制備交聯(lián)nampt及篩選nampt抑制劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備交聯(lián)NAMPT及篩選NAMPT抑制劑的方法，涉及抑制劑領(lǐng)域，包括以下步驟：制備NAMPT重組蛋白，使用還原劑還原NAMPT重組蛋白，還原蛋白與交聯(lián)劑反應(yīng)獲得活性中心被封堵的交聯(lián)NAMPT，配置第一蛋白溶液、和第二蛋白溶液，制備第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液，采用熒光光譜儀分別測(cè)定第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算第一待分析溶液和第二待分析溶液熒光強(qiáng)度下降的百分率。本發(fā)明的步驟比較少，操作較簡(jiǎn)單，成本比較低，反應(yīng)過程受外界環(huán)境影響比較小，不僅重復(fù)性較好，而且結(jié)果比較準(zhǔn)確。
【專利說明】制備交聯(lián)NAMPT及篩選NAMPT抑制劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及NAMPT抑制劑選擇領(lǐng)域，具體涉及一種制備交聯(lián)NAMPT及篩選NAMPT抑制劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]NAMPT (nicotinamidephosphoribosyltransferase,尼克酸胺憐酸核糖轉(zhuǎn)移酶)又稱為 PBEF (pre-B cell colony-enhancing factor,前 B 細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子)或 Visfatin(cisceral fat adipokine，內(nèi)臟脂肪素)，是哺乳動(dòng)物體內(nèi) NAD (nicotinamde adeninedinucleotide,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸)補(bǔ)救合成通路中的限速酶。NAD用于參與細(xì)胞物質(zhì)、能量代謝、蛋白質(zhì)修飾、DNA修復(fù)等工程，當(dāng)人體處于應(yīng)激狀態(tài)或者產(chǎn)生疾病時(shí)，人體內(nèi)的NAD含量會(huì)增加，與NAD對(duì)應(yīng)的NAMPT的含量也會(huì)增加。
[0003]NAMPT廣泛分布在人體中，NAMPT在人體細(xì)胞內(nèi)(細(xì)胞漿、細(xì)胞核和線粒體)和細(xì)胞外的作用機(jī)制不同，細(xì)胞內(nèi)的NAMPT主要通過合成NAD，來調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、促進(jìn)細(xì)胞分化成熟、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和保持細(xì)胞各項(xiàng)功能的穩(wěn)定。細(xì)胞外的NAMPT不僅能夠通過合成NMN(nicotinamide mononucleotide,煙酰胺單核苷酸)發(fā)揮作用，而且本身具有非酶的作用，即NAMPT能夠作為一個(gè)細(xì)胞因子，通過作用于其未知的受體發(fā)揮作用，如產(chǎn)生介導(dǎo)炎癥、氧化應(yīng)激等反應(yīng)。
[0004]研究表明，快速增殖的腫瘤細(xì)胞需要較多的MD，腫瘤細(xì)胞中NAMPT的含量遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞，通過抑制腫瘤細(xì)胞中NAMPT的表達(dá)，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，NAMPT成為了抗腫瘤藥物研究的新靶點(diǎn)。
[0005]現(xiàn)有的NAMPT 抑制劑包括 FK866(又稱 AP0866，英文名為(E)-N-[4-[1-(benzoyl)piperidin-4-yl]butyl]-3-pyridin-3-ylprop-2-enamide,分子式為 C24H29N3O2)和CB30865 (英文名 p-[N-(7-bromo-3, 4-dihydro-2-methyl-4-oxoquinazoIin-6-yImethy 1+++) -N- (prop-2-ynyl) amino] -N- (3-pyridylmethyl) benzamide,分子式 C26H22BrN5O2),其中FK866的抗腫瘤臨床試驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)行了 5項(xiàng)，但是FK866在使用時(shí)副作用較大，抗腫瘤療效較差，新的NAMPT抑制劑還在積極探索中。
[0006]目前，篩選NAMPT抑制劑的方法為以下2種:
[0007](1)針對(duì)NAMPT的蛋白質(zhì)構(gòu)象進(jìn)行藥物設(shè)計(jì):得到先導(dǎo)化合物，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造得到待選抑制劑；或通過FK866等已知抑制劑獲得母核，對(duì)母核進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造得到待選抑制劑，然后將待選抑制劑與腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行作用，篩選效果較好的待選抑制劑得到抑制劑成品。
[0008](2)將待選抑制劑加入體外的NAMPT重組蛋白酶促反應(yīng)體系，得到NMN (尼克酰胺單核苷酸);向NMN中先加入苯乙酮反應(yīng)、再加入乙酸反應(yīng)，得到帶有一個(gè)熒光基團(tuán)的NMN衍生物，對(duì)NMN衍生物進(jìn)行熒光測(cè)定，得到NMN的生成量，通過NMN的生成量判斷NAMPT重組蛋白的酶活性是否受到待選抑制劑的影響。
[0009]但是，現(xiàn)有的篩選NAMPT抑制劑的方法分別存在以下缺陷:[0010](I)對(duì)先導(dǎo)化合物和已知抑制劑母核化合物結(jié)構(gòu)改造得到待選抑制劑，將待選抑制劑與腫瘤細(xì)胞株作用得到抑制劑成品的方法，每次只能對(duì)一種待選抑制劑進(jìn)行篩選，步驟比較繁瑣，不僅成本比較高，而且工作效率比較低。
[0011](2)將待選抑制劑加入體外的NAMPT重組蛋白酶促反應(yīng)體系，通過測(cè)定NMN選擇抑制劑的方法，反應(yīng)步驟較多，操作比較復(fù)雜，反應(yīng)過程受外界環(huán)境影響較大，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種制備交聯(lián)NAMPT及篩選NAMPT抑制劑的方法，成本較低，工作效率較高，反映步驟較少，操作比較簡(jiǎn)單，反應(yīng)過程受外界環(huán)境影響較小，檢測(cè)結(jié)果較準(zhǔn)確。
[0013]為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種制備交聯(lián)NAMPT及篩選NAMPT抑制劑的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0014]S1、制備NAMPT重組蛋白；
[0015]S2、按照摩爾份，將1份NAMPT重組蛋白加入20~100份還原劑中；在溫度為20°C~25°C的條件下孵育0.5h~1.5h，得到粗蛋白；采用脫鹽柱除去粗蛋白中的還原劑，得到預(yù)處理蛋白；
