèi)提供dsRNA的持續(xù)釋放的傳統(tǒng)持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑是本領(lǐng)域熟知的，且對(duì)在特定部位遞送試劑特別有用，例如可以用于本發(fā)明的試劑。在該實(shí)施方式中，劑量單元包含相應(yīng)的多個(gè)每日劑量。
[0214]單劑量對(duì)TTR水平的影響是長期的，這樣以不超過3、4或5天的間隔，或以不超過
1、2、3或4周的間隔，或以不超過5、6、7、8、9或10周的間隔施用后續(xù)劑量。
[0215]本領(lǐng)域技術(shù)人員了解某些因素可以影響有效治療受試者所需的劑量和時(shí)機(jī)，包括但不限于疾病或病癥的嚴(yán)重性、先前的治療、受試者的總體健康和/或年齡以及存在的其他疾病。而且，用治療有效量的組合物治療受試者可以包含單次治療或一系列治療。本發(fā)明包括的各dsRNA的有效劑量和體內(nèi)半衰期的估計(jì)可以通過使用傳統(tǒng)方法或者根據(jù)如本文其他地方所述的使用適當(dāng)動(dòng)物模型的體內(nèi)試驗(yàn)來進(jìn)行。
[0216]小鼠遺傳學(xué)的進(jìn)展產(chǎn)生了許多用于研究各種人類疾病例如由TTR表達(dá)介導(dǎo)的病理過程的小鼠模型。這些模型用于dsRNA的體內(nèi)試驗(yàn)，以及用于確定治療有效劑量。適當(dāng)?shù)男∈竽Ｐ屠缡牵?表達(dá)人TTR的質(zhì)粒的小鼠。另一種適當(dāng)?shù)男∈竽Ｐ褪菙y帶表達(dá)人TTR的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0217]由細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可被用于制定供人使用的劑量范圍。本發(fā)明的組合物的劑量通常在包含ED50但幾乎沒有或沒有毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)?；谑褂玫膭┬秃褪褂玫氖┯猛緩?，劑量可以在該范圍內(nèi)改變。對(duì)于用于本發(fā)明方法的任何化合物，治療有效劑量可以最初從細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)評(píng)估?？梢栽趧?dòng)物模型中制定劑量以達(dá)到該化合物的循環(huán)血漿濃度范圍，或者，適當(dāng)時(shí)，達(dá)到目標(biāo)序列的多肽產(chǎn)物的循環(huán)血漿濃度范圍(例如，達(dá)到降低的多肽濃度)，該范圍包含在細(xì)胞培養(yǎng)中測定的IC50(即，達(dá)到癥狀的半數(shù)最大抑制的測試化合物的濃度)。這種信息可用于更精確地確定人類的有用劑量。血漿水平例如可以通過高效液相色譜法測定。
[0218]本發(fā)明的dsRNA可以與能有效治療由靶基因表達(dá)介導(dǎo)的病理過程的其他已知藥劑聯(lián)合使用。在任何情況下，開業(yè)醫(yī)師可以根據(jù)使用本領(lǐng)域已知或本文描述的標(biāo)準(zhǔn)效果測定觀察到的結(jié)果來調(diào)整dsRNA施用的劑量和時(shí)機(jī)。
[0219]MM
[0220]本發(fā)明也包括含有本發(fā)明的dsRNA化合物的藥物組合物和制劑。基于是需要局部還是全身治療以及基于治療區(qū)域，本發(fā)明的藥物組合物可以多種方式施用。施用可以是局部的，經(jīng)肺的，例如，通過粉末或氣霧劑的吸入或吹入，包括通過噴霧器；經(jīng)氣管的，經(jīng)鼻的，表皮和透皮的，經(jīng)口或非腸道的。腸胃外給藥包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉注射或輸注；或顱內(nèi)，例如，實(shí)質(zhì)內(nèi)、鞘內(nèi)或室內(nèi)施用。
[0221]可以以靶向特定組織例如肝臟(例如，肝臟肝細(xì)胞)的方式遞送dsRNA。[0222]本發(fā)明包括可以通過直接注射入腦而遞送的藥物組合物。所述注射可以是通過立體定位注射入腦的特定區(qū)域(例如，黑質(zhì)、皮層、海馬、紋狀體或內(nèi)側(cè)蒼白球)，或dsRNA可以遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多個(gè)區(qū)域(例如，遞送到腦的多個(gè)區(qū)域，和/或遞送到脊髓)。也可以將dsRNA遞送到腦的擴(kuò)散區(qū)域(例如擴(kuò)散遞送至腦皮層)。
