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      優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒orf2基因的nls序列的制作方法

      文檔序號:470210閱讀:390來源:國知局
      優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒orf2基因的nls序列的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明公開了優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒ORF2基因的NLS序列,所述NLS序列為SEQIDNO.1。所述優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒ORF2基因在大腸桿菌中表達(dá)。本發(fā)明采用以上技術(shù)方案,通過優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒ORF2基因的NLS序列,使優(yōu)化后的豬圓環(huán)病毒ORF2基因能夠在大腸桿菌中成功獲得表達(dá)。
      【專利說明】優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2基因的NLS序列
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】,特別涉及優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2基因的NLS序列。
      【背景技術(shù)】
      [0002]豬圓環(huán)病毒(PCV)是一種小的、二十面體對稱、無囊膜、共價(jià)閉合、單股環(huán)狀DNA病毒,是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原。根據(jù)PCV的致病性及全基因組序列,可分為兩個(gè)血清型:PCV1與PCV2。PCV2含有兩個(gè)主要開放閱讀框ORFl和0RF2。其中0RF2為702bp,編碼233個(gè)氨基酸,是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,具有良好的免疫原性,是構(gòu)建重組疫苗的首選基因。
      [0003]PVC2的0RF2基因編碼Cap蛋白,為病毒的外殼蛋白。Cap蛋白是病毒的主要抗原。市場上已經(jīng)有以Cap蛋白為主要成份的疫苗產(chǎn)品。目前用做疫苗的Cap蛋白主要由昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)。還未見微生物發(fā)酵生產(chǎn)的疫苗產(chǎn)品。
      [0004]大腸桿菌是得 到廣泛應(yīng)用的蛋白生產(chǎn)菌種。Cap蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)已經(jīng)有不少研究報(bào)道。如,孫繼國2009,查振林2005,周倫江2008,陳德坤2010,zhangGaiping2012。但所有上述報(bào)道均未能表達(dá)0RF2的全長序列。目前認(rèn)為,其原因是Cap蛋白在N端有一段NLS (nuclear localizat1n signal,核定位信號,核定位信號是另一種形式的信號肽,可位于多肽序列的任何部分)序列,含有大腸的稀有密碼子。
      [0005]在研究人員的努力下,已有少數(shù)研究組成功的在大腸桿菌中成功的表達(dá)了 0RF2基因。Celer2007報(bào)道,成功的在大腸桿菌的特殊菌種BL21-C0D0N-PLUS中表達(dá)了 0RF2全長基因。其成功在于運(yùn)用了特殊的菌種,這種菌種被插入了多個(gè)野生型大腸桿菌不具備的稀有密碼子基因。另一個(gè)技術(shù)路徑是通過改變原0RF2基因的密碼子使用方法,得到優(yōu)化的適于在大腸桿菌中表達(dá)的基因。Bumba2009首先報(bào)道了一個(gè)優(yōu)化的序列(Genbank EU376523),使得Cap蛋白在大腸桿菌BL21中獲得了 10mg/L的表達(dá)量。Huang2012等人又報(bào)道了一個(gè)優(yōu)化的序列(Genbank AY885225),同樣獲得了全長蛋白的成功表達(dá)。這兩個(gè)序列是目前已知的僅有的兩個(gè)優(yōu)化的0RF2-NLS序列。
      [0006]而從生產(chǎn)毒株獲得的PCV2-0RF2基因的編碼序列。克隆到大腸桿菌的表達(dá)質(zhì)粒PET28a上。初步的實(shí)驗(yàn)證明克隆的全長0RF2基因不能在大腸中表達(dá)。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0007]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足,本發(fā)明的目的為提供能夠使全長0RF2基因在大腸桿菌中表達(dá)的優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2基因的NLS序列。
      [0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
      [0009]優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2基因的NLS序列,所述NLS序列為SEQ ID N0.1。
      [0010]所述優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2基因在大腸桿菌中表達(dá)。