[0016]S3、按照摩爾 份，將1份預(yù)處理蛋白與2~5份1，4_雙(馬來酰亞胺基)丁烷混合均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下靜置反應(yīng)Ih~5h，采用脫鹽柱除去未反應(yīng)的1，4-雙(馬來酰亞胺基)丁烷，得到交聯(lián)NAMPT ；
[0017]S4、預(yù)置PBS緩沖溶液，將PBS緩沖溶液分為3份:第一 PBS緩沖溶液、第二 PBS緩沖溶液、第三PBS緩沖溶液，所述第一 PBS緩沖溶液和第二 PBS緩沖溶液的體積相同；
[0018]向第一 PBS緩沖溶液中加入NAMPT重組蛋白，形成濃度小于50 μ M的第一蛋白溶液；將第一蛋白溶液平均裝入偶數(shù)支容積為500μ L~2mL的第一石英管中，將所述第一石英管平均分為2組:A組、B組；
[0019]向第二 PBS緩沖溶液中加入交聯(lián)NAMPT，配置濃度與第一蛋白溶液相同的第二蛋白溶液；將第二蛋白溶液平均裝入偶數(shù)支容積為500μ L~2mL的第二石英管中，每支第二石英管中的第二蛋白溶液的體積，與每支第一石英管中第一蛋白溶液的體積相等，將所述第二石英管平均分為兩組:C組、D組；
[0020]S5、配置濃度為0.5mM~1.5mM的待選擇抑制劑溶液，向A組的每支第一石英管中加入體積不一的待選擇抑制劑溶液，每支第一石英管中第一蛋白溶液的NAMPT重組蛋白的摩爾量:待選擇抑制劑溶液的摩爾量為1:0~1:100 ;每支第一石英管加入待選擇抑制劑溶液后混合均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下，靜置5min~15min，得到第一待分析溶液；
[0021]向B組的每支第一石英管中加入體積不一的第三PBS緩沖溶液，每支第一石英管中第三PBS緩沖溶液的體積，與A組對(duì)應(yīng)的第一石英管中待選擇抑制劑溶液的體積相同，每支第一石英管加入第三PBS緩沖溶液后混合均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下，靜置5min~15min,得到第一對(duì)照溶液；
[0022]向C組的每支第二石英管中加入體積不一的待選擇溶液，每支第二石英管中待選擇抑制劑溶液的體積，與A組對(duì)應(yīng)的第一石英管中待選擇抑制劑溶液的體積相同，混合均勻，每支第二石英管加入待選擇抑制劑溶液后混合均勻后，在溫度為20°C~25°C的條件下，靜置5min~15min,得到第二待分析溶液；
[0023]向D組的每支第二石英管中加入體積不一的第三PBS緩沖溶液，每支第二石英管中第三PBS緩沖溶液的體積，與A組對(duì)應(yīng)的第一石英管中待選擇抑制劑溶液的體積相同，每支第二石英管加入第三PBS緩沖溶液后，混合均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下，靜置5min~15min,得到第二對(duì)照溶液；
[0024]S6、使用熒光光譜儀測(cè)定第一待分析溶液的熒光強(qiáng)度、第一對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度、第二待分析溶液的熒光強(qiáng)度、第二對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度；
[0025]S7、根據(jù)第一待分析溶液的熒光強(qiáng)度和第一對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度，計(jì)算第一待分析溶液熒光強(qiáng)度下降的百分率；根據(jù)第二待分析溶液的熒光強(qiáng)度和第二對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度，計(jì)算第二待分析溶液熒光強(qiáng)度下降的百分率。
[0026]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述待選擇抑制劑為迷迭香酸、洋薊素、1，3- 二咖啡?？鼘幩峄騀K866。
[0027]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟S2中所述還原劑為二硫蘇糖醇或三(2-羧乙基)膦。
[0028]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟S2包括以下步驟:按照摩爾份將1份NAMPT重組蛋白加入濃度為ImM~5mM的30份二硫蘇糖醇中，在溫度為20°C~25°C的條件下孵育lh，得到粗蛋白，采用脫鹽柱除去粗蛋白中未反應(yīng)的二硫蘇糖醇得到預(yù)處理蛋白。
[0029]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟S3包括以下步驟:將1，4-雙(馬來酰亞胺基)丁烷溶解于二甲基亞砜中，形成濃度為IOmM的1，4_雙(馬來酰亞胺基)丁烷溶液，取120 μ LI，4-雙(馬來酰亞胺基)丁烷溶液與預(yù)處理蛋白混合均勻后，在溫度為20°C~25°C的條件下反應(yīng)2h，采用脫鹽柱除去未反應(yīng)的1，4_雙(馬來酰亞胺基)丁烷，得到交聯(lián)NAMPT。
[0030]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟S4包括以下步驟:預(yù)置PBS緩沖溶液，將PBS緩沖溶液分為3份:第一 PBS緩沖溶液、第二 PBS緩沖溶液、第三PBS緩沖溶液，所述第一 PBS緩沖溶液和第二 PBS緩沖溶液的體積相同；
[0031]向第一 PBS緩沖溶液中加入NAMPT重組蛋白，配置濃度為0.5 μ M的第一蛋白溶液；將第一蛋白溶液平均分裝于偶數(shù)支第一石英管中，將第一石英管平均分為兩組:Α組、B組；
[0032]向第二 PBS緩沖溶液中加入交聯(lián)ΝΑΜΡΤ，配置濃度為0.5 μ M的第二蛋白溶液；將第二蛋白溶液拼接分裝于偶數(shù)支第二石英管中，將第二石英管平均分為兩組:C組、D組。
[0033]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟S5包括以下步驟:配置濃度為0.5mM的待選擇抑制劑溶液，向A組的第一石英管中依次加入體積不一的待選擇抑制劑溶液，每支第一石英管中第一蛋白溶液的NAMPT重組蛋白的摩爾量:待選擇抑制劑溶液的摩爾量為1:0~1:100 ;將每支第一石英管加入待選擇抑制劑后，混合均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下，靜置lOmin，得到第一待分析溶液；
[0034]向B組的第一石英管中依次加入體積不一的第三PBS緩沖溶液，第三PBS緩沖溶液的體積與加入A組的待選擇抑制劑溶液的體積對(duì)應(yīng)相等，每支第一石英管加入第三PBS緩沖溶液后，混合 均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下，靜置lOmin，得到第一對(duì)照溶液。[0035]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟S6包括以下步驟:使用熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為280nm的條件下，分別激發(fā)第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液，檢測(cè)并記錄第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液的發(fā)射波長(zhǎng)為315nm~360nm的突光強(qiáng)度；
[0036]或者使用熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為280nm的條件下，分別激發(fā)第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液，檢測(cè)并記錄第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液的發(fā)射波長(zhǎng)為333nm的熒光強(qiáng)度。