[0223]在一個(gè)實(shí)施方式中，靶向TTR的dsRNA可以通過一端已植入組織中的套管或其他遞送裝置遞送，所述組織例如，腦，例如，腦的黑質(zhì)、皮層、海馬、紋狀體、胼胝體或內(nèi)側(cè)蒼白球。所述套管可以與dsRNA組合物的貯藥庫相連。可通過泵，例如滲透泵或小型真空泵，例如Alzet泵(Durect, Cupertino, CA),調(diào)節(jié)流動(dòng)或遞送。在一個(gè)實(shí)施方式中，泵和忙藥庫植入在遠(yuǎn)離組織的區(qū)域中，例如，植在腹部，通過從泵或貯藥庫引到釋放位點(diǎn)的導(dǎo)管實(shí)現(xiàn)遞送。dsRNA組合物向腦中的輸注可以持續(xù)幾小時(shí)或幾天,例如,持續(xù)1、2、3、5或7天或更長。用于遞送到腦的裝置例如在美國專利Nos.6，093, 180和5，814，014中描述。
[0224]用于局部施用的藥物組合物和制劑可以包括透皮貼劑、軟膏、洗劑、霜?jiǎng)?、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末劑。傳統(tǒng)的藥物載體、水性、粉末或油性基質(zhì)、增稠劑等可能是必要的或需要的。涂層避孕套、手套等也是有用的。適當(dāng)?shù)木植恐苿┌ū景l(fā)明dsRNA與局部遞送劑混合的那些制劑，所述局部遞送劑例如是脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑。適當(dāng)?shù)闹|(zhì)和脂質(zhì)體包括中性的(例如，二油?；字OPE乙醇胺、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿DMPC、二硬脂酰磷脂酰膽堿)、陰性的(例如二肉豆蘧酰磷脂酰甘油DMPG)和陽離子的(例如，二油?；募谆被视虳OTAP和二油?；字Ｒ掖及稤0TMA)。本發(fā)明的DsRNA可以包封于脂質(zhì)體內(nèi)，或可以形成與脂質(zhì)體、特別是與陽離子脂質(zhì)體的復(fù)合物?；蛘撸琩sRNA可以和脂質(zhì)特別是陽離子脂質(zhì)復(fù)合。適當(dāng)?shù)闹舅岷王グǖ幌抻诨ㄉ南┧?、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油二月桂酸酯、甘油?-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環(huán)庚-2-酮、酰基肉堿、?；憠A或C1,烷基酯(例如，肉豆蘧酸異丙酯IPM)、甘油一酯、甘油二酯或其藥學(xué)可接受鹽。局部制劑詳細(xì)描述在美國專利N0.6，747, 014中，其以引用方式合并于此。
[0225]脂質(zhì)體制劑
[0226]除了已被研究并用于藥物制劑中的微乳劑外，還存在許多組織化的表面活性劑結(jié)構(gòu)。其中包括單層、膠束、雙層和囊泡。囊泡例如脂質(zhì)體因?yàn)槠涮禺愋院推湓谒幬镞f送方面提供的持久作用，因而吸引了巨大興趣。如本發(fā)明所使用，術(shù)語“脂質(zhì)體”指的是由以一個(gè)或多個(gè)球狀雙層排列的兩性脂質(zhì)組成的囊泡。
[0227]脂質(zhì)體是單層或多層囊泡，其具有由親脂性的材料形成的膜和水性內(nèi)部。水性部分包含要遞送的組合物。陽離子脂質(zhì)體具有能夠融合至細(xì)胞壁的優(yōu)點(diǎn)。盡管不能與細(xì)胞壁有效融合，但非陽離子脂質(zhì)體在體內(nèi)被巨噬細(xì)胞吞噬。
[0228]為了透過完整的哺乳動(dòng)物皮膚，脂質(zhì)囊泡必須在適當(dāng)?shù)耐钙ぬ荻鹊挠绊懴峦高^一連串細(xì)孔，每個(gè)孔的直徑小于50nm。因此，需要使用高度可變形并能透過這種細(xì)孔的脂質(zhì)體。
[0229]脂質(zhì)體的其他優(yōu)點(diǎn) 包括:由天然磷脂獲得的脂質(zhì)體是可生物相容且可生物降解的；脂質(zhì)體可以結(jié)合大量水和脂質(zhì)可溶解的藥物；脂質(zhì)體可以保護(hù)其內(nèi)在小室中包封的藥物免受代謝和降解(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger andBanker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumel, p.245) ? 制備脂質(zhì)體制劑的重要考慮因素是脂質(zhì)表面電荷、囊泡大小和脂質(zhì)體的含水量。