      [0011]本發(fā)明采用以上技術(shù)方案,通過優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2基因的NLS序列,使優(yōu)化后的豬圓環(huán)病毒0RF2基因能夠在大腸桿菌中成功獲得表達(dá)。【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0012]下面將結(jié)合【專利附圖】
      附圖
      【附圖說明】和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
      [0013]圖1為本發(fā)明優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2基因的表達(dá)載體質(zhì)粒PET28A-0RF2雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳的圖譜(1.PET28A-0RF2經(jīng)雙酶切的電泳條帶;2.PET28A-0RF2未酶切的電泳條帶;3.10bp DNA Ladder Marker);
      [0014]圖2為本發(fā)明優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2基因的表達(dá)菌株BL2l/PET28a_0RF2誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白的Western-blot分析結(jié)果(1.PET28A-0RF2誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白;
      2.PET28A-0RF2 未誘導(dǎo))。
      【具體實(shí)施方式】
      [0015]本發(fā)明的優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2基因的NLS序列,所述NLS序列為SEQ ID N0.1。
      [0016]為便于后續(xù)純化,在本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒0RF2基因的3’末端引入6 XHis標(biāo)簽后,再在其兩端分別引入Ncol和Xhol的酶切位點(diǎn)送生物公司合成此序列。
      [0017]所述優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2基因在大腸桿菌中表達(dá)。
      [0018]為了驗(yàn)證含有本發(fā)明的優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2基因的NLS序列的0RF2基因能夠在大腸桿菌中得到表達(dá),本發(fā)明采用以下試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。 [0019]膠回收試劑盒、質(zhì)粒回收試劑盒均購自生工生物工程(上海)有限公司;Ncol、Xhol、T4DNA Ligase、DL2000核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物、低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)物均購自TaKaRa公司。
      [0020]主要溶液和試劑的配制:
      [0021]I)堿裂解法制備質(zhì)粒PET28a所用溶液:
      [0022]溶液1: 50mM glucose,25mM Tri s-HCl (ρΗ8.0),1mM EDTA (ρΗ8.0)。
      [0023]溶液II:0.2Μ NaOH, 1%SDS (m/v)(現(xiàn)配現(xiàn)用)。
      [0024]溶液III:3MKAC60.0mL,冰醋酸 11.5mL, H2O 定容至 100mL。
      [0025]2)0.1MCaCl2:1.47g CaCl2 溶于 100ml 純水中,滅菌,4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0026]1.質(zhì)粒PET28a_0RF2的小量提取
      [0027]I)取1.5mL菌液于離心管中,12000rpm離心2min,棄上清。
      [0028]2)菌體沉淀重懸于100 μ L溶液I中,室溫下放置5-10min。
      [0029]3)加入新配制的溶液II 200 μ L,蓋緊管口,快速溫和顛倒離心管數(shù)次,混勻,冰浴5min,使細(xì)胞膜裂解。
      [0030]4)加入150 μ L預(yù)冷的溶液III,見白色絮狀沉淀,于冰上放置5min。
      [0031]5) 12000rpm離心10min,上清液移入干凈離心管中,加入等體積(450 μ L)的酚/氯仿,振蕩混勻,12000rpm離心5min。
      [0032]6)小心移出上清(約400 μ L)于一新微量離心管中,加入2倍體積(800 μ L)預(yù)冷的無水乙醇,混勻,室溫放置2_5min, 12000rpm離心10min。
      [0033]7)棄上清,加入1ιΛ70%乙醇洗沉淀一次,12000rpm離心5min。
      [0034]8)吸除上清液,室溫干燥,將沉淀即質(zhì)粒pET28a_0RF2溶于20 μ L TE緩沖液中進(jìn)
      行保存。
      [0035]2.大腸桿菌感受態(tài)BL21細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化[0036]I)挑取BL21單菌落于LB培養(yǎng)基中,37°C培養(yǎng)過夜。