[0037]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述步驟S7中所述計(jì)算第一待分析溶液熒光強(qiáng)度下降的百分率的公式為:第一待分析溶液熒光強(qiáng)度下降百分率=(1-第一待分析溶液的熒光強(qiáng)度/第一對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度)X 100% ;所述計(jì)算第二待分析溶液熒光強(qiáng)度下降的百分率的公式為:第二待分析溶液熒光強(qiáng)度下降百分率=(1-第二待分析溶液的熒光強(qiáng)度/第二對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度)X 100%。
[0038]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，一種用于篩選NAMPT抑制劑的交聯(lián)NAMPT，其特征在于:采用權(quán)利要求1中的步驟S1、S2和S3制成。
[0039]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0040](I)本發(fā)明的抑制劑分別與NAMPT重組蛋白和交聯(lián)NAMPT反應(yīng)，得到第一待分析溶液和第二待分析溶液，通過熒光光譜儀測(cè)定第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液、第二對(duì)照溶液。
[0041]在激發(fā)光為280nm的條件下，產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)為315nm~360nm的熒光強(qiáng)度，或者發(fā)射波長(zhǎng)為333nm的熒光強(qiáng)度 并將第一待分析溶液的熒光強(qiáng)度與第一對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比對(duì)；將第二待分析溶液的熒光強(qiáng)度與第二對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果判定抑制劑對(duì)NAMPT重組蛋白和交聯(lián)NAMPT是否有抑制作用。
[0042]與現(xiàn)有的對(duì)先導(dǎo)化合物和已知抑制劑母核化合物結(jié)構(gòu)改造得到待選抑制劑，將待選抑制劑與腫瘤細(xì)胞株作用得到抑制劑成品的方法相比，成本比較低，反映步驟比較少，操作比較簡(jiǎn)單，工作效率較高，反應(yīng)過程受外界環(huán)境影響比較小。
[0043](2)本發(fā)明采用BMB與NAMPT重組蛋白反應(yīng)，形成酶活中心被封堵的交聯(lián)NAMPT，本發(fā)明將待抑制劑分別與NAMPT重組蛋白和交聯(lián)NAMPT反應(yīng)，通過反應(yīng)結(jié)果能夠判斷抑制劑與NAMPT重組蛋白的作用位點(diǎn)是否位于NAMPT的酶活中心，如果待選擇抑制劑不僅能夠與NAMPT重組蛋白作用，而且能夠與交聯(lián)NAMPT作用，則該待選擇抑制劑為NAMPT重組蛋白催化作用抑制劑；如果待選擇抑制劑只能與NAMPT重組蛋白作用，該待選擇抑制劑可能成為NAMPT非酶作用抑制劑。
[0044]本發(fā)明能夠區(qū)分待選擇抑制劑是催化作用抑制劑，還是潛在的非酶作用抑制劑，為NAMPT抑制劑的設(shè)計(jì)和篩選提供了較好的工具。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1為交聯(lián)NAMPT的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0046]圖2為不同摩爾量的迷迭香酸對(duì)NAMPT、交聯(lián)NAMPT的熒光強(qiáng)度下降百分率的影響的趨勢(shì)圖；
[0047]圖3為不同摩爾量的洋薊素對(duì)NAMPT、交聯(lián)NAMPT的熒光強(qiáng)度下降百分率的影響的趨勢(shì)圖；
[0048]圖4為不同摩爾量的1，3- 二咖啡?？鼘幩釋?duì)NAMPT、交聯(lián)NAMPT的熒光強(qiáng)度下降百分率的影響的趨勢(shì)圖；
[0049]圖5為不同摩爾量的FK866對(duì)NAMPT、交聯(lián)NAMPT的熒光強(qiáng)度下降百分率的影響的趨勢(shì)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0050]以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0051]本發(fā)明的制備交聯(lián)NAMPT及篩選NAMPT抑制劑的方法，包括以下步驟:
[0052]S1:制備NAMPT重組蛋白.[0053]S2:按照摩爾份將1份NAMPT重組蛋白加入20~100份(優(yōu)選為30份)還原劑中，還原劑可以選用DTT (二硫蘇糖醇)或TCEP (三(2-羧乙基)膦)?’在溫度為20°C~25°C的條件下孵育0.5h~1.5h (優(yōu)選為lh)，得到粗蛋白，采用脫鹽柱除去粗蛋白中的還原劑，得到預(yù)處理蛋白；
[0054]S3:按照摩爾份將1份預(yù)處理蛋白與2~5份交聯(lián)試劑BMB (I, 4_雙(馬來酰亞胺基)丁烷)加入反應(yīng)釜，混合均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下反應(yīng)Ih~5h (優(yōu)選為2h)后，采用脫鹽柱除去未反應(yīng)的BMB，得到交聯(lián)NAMPT ；
[0055]S4:預(yù)置PBS緩沖溶液，將PBS緩沖溶液分為三份:第一 PBS緩沖溶液、第二 PBS緩沖溶液和第三PBS緩沖溶液，其中，第一 PBS緩沖溶液和第二 PBS緩沖溶液的體積相等。
[0056]向第一 PBS緩沖溶液中加入NAMPT重組蛋白，形成濃度小于50 μ M(優(yōu)選為0.5 μ M)的第一蛋白溶液，;將第一蛋白溶液平均裝入偶數(shù)支容積為500μ I~2mL的第一石英管中，將偶數(shù)支第一石英管平均分為2組:A組、B組；
[0057]向第二 PBS緩沖溶液中加入交聯(lián)NAMPT，配置濃度與第一蛋白溶液相同的第二蛋白溶液；將第二蛋白溶液平均裝入偶數(shù)支容積為500μ I~2mL的第二石英管中，每支第二石英管中的第二蛋白的體積，與每支第一石英管中第一蛋白的體積相等，將偶數(shù)支第二石英管平均分為兩組=C組、D組；
[0058]S5、配置濃度為0.5mM~1.5mM的待選擇抑制劑溶液，待選擇抑制劑可以選用迷迭香酸、洋薊素、1，3-二咖啡?？鼘幩峄騀K866。向A組的第一石英管中依次加入體積不一的待選擇抑制劑溶液，每支第一石英管中第一蛋白溶液的NAMPT重組蛋白的摩爾量:待選擇抑制劑溶液的摩爾量為1:0~1:100 ;每支第一石英管中加入待選擇抑制劑溶液后混合均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下，靜置5min~15min (優(yōu)選為lOmin)，得到第一待分析溶液；
[0059]向B組的所有第一石英管中依次加入體積不一的第三PBS緩沖溶液，B組每支第一石英管中第三PBS緩沖溶液的體積，與A組對(duì)應(yīng)的第一石英管中待選擇抑制劑溶液的體積相同，每支第一石英管中加入第三PBS緩沖溶液后混合均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下，靜置5min~1 5min (優(yōu)選為IOmin),得到第一對(duì)照溶液；