[0230]脂質(zhì)體可用于轉(zhuǎn)移和遞送活性成分到作用部位。因?yàn)橹|(zhì)體膜的結(jié)構(gòu)類似于生物膜，當(dāng)脂質(zhì)體應(yīng)用于組織時(shí)，脂質(zhì)體開始與細(xì)胞膜融合，隨著脂質(zhì)體和細(xì)胞融合的進(jìn)行，脂質(zhì)體內(nèi)容物注入細(xì)胞中，其中活化劑可以起作用。
[0231]脂質(zhì)體制劑作為許多藥物的遞送方式已經(jīng)成為廣泛研究的焦點(diǎn)。越來越多的證據(jù)表明，對(duì)于局部施用，脂質(zhì)體存在著優(yōu)于其他制劑的優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)包括與施用藥物的高度全身吸收有關(guān)的副作用減少、施用藥物在所需靶標(biāo)上的積聚增加、以及能夠?qū)⒍喾N藥物包括親水性和疏水性藥物施用于皮膚。
[0232]若干報(bào)告詳述了脂質(zhì)體將包括高分子量DNA的試劑遞送入皮膚的能力。包括止痛劑、抗體、激素和高分子量DNA的化合物已經(jīng)施用于皮膚。大多數(shù)應(yīng)用導(dǎo)致靶向上表層。
[0233]脂質(zhì)體分成兩個(gè)主要類別。陽離子脂質(zhì)體是帶正電荷的脂質(zhì)體，其和帶負(fù)電荷的DNA分子相互作用以形成穩(wěn)定絡(luò)合物。帶正電荷的DNA /脂質(zhì)體絡(luò)合物結(jié)合至帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面并內(nèi)化于內(nèi)體中。由于內(nèi)體中的酸性pH，脂質(zhì)體破裂，釋放其內(nèi)容物到細(xì)胞質(zhì)中(Wang 等，Biochem.Bio phys.Res.Commun.，1987,147,980-985).[0234]對(duì)pH敏感的或帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體誘捕DNA而不是含有其的絡(luò)合物。因?yàn)镈NA和脂質(zhì)兩者所帶的電荷相似，因此發(fā)生排斥而不是絡(luò)合物形成。然而，一些DNA在這些脂質(zhì)體的含水內(nèi)部被誘捕。PH敏感的脂質(zhì)體用于遞送編碼胸苷激酶基因的DNA到培養(yǎng)中的細(xì)胞單層。在祀細(xì)胞中檢測到外源基因的表達(dá)(Zhou等，Journal of Controlled Release, 1992,19,269-274)。
[0235]脂質(zhì)體組合物的一種主要類型包括天然衍生的磷脂酰膽堿以外的磷脂。例如，中性脂質(zhì)體組合物可以由二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿(DMPC)或二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)組成。陰離子脂質(zhì)體組合物通常由二肉豆蘧酰磷脂酰甘油組成，而陰離子融合脂質(zhì)體主要由二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)形成。另一種類型的脂質(zhì)體組合物由磷脂酰膽堿(PC)例如大豆PC和蛋PC組成。另一種類型由磷脂和/或磷脂酰膽堿和/或膽固醇的混合物形成。
[0236]若干研究評(píng)價(jià)了脂質(zhì)體藥物制劑向皮膚的局部遞送。將包含干擾素的脂質(zhì)體應(yīng)用到豚鼠皮膚，導(dǎo)致皮膚皰疹得分的減少，而經(jīng)由其他手段(例如，作為溶液或作為乳劑)遞送干擾素則無效(Weiner 等，Journal of Drug Targeting, 1992, 2,405-410)。此外，另一研究測試了作為脂質(zhì)體制劑部分施用的干擾素和使用含水體系施用干擾素的效果，并斷定脂質(zhì)體制劑優(yōu)于含水施用(du Plessis 等，Antiviral Research, 1992,18, 259-265)。