      [0037]2)第二天,按1:100轉(zhuǎn)接到新的LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD6c?為0.3-0.5。
      [0038]3)取 ImL 菌液,冰浴 lOmin, 12000rpm 離心 lmin。
      [0039]4)棄上清,加入ImL0.1M的CaC12,混勻,冰浴30min。
      [0040]5) 12000rpm離心lmin,棄上清,加入100 μ L0.1M的CaCl2,混勻,即為大腸桿菌感受態(tài)BL21細(xì)胞。
      [0041]6)適量DNA立即加入100 μ L制備好的大腸桿菌感受態(tài)BL21細(xì)胞中,冰浴30min。
      [0042]7) 42°C熱擊45s,冰浴2min,再加入500 μ L不含抗生素的LB培養(yǎng)基,37°C培養(yǎng)Ih。
      [0043]8)菌液涂布在含卡納抗性的平板上,37°C培養(yǎng)過夜,次日檢查和驗(yàn)證大腸桿菌感受態(tài)BL21細(xì)胞轉(zhuǎn)化子。
      [0044]3.表達(dá)菌株的構(gòu)建
      [0045]本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒0RF2基因,經(jīng)Ncol和Xhol雙酶切后,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(條件為:1%瓊脂糖凝膠,電壓電泳90v,電泳時(shí)間為25min),然后進(jìn)行切膠,并用膠回收試劑盒回收目的基因0RF2。
      [0046]質(zhì)粒pET28a經(jīng)Ncol和Xhol雙酶切,切膠回收約5300bp左右的質(zhì)粒骨架。
      [0047]用T4DNA連接酶將0RF2與質(zhì)粒骨架連接起來,通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞,得到成功轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌株BL21/PET28a-0RF2。提取表達(dá)菌株中質(zhì)粒PET28A-0RF2經(jīng)Ncol和Xhol雙酶切后,通過瓊脂糖凝膠電泳(條件為:1%瓊脂糖凝膠,電壓電泳90v,電泳時(shí)間為25min)進(jìn)行驗(yàn)證,由圖1中可以看出質(zhì)粒PET28A-0RF2雙酶切后在大約720bp位置有目標(biāo)條帶,說明質(zhì)粒PET28A已經(jīng)成功連接上0RF2,并成功轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21,送去invitrogen公司測序后,測序結(jié)果正確。
      [0048]4.重組蛋白的表達(dá)
      將大腸桿菌工程菌BL21/PET28A-0RF2誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白,進(jìn)行Western-blot分析,具體步驟如下,以I %的接種量轉(zhuǎn)接表達(dá)菌株,培養(yǎng)至0D600約0.6時(shí),加ImM ITPG誘導(dǎo)6h,將誘導(dǎo)后和作為對照未進(jìn)行誘導(dǎo)的陽性菌分別離心重懸于ddH20,以2:1加上樣處理緩沖液(2% SDS, 0.1%溴酚藍(lán)10%甘油)混勻后,沸水煮沸l(wèi)Omin,離心去菌體,取上清液進(jìn)行SDS-PAGE,采用120v電壓,電泳時(shí)間為2h,割膠轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜后,加入5%脫脂牛奶10mL,于37°C封閉Ih ;加組氨酸標(biāo)簽一抗1mL (1:2500稀釋),于4°C孵育過夜(12h以上);加山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶(HRP)抗體1mL (1:2500稀釋)37°C作用lh,在ImL二氨基聯(lián)苯胺(DAB)緩沖液中顯色。從圖2可以看出陽性菌均沒有條帶,而PET28A-0RF2在28kD左右有明顯蛋白條帶,與預(yù)期重組蛋白大小一致,從而說明含有本發(fā)明的優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2基因的NLS序列的0RF2基因能夠成功表達(dá)Cap蛋白。
      【權(quán)利要求】
      1.優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2基因的NLS序列,其特征在于:所述NLS序列為SEQID N0.1o
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒0RF2基因的NLS序列,其特征在于:所述優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒 0RF2基因在大腸桿菌中表達(dá)。
      【文檔編號】C12N15/70GK104031925SQ201410061721
      【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
      【發(fā)明者】呂暾, 陳靈艷, 林拱陽, 陳晟生, 陳先進(jìn), 俞建萍, 黃藝珠 申請人:福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司, 福州大學(xué)
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