[0060]向C組的所有第二石英管中依次加入體積不一的待選擇抑制劑溶液，C組每支第二石英管中待選擇抑制劑溶液的體積，與A組對(duì)應(yīng)的第一石英管中待選擇抑制劑溶液的體積相同，每支第二石英管中加入待選擇抑制劑溶液后混合均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下，靜置5min~15min (優(yōu)選為lOmin),得到第二待分析溶液；
[0061]向D組的所有第二石英管中依次加入體積不一的第三PBS緩沖溶液，D組每支第二石英管中第三PBS緩沖溶液的體積，與C組對(duì)應(yīng)的第二石英管中待選擇抑制劑溶液的體積相同，每支第二石英管加入第三PBS緩沖溶液后混合均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下，靜置5min~15min (優(yōu)選為IOmin),得到第二對(duì)照溶液；
[0062]S6:使用型號(hào)為HORIBA FM4的熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為280nm的條件下，分別激發(fā)第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液，檢測(cè)并記錄第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液分別發(fā)射波長(zhǎng)為315nm~360nm的熒光強(qiáng)度。
[0063]或者使用型號(hào)為HORIBA FM4的熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為280nm的條件下，分別激發(fā)第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液，檢測(cè)并記錄第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液分別發(fā)射波長(zhǎng)為333nm的熒光
強(qiáng)度。
[0064]S7、根據(jù)第一待分析溶液的熒光強(qiáng)度和第一對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度，計(jì)算第一待分析溶液熒光強(qiáng)度下降的百分率；根據(jù)第二待分析溶液的熒光強(qiáng)度和第二對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度，計(jì)算第二待分析溶液熒光強(qiáng)度下降的百分率。
[0065]本發(fā)明實(shí)施例中制備NAMPT重組蛋白包括以下步驟:
[0066]將pET-1 la-hnampt(G355C，D393C)均轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21 (DE3) Star 感受態(tài)細(xì)菌，將感受態(tài)細(xì)菌涂于含有50 μ g/ml氨芐青霉素的LB平板(無菌的、凝固在培養(yǎng)皿里的，摻了瓊脂的固體培養(yǎng)基)的上表面，在37°C的無菌條件下培養(yǎng)12h后，將菌落轉(zhuǎn)移至含有50 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C的條件下培養(yǎng)至克隆菌液的0D600=0.6 (0D指某種溶液在600nm波長(zhǎng)處的吸光值)，加入濃度為0.5mmol/L的IPTG (異丙基硫代半乳糖苷)，在20°C的條件下誘導(dǎo)反應(yīng)12h得到菌體培養(yǎng)液。
[0067]取1000Og菌體培養(yǎng)液在溫度為4°C的條件下離心10min，收集細(xì)菌沉淀，用裂解液重懸細(xì)菌，采用型號(hào)為avestin EmulsiFlex-C3的壓力破碎儀，在壓力為15000bar的條件下破碎細(xì)胞得細(xì)胞懸浮液，將細(xì)胞懸浮液在溫度為4°C、轉(zhuǎn)速為20000rpm的條件下離心30min,收集上清液。
[0068]采用蛋白純化層析系統(tǒng)對(duì)上清液進(jìn)行蛋白純化,得到純化蛋白；選用HisTrap FFcrude層析柱，使用濃度為30mM~300mM的咪唑溶液對(duì)純化蛋白進(jìn)行梯度洗脫，收集紫外吸收峰為280nm對(duì)應(yīng)的第一洗脫液。
[0069]采用型號(hào)為S-200的分子篩對(duì)第一洗脫液進(jìn)行純化，收集排阻體積為130ml左右的流出液；采用型號(hào)為Source Q的陰離子交換柱，選用濃度為OmM~500mM的NaCl溶液對(duì)流出液進(jìn)行梯度洗脫，收集紫外吸收峰為280nm對(duì)應(yīng)的第二洗脫液，得到NAMPT重組蛋白。
[0070]本發(fā)明的反應(yīng)機(jī)理如下:
[0071 ] 本發(fā)明實(shí)施例中，NAMPT重組蛋白為兩個(gè)NAMPT(G355C和D393C)單體形成的NAMPT二聚體，該二聚體具有兩個(gè)催化中心，每個(gè)催化中心的入口處均有兩對(duì)半胱氨酸，NAMPT重組蛋白與DTT反應(yīng)，NAMPT重組蛋白的兩對(duì)半胱氨酸均還原成半胱氨酰，形成預(yù)處理蛋白。預(yù)處理蛋白與BMB反應(yīng)，BMB與預(yù)處理蛋白中半胱氨酰的?；饔茫纬山宦?lián)NAMPT，參見圖1所示，綠色帶狀物為BMB，紅色位點(diǎn)為BMB與NAMPT交聯(lián)位點(diǎn)，交聯(lián)之處為位于NAMPT重組蛋白的被還原的催化中心，交聯(lián)NAMPT為催化中心被BMB封堵的NAMPT重組蛋白。
[0072]本發(fā)明實(shí)施例通過測(cè)定NAMPT重組蛋白分別與待選擇抑制劑、PBS緩沖溶液作用后的熒光強(qiáng)度，從而確定待選擇抑制劑對(duì)NAMPT重組蛋白的影響；本發(fā)明實(shí)施例通過將待選擇抑制劑分別于NAMPT重組蛋白、交聯(lián)NAMPT作用，從而確定待選擇抑制劑與NAMPT重組蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，以及待選擇抑制劑與NAMPT重組蛋白的結(jié)合強(qiáng)度。
[0073]本發(fā)明實(shí)施例是通過測(cè)定NAMPT重組蛋白內(nèi)源熒光的變化來實(shí)現(xiàn)的，成本比較低，不僅操作比較簡(jiǎn)單，而且單次測(cè)量時(shí)間較短。
[0074]下面，將結(jié)合4個(gè)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出詳細(xì)說明。
[0075]實(shí)施例1，選擇待選抑制劑為迷迭香酸。
[0076]S1:制備NAMPT重組蛋白。
[0077]S2:將2mL濃度為200 μ M的NAMPT重組蛋白加入1.6mL濃度為5mM的DTT ( 二硫蘇糖醇)中，在溫度為20°C的條件下，孵育lh，得到粗蛋白，采用脫鹽柱除去粗蛋白中的DTT，得到預(yù)處理蛋白。
[0078]S3:將預(yù)處理蛋白和80 μ L濃度為IOmM的BMB交聯(lián)試劑加入試管，混合均勻，在溫度為20°C的條件下反應(yīng)2h后，用脫鹽柱除去多余的BMB，得到交聯(lián)NAMPT。
[0079]S4:預(yù)置PBS緩沖溶液，將PBS緩沖溶液分為三份:第一 PBS緩沖溶液、第二 PBS緩沖溶液和第三PBS 緩沖溶液，其中，第一 PBS緩沖溶液和第二 PBS緩沖溶液的體積相同，向第一 PBS緩沖溶液中加入NAMPT重組蛋白，形成濃度為0.5 μ M的第一蛋白溶液，將第一蛋白溶液平均裝入30支容積為2mL的第一石英管中，將第一石英管平均分為兩組:A組、B組。
[0080]向第二PBS緩沖溶液中加入交聯(lián)NAMPT，配置濃度為0.5 μ M的第二蛋白溶液，將第一蛋白溶液平均裝入30支容積為2mL的第二石英管中，將第二石英管平均分為兩組:C組、D組。