[0237]還檢測了非離子脂質(zhì)體系統(tǒng)(特別是含有非離子型表面活性劑和膽固醇的系統(tǒng))以測定其在將藥物遞送至皮膚中的用途。含有Novasome?〗(二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂酰醚)和NOVaSOmeTMII (二硬脂酸甘油酯/膽固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂酰醚)的非離子脂質(zhì)體制劑用于遞送環(huán)孢菌素-A到鼠皮膚的真皮。結(jié)果顯示這種離子脂質(zhì)體系統(tǒng)能有效促進(jìn)環(huán)孢菌素-A沉淀到不同皮膚層中(Hu等S.T.P.Pharma.Sc1.，1994，4，6,466)ο
[0238]脂質(zhì)體也包括“空間穩(wěn)定的”脂質(zhì)體，本文使用的該術(shù)語指的是當(dāng)脂質(zhì)結(jié)合入脂質(zhì)體時(shí)，含有一種或多種特定脂質(zhì)的脂質(zhì)體相對(duì)于缺乏這種特定脂質(zhì)的脂質(zhì)體具有提聞的循環(huán)有效期?？臻g穩(wěn)定脂質(zhì)體的例子是這樣的脂質(zhì)體:其中脂質(zhì)體的囊泡形成脂質(zhì)部分的一部分(A)包含一種或多種糖脂，例如單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂Gmi，或(B)由一種或多種親水性聚合物衍生化，例如聚乙二醇(PEG)部分。不愿被任何特定理論束縛，本領(lǐng)域認(rèn)為，至少對(duì)于包含神經(jīng)節(jié)苷脂、鞘磷脂、或PEG-衍生化脂質(zhì)的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體來說，這些空間穩(wěn)定脂質(zhì)體的提高的循環(huán)半衰期是由于向網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)細(xì)胞內(nèi)的攝入減少(Allen等，F(xiàn)EBSLetters,1987,223,42 ；ffu 等，Cancer Research,1993,53,3765)。
[0239]含有一種或多種糖脂的各種脂質(zhì)體是本領(lǐng)域已知的。Papahadjopoulos等(Ann.N.Y.Acad.Sc1.，1987，507，64)報(bào)導(dǎo)了單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂Gm1、硫酸半乳糖腦苷脂和磷酯酰肌醇提高脂質(zhì)體的血液半衰期的能力。這些發(fā)現(xiàn)也由Gabizon等詳細(xì)說明(Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，1988，85，6949)。美國專利 N0.4，837，028 和 W088 / 04924(均屬于 Alien等)公開了含有⑴鞘磷脂和⑵神經(jīng)節(jié)苷脂Gmi或硫酸半乳糖腦苷酯的脂質(zhì)體。美國專利N0.5，543，152 (Webb等)公開了含有鞘磷脂的脂質(zhì)體。W097 / 13499(Lim等)公開了含有1，2-sn- 二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿的脂質(zhì)體。
[0240]含有由一種或多種親水性聚合物衍生化的脂質(zhì)的許多脂質(zhì)體及其制備方法是本領(lǐng)域已知的。Sunamoto等(Bull.Chem.Soc.Jpn., 1980, 53, 2778)描述了含有非離子型去污劑2C1215e的脂質(zhì)體，該去污劑含有PEG部分。Illum等(FEBS Lett.，1984，167，79)注意到聚苯乙烯顆粒和聚乙二醇的親水性包衣導(dǎo)致血半衰期的顯著提高。Sears描述了通過結(jié)合聚亞烷基二醇(例如PEG)的羧基而修飾的合成磷脂(美國專利Nos.4，426，330和4,534,899)。Klibanov 等(FEBS Lett.，1990，268，235)描述的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了含有用 PEG 或PEG硬脂酸酯衍生的磷酯酰乙醇胺(PE)的脂質(zhì)體具有顯著提高的血循環(huán)半衰期。Blume等(Biochimica et Biophysica Acta, 1990,1029,91)將這一發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展到其他 PEG-衍生憐月旨，例如由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和PEG形成 的DSPE-PEG。