[0081]S5:配置濃度為ImM迷迭香酸，向A組的第一石英管中加入迷迭香酸:向第一支第一石英管中加入O μ L迷迭香酸、向第二支第一石英管中加入0.5 μ L迷迭香酸、向第三支第一石英管中加入I μ L迷迭香酸、向第四支第一石英管中加入1.5 μ L迷迭香酸、向第五支第一石英管中加入2 μ L迷迭香酸、向第六支第一石英管中加入3 μ L迷迭香酸、向第七支第一石英管中加入4 μ L迷迭香酸、向第八支第一石英管中加入5 μ L迷迭香酸、向第九支第一石英管中加入7 μ L迷迭香酸、向第十支第一石英管中加入10 μ L迷迭香酸、向第十一支第一石英管中加入15 μ L迷迭香酸、向第十二支第一石英管中加入20 μ L迷迭香酸、向第十三支第一石英管中加入25 μ L迷迭香酸、向第十四支第一石英管中加入35 μ L迷迭香酸、向第十五支第一石英管中加入50 μ L迷迭香酸。每支第一石英管加入迷迭香酸后，混合均勻，在溫度為20°c的條件下靜置lOmin，得到第一分析溶液。
[0082]向B組的第一石英管中滴加第三PBS緩沖溶液，滴加的體積依次為O μ L、0.5 μ L、I μ L、l.5μ L、2y L、3y L、4y L、5y L、7y L、10y L、15y L、20y L、25y L、35y L 和 50μ L,每
支第一石英管加入第三PBS緩沖溶液后混合均勻，在溫度為20°C的條件下靜置lOmin，得到第一對(duì)照溶液。
[0083]向C組的每支第二石英管中加入濃度為ImM迷迭香酸:滴加的體積依次為O μ L、0.5yL>lyL>1.5yL>2yL>3yL>4yL>5yL>7yL>10yL>15yL>20yL>25yL>35uL 和50 μ L0每支第二石英管加入迷迭香酸后，混合均勻，在溫度為20°C的條件下靜置lOmin，得到第二分析溶液。
[0084]向D組的第二石英管中滴加第三PBS緩沖溶液，滴加的體積依次為O μ L、0.5 μ L、I μ L、l.5μ L、2y L、3y L、4y L、5y L、7y L、10y L、15y L、20y L、25y L、35y L 和 50μ L,每
支第二石英管加入第三PBS緩沖溶液后，混合均勻，在溫度為20°C的條件下靜置lOmin，得到第二對(duì)照溶液。
[0085]S6:使用型號(hào)為HORIBA FM4的熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為280nm的條件下，分別激發(fā)第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液，測(cè)量并記錄第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液的發(fā)射波長(zhǎng)為315nm~360nm的熒光強(qiáng)度；
[0086]S7:計(jì)算第一待測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度下降的百分率=(1-第一待分析溶液的熒光強(qiáng)度/第一對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度)X100% ;計(jì)算第二待測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度下降的百分率=(1-第二待分析溶液的熒光強(qiáng)度/第二對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度)X100%。
[0087]參見圖2所示，為NAMPT重組蛋白的熒光強(qiáng)度百分率與加入迷迭香酸摩爾量的關(guān)系圖，以及交聯(lián)NAMPT的熒光強(qiáng)度百分率與加入迷迭香酸摩爾量的趨勢(shì)圖。
[0088]迷迭香酸加入NAMPT重組蛋白后，NAMPT重組蛋白的熒光強(qiáng)度有所下降，隨著迷迭香酸加入量的增加，NAMPT重組蛋白的熒光下降百分率降低越明顯，說明迷迭香酸能夠與NAMPT重組蛋白作用。
[0089]迷迭香酸加入交聯(lián)NAMPT后，交聯(lián)NAMPT的熒光強(qiáng)度有所下降，迷迭香酸加入量越多，交聯(lián)NAMPT的熒光下降百分率降低越明顯，說明迷迭香酸能夠與交聯(lián)NAMPT作用，因?yàn)榻宦?lián)NAMPT為催化中心被封堵的NAMPT重組蛋白，因此可以說明:迷迭香酸未能夠與NAMPT重組蛋白催化中心發(fā)生相互作用，但是迷迭香酸能夠結(jié)合于NAMPT重組蛋白催化中心以外的位點(diǎn)結(jié)合，迷迭香酸能夠做為NAMPT非酶作用抑制劑。
[0090]實(shí)施例2:選擇待選抑制劑為洋薊素。
[0091]S1:制備NAMPT重組蛋白。
[0092]S2:將3mL濃度為200 μ M的NAMPT重組蛋白加入36mL濃度為ImM的ECET中，在溫度為25°C的條件下，孵育0.5h，得到粗蛋白，采用脫鹽柱除去粗蛋白中的DTT得到預(yù)處理蛋白。
[0093]S3:將預(yù)處理蛋白和240 μ L濃度為IOmM的BMB加入試管，混合均勻，在溫度為20°C的條件下反應(yīng)Ih后，用脫鹽柱除去多余的BMB，得到交聯(lián)NAMPT。
[0094]S4:預(yù)置PBS緩沖溶液，將PBS緩沖溶液分為三份:第一 PBS緩沖溶液、第二 PBS緩沖溶液和第三PBS緩沖溶液，其中，第一 PBS緩沖溶液和第二 PBS緩沖溶液的體積相同，向第一 PBS緩沖溶液中加入NAMPT重組蛋白，形成濃度為I μ M的第一蛋白溶液，將第一蛋白溶液平均裝入在20支容積為5mL的第一石英管中，將20支第一石英管平均分為兩組:A組、B組。
[0095]向第二 PBS緩沖溶液中加入交聯(lián)NAMPT，配置濃度為I μ M的第二蛋白溶液，將第二蛋白溶液分裝在20支容積為5mL的第二石英管中，將20支第二石英管平均分為兩組:C
組、D組。
[0096] S5:配置濃度為2mM洋薊素，依次向A組的第一石英管中加入洋薊素:向第一支第一石英管中加入O μ L洋薊素、向第二支第一石英管中加入1.5 μ L洋薊素、向第三支第一石英管中加入3 μ L洋薊素、向第四支第一石英管中加入5 μ L洋薊素、向第五支第一石英管中加入7 μ L洋薊素、向第六支第一石英管中加入10 μ L洋薊素、向第七支第一石英管中加入20 μ L洋薊素、向第八支第一石英管中加入25 μ L洋薊素、向第九支第一石英管中加入35 μ L洋薊素、向第十支第一石英管中加入50 μ L洋薊素。每支第一石英管加入洋薊素后，混合均勻，在溫度為20°c的條件靜置反應(yīng)15min，得到第一分析溶液。
[0097]向B組的第一石英管中滴加第三PBS緩沖溶液，滴加的體積依次為O μ L、1.5 μ L、3μ L、5y L、7y L、10y L、20y L、25y L、35y L 和 50 μ L，每支第一石英管加入第三 PBS 緩沖溶液后，混合均勻，在溫度為20°C的條件下靜置15min，得到第一對(duì)照溶液。
[0098]向C組的第二石英管中加入洋薊素:滴加的體積依次為O μ L、l.5 μ L>3 μ L>5 μ L、7 μ L>10 μ L>20 μ L>25 μ L>35 μ L和50 μ L。每支第二石英管加入洋薊素后，混合均勻，在溫度為20°C的條件下靜置15min，得到第二分析溶液。
[0099]向D組的第二石英管中滴加第三PBS緩沖溶液，滴加的體積依次為O μ L、1.5 μ L、3μ L、5y L、7y L、10y L、20y L、25y L、35y L 和 50 μ L，每支第二石英管加入第三 PBS 緩沖溶液后，混合均勻，在溫度為20°C的條件下靜置15min，得到第二對(duì)照溶液。
[0100]S6:使用型號(hào)為HORIBA FM4的熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為280nm的條件下，分別激發(fā)第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液，測(cè)量并記錄第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液在發(fā)射波長(zhǎng)為333nm的熒光強(qiáng)度。
[0101]S7:計(jì)算第一待測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度下降的百分率=(1-第一待分析溶液的熒光強(qiáng)度/第一對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度)X100% ;計(jì)算第二待測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度下降的百分率=(1-第二待分析溶液的 熒光強(qiáng)度/第二對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度)X100%。
[0102]參見圖3所示，為NAMPT重組蛋白的熒光強(qiáng)度百分率與加入洋薊素摩爾量的關(guān)系圖，以及交聯(lián)NAMPT重組蛋白的熒光強(qiáng)度百分率與加入洋薊素摩爾量的趨勢(shì)圖。
[0103]洋薊素加入NAMPT重組蛋白后，NAMPT重組蛋白的熒光強(qiáng)度有所下降，隨著洋薊素加入量的增加，NAMPT重組蛋白的熒光下降百分率降低越明顯，說明洋薊素能夠與NAMPT重組蛋白作用，。
[0104]洋薊素加入交聯(lián)NAMPT后，交聯(lián)NAMPT的熒光強(qiáng)度有所下降，洋薊素加入量越多，交聯(lián)NAMPT的熒光下降百分率降低越明顯，說明洋薊素能夠與交聯(lián)NAMPT作用，因?yàn)榻宦?lián)NAMPT為催化中心被封堵的NAMPT重組蛋白，因此可以說明:洋薊素未能夠與NAMPT催化中心相互作用，但是可以結(jié)合NAMPT催化中心以外的位點(diǎn)結(jié)合，洋薊素能夠做為NAMPT非酶作用抑制劑。
[0105]實(shí)施例3:選擇待選擇抑制劑為1，3- 二咖啡?？鼘幩?。
[0106]S1:制備NAMPT重組蛋白。
[0107]S2:將4mL濃度為200 μ M的NAMPT重組蛋白加入濃度為5mM的Imol 二硫蘇糖醇中，孵育1.5h，得到粗蛋白，采用脫鹽柱除去粗蛋白中的DTT得到預(yù)處理蛋白。
[0108]S3:將預(yù)處理蛋白和160 μ L濃度為IOmM的BMB加入試管，混合均勻，在溫度為22°C的條件下，反應(yīng)5h后，用脫鹽柱除去多余的BMB，得到交聯(lián)NAMPT。
[0109]S4:預(yù)置PBS緩沖溶液，將PBS緩沖溶液分為三份:第一 PBS緩沖溶液、第二 PBS緩沖溶液和第三PBS緩沖溶液，其中，第一 PBS緩沖溶液和第二 PBS緩沖溶液的體積相同，向第一PBS緩沖溶液中加入NAMPT，配置濃度為0.5 μ M的第一蛋白溶液，將第一蛋白溶液平均裝入24支體積為ImL的第一石英管中，將第一石英管平均分為兩組:A組、B組。
[0110]向第二 PBS緩沖溶液中加入交聯(lián)NAMPT，配置濃度為0.5 μ M的第二蛋白溶液，將第二蛋白溶液平均裝入24支體積為ImL的第二石英管中，將第二石英管平均分為兩組:C組、D組。
[0111]S5:配置濃度為2mMl，3_ 二咖啡?？鼘幩崛芤?，向A組的每支第一石英管中加入1，3- 二咖啡?？鼘幩崛芤?向第一支第一石英管中加入O μ LI, 3- 二咖啡酰奎寧酸溶液、向第二支第一石英管中加入0.25 μ LI, 3- 二咖啡?？鼘幩崛芤?、向第三支第一石英管中加入
0.5 μ LI, 3- 二咖啡?？鼘幩崛芤骸⑾虻谒闹У谝皇⒐苤屑尤隝 μ LI, 3_ 二咖啡?？鼘幩崛芤?、向第五支第一石英管中加入1.25 μ LI, 3- 二咖啡酰奎寧酸溶液、向第六支第一石英管中加入1.75 μ LI, 3- 二咖啡酰奎寧酸溶液、向第七支第一石英管中加入2.5 μ LI, 3- 二咖啡?？鼘幩崛芤骸⑾虻诎酥У谝皇⒐苤屑尤?.75 μ LI, 3- 二咖啡?？鼘幩崛芤?、向第九支第一石英管中加入5 μ LI，3- 二咖啡?？鼘幩崛芤骸⑾虻谑У谝皇⒐苤屑尤?br> 5.25 μ LI, 3- 二咖啡?？鼘幩崛芤?、向第十一支第一石英管中加入8.75 μ LI, 3- 二咖啡?？鼘幩崛芤?、向第十二支第一石英管中加入12.5 μ LI, 3- 二咖啡酰奎寧酸溶液。每支第一石英管加入1，3- 二咖啡?？鼘幩崛芤汉缶鶕u勻，在溫度為25°C的條件下靜置lOmin，得到第一分析溶液。
[0112]向B組的每支第一石英管中滴加第三PBS緩沖溶液，滴加的體積依次為O μ L、
0.25yL>0.5yL>lyL>1.25yL>1.75yL>2.5yL>3.75yL>5yL>5.25yL>8.75yL 和12.5 μ L，每支第一石 英管中加入第三PBS緩沖溶液后，混合均勻，在溫度為20°C的條件下靜置lOmin，得到第一對(duì)照溶液。
[0113]向C組的每支第二石英管中加入1，3- 二咖啡?？鼘幩崛芤?滴加的體積依次為0yL>0.25yL>0.5yL>lyL>1.25yL>1.75yL>2.5yL>3.75yL>5yL>5.25yL>8.75yL和12.5μ L。每支第二石英管中加入1，3-二咖啡?？鼘幩崛芤汉?，混合均勻，在溫度為20°C的條件下靜置lOmin，得到第二分析溶液。
[0114]向D組的第支第二石英管中滴加第三PBS緩沖溶液，滴加的體積依次為O μ L、
0.25yL>0.5yL>lyL>1.25yL>1.75yL>2.5yL>3.75yL>5yL>5.25yL>8.75yL 和12.5 μ L，每支第二石英管加入第三PBS緩沖溶液后，混合均勻，在溫度為20°C的條件下靜置lOmin，得到第二對(duì)照溶液。
[0115]S6:使用型號(hào)為HORIBA FM4的熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為280nm的條件下，分別激發(fā)第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液，檢測(cè)并記錄第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液在發(fā)射波長(zhǎng)為315nm~360nm的熒
光強(qiáng)度。
[0116]S7:計(jì)算第一待測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度下降的百分率=(1-第一待分析溶液的熒光強(qiáng)度/第一對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度)X100% ;計(jì)算第二待測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度下降的百分率=(1-第二待分析溶液的熒光強(qiáng)度/第二對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度)X100%。
[0117]參見圖4所示，為NAMPT重組蛋白的熒光強(qiáng)度百分率與加入1，3_ 二咖啡酰奎寧酸摩爾量的關(guān)系圖，以及交聯(lián)NAMPT的熒光強(qiáng)度百分率與加入1，3-二咖啡?？鼘幩崮柫康内厔?shì)圖。
[0118]I, 3- 二咖啡?？鼘幩峒尤隢AMPT重組蛋白后，NAMPT重組蛋白的熒光強(qiáng)度有所下降，隨著1，3-二咖啡酰奎寧酸加入量的增加，NAMPT重組蛋白的熒光下降百分率降低越明顯，說明1，3- 二咖啡?？鼘幩崮軌蚺cNAMPT作用。
[0119]1，3_ 二咖啡酰奎寧酸加入交聯(lián)NAMPT后，交聯(lián)NAMPT的熒光強(qiáng)度有所下降，1，3- 二咖啡酰奎寧酸加入量越多，交聯(lián)NAMPT的熒光下降百分率降低越明顯，說明1，3- 二咖啡?？鼘幩崮軌蚺c交聯(lián)NAMPT作用，因?yàn)榻宦?lián)NAMPT為催化中心被封堵的NAMPT重組蛋白，因此可以說明:1，3-二咖啡?？鼘幩嵛茨軌蚺cNAMPT重組蛋白催化中心相互作用，但是能夠與NAMPT催化中心以外的位點(diǎn)結(jié)合，I, 3- 二咖啡?？鼘幩崮軌蜃鰹镹AMPT非酶作用抑制劑。