在其外表面具有共價(jià)結(jié)合的PEG部分的脂質(zhì)體在歐洲專利N0.EP0445131B1和Fisher的W090 / 04384中描述。含有1-20摩爾百分比的用PEG衍生的PE的脂質(zhì)體組合物及其使用方法由Woodle等(美國專利Nos.5，013，556和5，356，633)和Martin等(美國專利N0.5，213，804和歐洲專利N0.EP0496813B1)描述。含有若干其他脂質(zhì)-聚合物偶聯(lián)物的脂質(zhì)體在W091 / 05545和美國專利N0.5，225，212 (兩者均屬于Martin等)以及W094 / 20073 (Zalipsky等)中描述。含有PEG-修飾的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)的脂質(zhì)體在W096 / 10391 (Choi等)中描述。美國專利 N0.5，540，935 (Miyazaki 等)和美國專利 N0.5，556，948 (Tagawa 等)描述了含有 PEG 的脂質(zhì)體，其表面可進(jìn)一步用官能部分衍生化。
[0241]含有核酸的若干脂質(zhì)體是本領(lǐng)域已知的。Thierry等的W096 / 40062公開了用于在脂質(zhì)體中包封高分子量核酸的方法。Tagawa等的美國專利N0.5，264，221公開了蛋白鍵合的脂質(zhì)體，并聲稱這種脂質(zhì)體的內(nèi)容物可以包含dsRNA。Rahman等的美國專利N0.5，665，710描述了在脂質(zhì)體中包封寡脫氧核糖核苷酸的某種方法。Love等的W097 /04787公開了含有靶向raf基因的dsRNA的脂質(zhì)體。
[0242]傳遞體是另一種類型的脂質(zhì)體，其是高度可變形的脂質(zhì)集合體，是藥物遞送載體的重要候選者。傳遞體可以描述為脂質(zhì)小滴，其是如此高度可變形因此它們能夠容易地穿透小于所述小滴的小孔。傳遞體適合于使用它們的環(huán)境，例如，它們是自優(yōu)化(適應(yīng)皮膚小孔的形狀)、自修復(fù)、不間斷地頻繁到達(dá)其靶標(biāo)以及通常自裝載。為制備傳遞體，可以將表面邊緣活化劑，通常是表面活性劑添加到標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)體組合物中。傳遞體用于遞送血清清蛋白到皮膚。傳遞體介導(dǎo)的血清清蛋白的遞送顯示和含有血清清蛋白的溶液的皮下注射一樣有效。
[0243] 表面活性劑在制劑例如乳劑(包括微乳劑)和脂質(zhì)體中具有廣泛應(yīng)用。分類和排序許多不同種類的表面活性劑(天然和合成的)的性質(zhì)的最常用的方法是使用親水/親油平衡(HLB)。親水基(又名“頭”)的性質(zhì)提供用于分類制劑中使用的不同表面活性劑的最有用的方法(Rieger, in Pharmaceutical Dosage FormsiMarcel Dekker,Inc.,New York，N.Y.，1988，p.285)。
[0244]如果表面活性劑分子未離子化，它被歸類為非離子型表面活性劑。非離子型表面活性劑在藥物和化妝品產(chǎn)品中有著廣泛應(yīng)用，且可在很寬的PH值范圍內(nèi)使用。通常，取決于其結(jié)構(gòu)，其HLB值為2到約18。非離子型表面活性劑包括非離子酯例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、失水山梨醇酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非離子的烷醇酰胺和醚例如乙氧基化脂肪醇、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段共聚物也包括在這種類型中。聚氧化乙烯表面活性劑是非離子型表面活性劑中最常用的成員。
[0245]如果表面活性劑分子溶解或分散在水中時(shí)，其攜帶負(fù)電荷，該表面活性劑歸類為陰離子型。陰離子型表面活性劑包括羧酸酯，例如肥皂、?；樗狨?、氨基酸的?；０?、硫酸酯例如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯、磺酸酯例如烷基苯磺酸酯、酰基羥乙基磺酸酯、?；；撬狨ズ突腔《狨?，以及磷酸酯。陰離子型表面活性劑的最重要成員是烷基硫酸酯和肥皂。
[0246]如果表面活性劑分子溶解或分散在水中時(shí)，其攜帶正電荷，該表面活性劑被歸類為陽離子型。陽離子型表面活性劑包括季銨鹽和乙氧化胺。季銨鹽是這種類型的最常用的成員。
[0247]如果表面活性劑分子能夠攜帶正或負(fù)電荷，該表面活性劑被歸類為兩性的。兩性表面活性劑包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜堿和磷脂。
[0248]藥物、制劑以及乳劑中表面活性劑的使用已有綜述(Rieger, in PharmaceuticalDosage Forms, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y.,1988, p.285)。
[0249]核酸脂質(zhì)顆粒
[0250]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的TTR dsRNA完全包封于脂質(zhì)制劑中，例如，以形成SPLP, pSPLP、SNALP或其他的核酸-脂質(zhì)顆粒。如本文所使用，“SNALP”指的是穩(wěn)定的核酸-脂質(zhì)顆粒，包括SPLP。如本文所使用，“SPLP”指的是含有包封于脂質(zhì)囊泡內(nèi)的質(zhì)粒DNA的核酸-脂質(zhì)顆粒。SNALP和SPLP通常包含陽離子脂質(zhì)、非陽離子脂質(zhì)和阻止顆粒聚集的脂質(zhì)(例如，PEG-脂質(zhì)偶聯(lián)物)。SNALP和SPLP對(duì)于全身應(yīng)用極其有用，因?yàn)樗鼈冊陟o脈(1.V.)注射后顯示延長的循環(huán)有效期并聚集在遠(yuǎn)端部位(例如，在物理上與施用部位分離的部位)。SPLP包括“pSPLP”，其含有PCT公布說明書N0.W000 / 03683中所列的包封的縮合劑-核酸絡(luò)合物。通常本發(fā)明顆粒的平均直徑為約50nm到約150nm，更通常為約60nm到約130nm,更通常為約70nm到約IlOnm,最通常為約70nm到約90nm,且基本上無毒。另外，當(dāng)存在于本發(fā)明的核酸-脂質(zhì)顆粒中時(shí)，水溶液中的核酸抵抗核酸酶的降解。核酸-脂質(zhì)顆粒及其制備方法描述在例如美國專利Nos.5，976，567 ;5，981，501 ;6，534，484 ;6，586，410 ；6，815，432 ;和 PCT 公布說明書 N0.W096 / 40964 中。
[0251]在一個(gè)實(shí)施方式中，脂質(zhì)與藥物的比例(質(zhì)量/質(zhì)量比)(例如，脂質(zhì)與dsRNA的比例)將為約1:1到約50: 1、約1:1到約25: 1、約3: I到約15: 1、約4: I到約10: 1、約5: I到約9: I或約6: I到約9: I。
[0252]陽離子脂質(zhì)例如可以是，N, N-二油烯基-N，N-二甲基氯化銨(DODAC)、N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化銨(DDAB)、N-(1-(2，3-二油氧基)丙基)_N，N，N-三甲基氯化銨(DOTAP)、N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)_N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)、N，N-二甲基-2，3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)、1，2-二亞油基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、I, 2-二亞麻基氧基-N, N-二甲基氨基丙烷(I, 2_DiIinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane) (DLenDMA)、1，2-二亞油基氨基甲酸氧基-3- 二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1，2-二亞油基氧基-3-( 二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1，2-二亞油基氧基-3-嗎啉代丙烷(DLin-MA)、1，2-二亞油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1，