[0120]實(shí)施例4，選擇待選抑制劑為FK866。
[0121]S1:制備NAMPT重組蛋白。
[0122]S2:將2mL濃度為200 μ M的NAMPT重組蛋白加入1.6mL濃度為5mM的DTT ( 二硫蘇糖醇)中，孵育lh，得到粗蛋白，采用脫鹽柱除去粗蛋白中的DTT得到預(yù)處理蛋白。
[0123]S3:將預(yù)處理蛋白和80 μ L濃度為IOmM的BMB交聯(lián)試劑加入試管，混合均勻，在溫度為25°C的條件下，反應(yīng)2h后，用脫鹽柱除去多余的BMB，得到交聯(lián)NAMPT。
[0124]S4:預(yù)置PBS緩沖溶液，將PBS緩沖溶液分為三份:第一 PBS緩沖溶液、第二 PBS緩沖溶液和第三PBS緩沖溶液，其中，第一 PBS緩沖溶液和第二 PBS緩沖溶液的體積相同，向第一 PBS緩沖溶液中加入NAMPT重組蛋白，配置濃度為0.5 μ M的第一蛋白溶液，將第一蛋白溶液平均裝入30支體積為2mL的第一石英管中，將第一石英管平均分為兩組:A組、B組。
[0125]向第二PBS緩沖溶液中加入交聯(lián)NAMPT，配置濃度為0.5 μ M的第二蛋白溶液，將第二蛋白溶液平均裝入30支體積為2mL的第二石英管中，將第二石英管平均分為兩組:C組、D組。
[0126]S5:配置濃度為lmMFK866，向A組的第一石英管中加入FK866:向第一支第一石英管液中加入0mLFK866、向第二支第一石英管中加入0.5 μ LFK866、向第三支第一石英管中加入luLFK866、向第四支第一石英管中加入1.5yLFK866、向第五支第一石英管中加入2μ LFK866、向第六支第一石英管中加入3μ LFK866、向第七支第一石英管中加入4yLFK866、向第八支第一石英管中加入5yLFK866、向第九支第一石英管中加入7μ LFK866、向第十支第一石英管中加入10μ LFK866、向第十一支第一石英管中加入15μ LFK866、向第十二支第一石英管中加入20μ LFK866、向第十三支第一石英管中加入25 μ LFK866、向第十四支第一石英管中加入35 μ LFK866、向第十五支第一石英管中加入50 μ LFK866。每支第一石英管加入FK866后，混合均勻，在溫度為20°C的條件下靜置lOmin，得到第一分析溶液。
[0127]向B組的每份第一蛋白溶液中滴加第三PBS緩沖溶液，滴加的體積依次為O μ L、
0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、3μL、4μL、5μL、7μL、10μL、15μL、20μL、25μL、35μL和50 μ L，每支第一石英管加入PBS緩沖溶液后，混合均勻，在溫度為20°C的條件下靜置IOmin,得到第一對(duì)照溶液。
[0128]向C組的每份第二蛋白溶液中加入FK866:滴加的體積依次為O μ L,0.5 μ L、1 μ L、
1.5μ L、2y L、3y L、4 y L、5y L、7y L、10y L、15y L、20y L、25y L、35y L 和 50 μ L0 每支第二石英管加入FK866后，混合均勻，在溫度為20°C的條件下靜置lOmin，得到第二分析溶液。
[0129]向D組的每份第二蛋白溶液中滴加第三PBS緩沖溶液，滴加的體積依次為O μ L、0.5yL>lyL>1.5yL>2yL>3yL>4yL>5yL>7yL>10yL>15yL>20yL>25yL>35yL 和
50 μ L，每支第二石英管加入第三PBS緩沖溶液后，混合均勻，在溫度為20°C的條件下靜置IOmin,得到第二對(duì)照溶液。
[0130]S6:使用型號(hào)為HORIBA FM4的熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為280nm的條件下，分別激發(fā)第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液，檢測(cè)并記錄第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液在發(fā)射波長(zhǎng)為315nm~360nm的熒光強(qiáng)度；
[0131]S7:計(jì)算第一待測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度下降的百分率=(1-第一待分析溶液的熒光強(qiáng)度/第一對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度)X100% ;計(jì)算第二待測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度下降的百分率=(1-第二待分析溶液的熒光強(qiáng)度/第二對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度)X100%。
[0132]參見圖5所示，為NAMPT重組蛋白的熒光強(qiáng)度百分率與加入FK866摩爾量的關(guān)系圖，以及交聯(lián)NAMPT重組蛋白的熒光強(qiáng)度百分率與加入FK866摩爾量的趨勢(shì)圖。
[0133]FK866加入NAMPT重組蛋白后，NAMPT重組蛋白的熒光強(qiáng)度有所下降，隨著FK866加入量的增加，NAM PT重組蛋白的熒光下降百分率降低越明顯，說明FK866能夠與NAMPT重組蛋白作用。
[0134]FK866加入交聯(lián)NAMPT后，交聯(lián)NAMPT的熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定，交聯(lián)NAMPT的熒光下降百分率沒有降低，說明FK866不能與交聯(lián)NAMPT作用，因此可以說明:FK866只能與NAMPT重組蛋白的催化中心結(jié)合，不能與NAMPT重組蛋白其他的位點(diǎn)結(jié)合。FK866是已知的一個(gè)NAMPT催化作用抑制劑，采用我們建立的方法，獲得結(jié)果與此相符。
[0135]本發(fā)明不局限于上述實(shí)施方式，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本說明書中未作詳細(xì)描述的內(nèi)容屬于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)。
【權(quán)利要求】
1.一種制備交聯(lián)NAMPT及篩選NAMPT抑制劑的方法，其特征在于，包括以下步驟: 51、制備NAMPT重組蛋白； 52、按照摩爾份，將1份NAMPT重組蛋白加入20~100份還原劑中；在溫度為20°C~25°C的條件下孵育0.5h~1.5h，得到粗蛋白；采用脫鹽柱除去粗蛋白中的還原劑，得到預(yù)處理蛋白； 53、按照摩爾份，將1份預(yù)處理蛋白與2~5份1，4-雙(馬來酰亞胺基)丁烷混合均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下靜置反應(yīng)Ih~5h，采用脫鹽柱除去未反應(yīng)的1,4-雙(馬來酰亞胺基)丁烷，得到交聯(lián)NAMPT ； 54、預(yù)置PBS緩沖溶液，將PBS緩沖溶液分為3份:第一PBS緩沖溶液、第二 PBS緩沖溶液、第三PBS緩沖溶液，所述第一 PBS緩沖溶液和第二 PBS緩沖溶液的體積相同； 向第一 PBS緩沖溶液中加入NAMPT重組蛋白，形成濃度小于50 μ M的第一蛋白溶液；將第一蛋白溶液平均裝入偶數(shù)支容積為500 μ L~2mL的第一石英管中，將所述第一石英管平均分為2組:A組、B組； 向第二 PBS緩沖溶液中加入交聯(lián)NAMPT，配置濃度與第一蛋白溶液相同的第二蛋白溶液；將第二蛋白溶液平均裝入偶數(shù)支容積為500μ L~2mL的第二石英管中，每支第二石英管中的第二蛋白溶液的體積，與每支第一石英管中第一蛋白溶液的體積相等，將所述第二石英管平均分為兩組:C組、D組； 