2-二亞油基硫代-3- 二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞油?；鵢2_亞油基氧基_3_ 二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、l，2-二亞油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化鹽(DLin-TMA.Cl)、I，2- 二亞油?；?3-三甲基氨基丙烷氯化鹽(DLin-TAP.Cl)、I，2- 二亞油基氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N，N-二亞油基氨基)-1，2-丙二醇(DLinAP)、
3-(N，N- 二油基氨基)-1，2-丙二醇(DOAP) ,1,2- 二亞油基氧代_3_ (2-N, N- 二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1，2- 二亞麻基氧基-N，N- 二甲基氣基丙烷(DLinDMA)、2，2- 二亞油基-4-二甲基氨基甲基-[I，3]-二氧戊環(huán)(DLin-K-DMA)或其類似物、(3aR，5s，6aS)-N，N- 二甲基-2, 2- _.((9Z, 12Z)_ 十八碳-9,12- 二稀)四氧-3aH-環(huán)戍[d] [1,3] 二氧戍環(huán)-5-胺(ALNlOO)、4-( 二甲基氨基)丁酸(6Z，9Z，28Z，31Z)_ 庚三十碳-6，9，28，31-四烯-19-基酯(MC3)、1，1' -(2-(4- (2- ((2-(雙(2-羥基十二烷基)氨基)乙基)(2-羥基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基亞氨基)雙十二烷-2-醇(Tech Gl)或其混合物。陽離子脂質(zhì)可以占存在于顆粒中的總脂質(zhì)的約20mol%到約50mol%或約40mol%。
[0253]在另一個(gè)實(shí)施方式中，化合物2，2- 二亞油基-4- 二甲基氨基乙基-[I，3] - 二氧戊環(huán)可用于制備脂質(zhì)-siRNA納米顆粒。2, 2- 二亞油基-4- 二甲基氨基乙基-[I，3]- 二氧戍環(huán)的合成描述在2008年10月23日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?1 / 107,998中，其以引用方式合并于此。
[0254]在一個(gè)實(shí)施方式中，脂質(zhì)-siRNA顆粒包含40%的2，2-二亞油基-4- 二甲基氨基乙基-[1，3]_ 二氧戊環(huán):10%DSPC: 40%膽固醇:10% PEG-C-DOMG(摩爾百分比)，粒徑為63.0±20nm，且siRNA /脂質(zhì)比例為0.027。
[0255]非陽離子脂質(zhì)可以是陰離子脂質(zhì)或中性脂質(zhì)，包括但不限于:二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰-磷酯酰乙醇胺(DOPE)、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(POPC)、棕櫚酰油酰磷酯酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷酯酰乙醇胺4-(N-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蘧酰磷酯酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、16-0- 一甲基PE、16-0- 二甲基PE、18-1-反PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、膽固醇或其混合物。非陽離子脂質(zhì)可以占存在于顆粒中的總脂質(zhì)的約5mol %到約90mol %、約lOmol1^、或約5811101% (如果包括膽固醇的話)。
[0256]抑制顆粒聚集的偶聯(lián)脂質(zhì)例如可以是聚乙二醇(PEG)脂質(zhì)，包括但不限于:PEG- 二酰甘油(DAG)、PEG- 二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神經(jīng)酰胺(Cer)或其混合物。PEG-DAA偶聯(lián)物例如可以是PEG-二月桂基氧基丙基(Ci2)、PEG-二肉豆蘧基氧基丙基(Ci4)、PEG-二棕櫚基氧基丙基(Ci6)或PEG-二硬脂基氧基丙基(Ci8)。抑制顆粒聚集的偶聯(lián)脂質(zhì)可以占存在于顆粒中的總脂質(zhì)的Omol %到約2011101%或約
[0257]在一些實(shí)施方式中，核酸-脂質(zhì)顆粒還包含膽固醇，例如是存在于顆粒中的總脂質(zhì)的約 IOmol %到約 6011101%或約 4811101?^
[0258]LNPOl
[0259]在一個(gè)實(shí)施方式中，可用類脂質(zhì)(lipidoid)ND98.4Ηα(Μ?1487)(通式I)、膽固醇(Sigma-Aldrich)和 PEG-神經(jīng)酸胺 C16 (Avanti Polar Lipids)制備脂質(zhì)-siRNA 納米顆粒(即LNPOl顆粒)。各自在乙醇中的原液可以如下制備:ND98,133mg / ml ;膽固醇，25mg /ml，PEG-神經(jīng)酰胺C16，IOOmg / ml。然后例如以42: 48: 10的摩爾比混合ND98、膽固醇和PEG-神經(jīng)酰胺C16原液?；旌系闹|(zhì)溶液可以與水性siRNA(例如，在pH5的乙酸鈉中)混合，這樣乙醇的最終濃度約為35-45%且乙酸鈉的最終濃度約為100-300mM。一旦混合，脂質(zhì)-siRNA納米顆粒通常自發(fā)形成。取決于所需的粒徑分布，生成的納米顆?；旌衔锟梢允褂美鐭崛蹟D出機(jī)例如Lipex擠出機(jī)(Northern Lipids公司)擠壓通過聚碳酸酯膜(例如，IOOnm截值)。在一些情況下，擠出步驟可以省略。除去乙醇和同時(shí)的緩沖液更換可以伴隨著例如透析或切向流過濾。緩沖液可以例如用pH約7、例如pH約6.9、pH約
7.0、pH約7.1、pH約7.2、pH約7.3或pH約7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)更換。
[0260]
【權(quán)利要求】
1.用于抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有有義鏈和反義鏈，所述反義鏈含有與編碼運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)的mRNA的一部分互補(bǔ)的區(qū)域，其中所述互補(bǔ)區(qū)域的長度小于30個(gè)核苷酸，所述反義鏈含有SEQ ID NO:170,SEQ IDNO:450, SEQ ID NO:730或SEQ ID NO:1010的15或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。
2.權(quán)利要求1的dsRNA，其中所述有義鏈含有SEQID NO:169、SEQ ID NO:449、SEQ IDNO:729或SEQ ID NO:1009的15或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。
3.權(quán)利要求1的dsRNA，其中所述有義鏈由SEQID NO:449組成，所述反義鏈由SEQ IDNO:450 組成。
4.權(quán)利要求1的dsRNA，其中所述有義鏈由SEQID NO:729組成，所述反義鏈由SEQ IDNO:730 組成。
5.權(quán)利要求1的dsRNA，其中所述有義鏈由SEQID NO:1009組成，所述反義鏈由SEQID NO:1010 組成。
6.權(quán)利要求1的dsRNA，其中所述dsRNA含有選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的有義鏈和選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的反義鏈。
7.權(quán)利要求1或2或6的dsRNA，其中所述互補(bǔ)區(qū)域的長度是19個(gè)核苷酸。
8.權(quán)利要求1或2或6的dsRNA，其中所述互補(bǔ)區(qū)域由SEQID NO:169組成。
9.權(quán)利要求1或2或6的dsRNA，其中所述dsRNA的各鏈長度是19、20、21、22、23或24個(gè)核苷酸。
10.權(quán)利要求1或2或6的dsRNA，其中各鏈長度是21個(gè)核苷酸。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103937793SQ201410053075
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2009年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2008年10月20日
【發(fā)明者】D·W·薩, G·辛克爾, R·阿爾瓦雷茲, S·米爾斯泰恩, 陳慶敏 申請人:阿爾尼拉姆醫(yī)藥品有限公司