55、配置濃度為0.5mM~1.5mM的待選擇抑制劑溶液，向A組的每支第一石英管中加入體積不一的待選擇抑制劑溶液，每支第一石英管中第一蛋白溶液的NAMPT重組蛋白的摩爾量:待選擇抑制劑溶液的摩爾量為1:0~1:100 ;每支第一石英管加入待選擇抑制劑溶液后混合均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下，靜置5min~15min，得到第一待分析溶液； 向B組的每支第一石英管中加入體積不一的第三PBS緩沖溶液，每支第一石英管中第三PBS緩沖溶液的體積，與A組對(duì)應(yīng)的第一石英管中待選擇抑制劑溶液的體積相同，每支第一石英管加入第三PBS緩沖溶液后混合均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下，靜置5min~15min,得到第一對(duì)照溶液； 向C組的每支第二石英管中加入體積不一的待選擇溶液，每支第二石英管中待選擇抑制劑溶液的體積，與A組對(duì)應(yīng)的第一石英管中待選擇抑制劑溶液的體積相同，混合均勻，每支第二石英管加入待選擇抑制劑溶液后混合均勻后，在溫度為20°C~25°C的條件下，靜置5min~15min，得到第二待分析溶液； 向D組的每支第二石英管中加入體積不一的第三PBS緩沖溶液，每支第二石英管中第三PBS緩沖溶液的體積，與A組對(duì)應(yīng)的第一石英管中待選擇抑制劑溶液的體積相同，每支第二石英管加入第三PBS緩沖溶液后，混合均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下，靜置5min~15min,得到第二對(duì)照溶液； 56、使用熒光光譜儀測(cè)定第一待分析溶液的熒光強(qiáng)度、第一對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度、第二待分析溶液的熒光強(qiáng)度、第二對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度； 57、根據(jù)第一待分析溶液的熒光強(qiáng)度和第一對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度，計(jì)算第一待分析溶液熒光強(qiáng)度下降的百分率；根據(jù)第二待分析溶液的熒光強(qiáng)度和第二對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度，計(jì)算第二待分析溶液熒光強(qiáng)度下降的百分率。
2.如權(quán)利要求1所述的 制備交聯(lián)NAMPT及篩選NAMPT抑制劑的方法，其特征在于:所述待選擇抑制劑為迷迭香酸、洋薊素、1，3- 二咖啡?？鼘幩峄騀K866。
3.如權(quán)利要求1所述的制備交聯(lián)NAMPT及篩選NAMPT抑制劑的方法，其特征在于:步驟S2中所述還原劑為二硫蘇糖醇或三(2-羧乙基)膦。
4.如權(quán)利要求1所述的制備交聯(lián)NAMPT及篩選NAMPT抑制劑的方法，其特征在于，步驟S2包括以下步驟:按照摩爾份將1份NAMPT重組蛋白加入濃度為ImM~5mM的30份二硫蘇糖醇中，在溫度為20°C~25°C的條件下孵育lh，得到粗蛋白，采用脫鹽柱除去粗蛋白中未反應(yīng)的二硫蘇糖醇得到預(yù)處理蛋白。
5.如權(quán)利要求1所述的制備交聯(lián)NAMPT及篩選NAMPT抑制劑的方法，其特征在于，步驟S3包括以下步驟:將1，4-雙(馬來酰亞胺基)丁烷溶解于二甲基亞砜中，形成濃度為IOmM的1，4-雙(馬來酰亞胺基)丁烷溶液，取120 μ LI, 4-雙(馬來酰亞胺基)丁烷溶液與預(yù)處理蛋白混合均勻后，在溫度為20°C~25°C的條件下反應(yīng)2h，采用脫鹽柱除去未反應(yīng)的1，4-雙(馬來酰亞胺基)丁烷，得到交聯(lián)NAMPT。
6.如權(quán)利要求1所述的制備交聯(lián)NAMPT及篩選NAMPT抑制劑的方法，其特征在于，步驟S4包括以下步驟:預(yù)置PBS緩沖溶液，將PBS緩沖溶液分為3份:第一 PBS緩沖溶液、第二 PBS緩沖溶液、第三PBS緩沖溶液，所述第一 PBS緩沖溶液和第二 PBS緩沖溶液的體積相同； 向第一 PBS緩沖溶液中加入NAMPT重組蛋白，配置濃度為0.5 μ M的第一蛋白溶液；將第一蛋白溶液平均分裝于偶數(shù)支第一石英管中，將第一石英管平均分為兩組:Α組、B組； 向第二 PBS緩沖溶液中加入交聯(lián)ΝΑΜΡΤ，配置濃度為0.5 μ M的第二蛋白溶液；將第二蛋白溶液拼接分裝于偶 數(shù)支第二石英管中，將第二石英管平均分為兩組:C組、D組。
7.如權(quán)利要求1所述的制備交聯(lián)NAMPT及篩選NAMPT抑制劑的方法，其特征在于，步驟S5包括以下步驟:配置濃度為0.5mM的待選擇抑制劑溶液，向A組的第一石英管中依次加入體積不一的待選擇抑制劑溶液，每支第一石英管中第一蛋白溶液的NAMPT重組蛋白的摩爾量:待選擇抑制劑溶液的摩爾量為1:0~1:100 ;將每支第一石英管加入待選擇抑制劑后，混合均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下，靜置lOmin，得到第一待分析溶液； 向B組的第一石英管中依次加入體積不一的第三PBS緩沖溶液，第三PBS緩沖溶液的體積與加入A組的待選擇抑制劑溶液的體積對(duì)應(yīng)相等，每支第一石英管加入第三PBS緩沖溶液后，混合均勻，在溫度為20°C~25°C的條件下，靜置lOmin，得到第一對(duì)照溶液。
8.如權(quán)利要求1所述的制備交聯(lián)NAMPT及篩選NAMPT抑制劑的方法，其特征在于，步驟S6包括以下步驟:使用熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為280nm的條件下，分別激發(fā)第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液，檢測(cè)并記錄第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液的發(fā)射波長(zhǎng)為315nm~360nm的熒光強(qiáng)度； 或者使用熒光光譜儀，在激發(fā)波長(zhǎng)為280nm的條件下，分別激發(fā)第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液，檢測(cè)并記錄第一待分析溶液、第一對(duì)照溶液、第二待分析溶液和第二對(duì)照溶液的發(fā)射波長(zhǎng)為333nm的熒光強(qiáng)度。
9.如權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述的制備交聯(lián)NAMPT及篩選NAMPT抑制劑的方法，其特征在于:所述步驟S7中所述計(jì)算第一待分析溶液熒光強(qiáng)度下降的百分率的公式為:第一待分析溶液熒光強(qiáng)度下降百分率=(1-第一待分析溶液的熒光強(qiáng)度/第一對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度)X 100% ;所述計(jì)算第二待分析溶液熒光強(qiáng)度下降的百分率的公式為:第二待分析溶液熒光強(qiáng)度下降百分率=(1-第二待分析溶液的熒光強(qiáng)度/第二對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度)X100%。
10.一種用于篩選NAMPT抑制劑的交聯(lián)NAMPT，其特征在于:采用權(quán)利要求1中的步驟S1、S2和S3制成。
【文檔編號(hào)】C12Q1/48GK103898076SQ201410061169
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
【發(fā)明者】董旭, 唐淳 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所