一種實(shí)時fret-pcr和巢式pcr檢測和分型立克次氏體的引物、探針及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種實(shí)時FRET-PCR和巢式PCR檢測和分型立克次氏體的引物、探針及試劑盒。所述引物、探針如序列1-8所示。本發(fā)明設(shè)計FRET-PCR的引物和探針，可以特異地擴(kuò)增所有立克次氏體種屬的核酸，從而快速的判斷出陽性樣品；然后選擇相同基因的其他保守區(qū)間設(shè)計巢式PCR的2對引物，并通過巢式PCR、瓊脂糖凝膠電泳和測序確定相應(yīng)陽性樣品的立克次氏體種屬。因此，此系統(tǒng)不僅能快速、特異的檢測到所有種屬的立克次氏體，而且能確定其種屬。
【專利說明】—種實(shí)時FRET-PCR和巢式PCR檢測和分型立克次氏體的引物、探針及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明建立了一套基于檸檬酸合成酶基因、可以對所有立克次氏體的種進(jìn)行檢測和分型的系統(tǒng)。本系統(tǒng)通過實(shí)時FRET-PCR和巢式PCR相結(jié)合的方式而達(dá)到快速檢測和分型所有立克次氏體種的目的。
【背景技術(shù)】
[0002]立克次氏體是一種細(xì)菌，但同時具有病毒的特征，是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生生物，寄生在各種吸血節(jié)肢動物和昆蟲體內(nèi)。人和動物通過被感染立克次氏體的媒介昆蟲叮咬或接觸其糞便而感染，可引起人類和動物發(fā)熱、頭痛和皮疹等臨床癥狀。該病多發(fā)生在熱帶與亞熱帶國家和地區(qū)，目前立克次氏體感染已成為世界性問題。目前我國已將流行性斑疹傷寒、地方性斑疹傷寒等由立克次氏體感染所引起的傳染病列為乙類傳染病。我國存在10種以上立克次氏體感染引起的疾病，如流行性斑疹傷寒、地方性斑疹傷寒、恙蟲病、北亞蜱傳斑點(diǎn)熱、黑龍江蜱傳斑點(diǎn)熱、內(nèi)蒙古蜱傳斑點(diǎn)熱、Q熱、人單核細(xì)胞埃立克體病、人粒細(xì)胞埃立克體病以及巴爾通體病等。立克次氏體嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生性決定了鑒定立克次氏體感染不同于傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)診斷，如不易于分離和培養(yǎng)。立克次氏體在世界范圍內(nèi)檢出率不高且陽性樣品中立克次氏體核酸含量相對較低，亟需一種高效和高靈敏度的檢測方法。
[0003]1.分離培養(yǎng)。對于細(xì)菌性感染，從發(fā)病機(jī)體內(nèi)分離和培養(yǎng)病原體是測定其種屬的常用方法。立克次氏體是一類介于細(xì)菌和病毒之間，更接近于細(xì)菌的原核生物。目前分離培養(yǎng)立克次氏體的常用方法有:(1)細(xì)胞培養(yǎng)。是目前臨床標(biāo)本初步分離立克次氏體使用最廣泛的方法，最常用的細(xì)胞系有L929及vero細(xì)胞。(2)動物接種法。用于初代分離，常用實(shí)驗(yàn)動物有小白鼠、豚鼠、大白鼠、地鼠等。(3)雞胚卵黃囊培養(yǎng)法。作為動物培養(yǎng)的輔助方法，用于動物培養(yǎng)失敗的弱毒株和無毒株培養(yǎng)，也可用于病原體在動物體內(nèi)的傳代接種，它能直接從現(xiàn)場標(biāo)本中分離病原體。由于立克次氏體為嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生，同時感染的人或動物菌血癥時間較短且病原菌含量很低，使得立克次氏體的分離培養(yǎng)較為困難。
[0004]2.血清學(xué)。立克次氏體特異抗體的檢測是WHO推薦的主要診斷技術(shù)之一，然而血清抗體一般在發(fā)病5到10天能夠檢測到，主要是IgM型抗體。單份血清特異抗體明顯高于當(dāng)?shù)卣Ｈ巳貉宓味然螂p份血清發(fā)生血清轉(zhuǎn)換(血清抗體4倍升高)可進(jìn)行明確診斷。血清學(xué)方法通常根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?shí)驗(yàn)條件進(jìn)行。通用的國際標(biāo)準(zhǔn)是間接免疫熒光(IFA)檢測血清抗體。(1)間接免疫熒光(IFA)。主要采用立克次氏體特異抗原檢測感染人或動物血清抗體，且同一抗原片可以同時檢測多種立克次氏體。(2)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CF)。是一種有補(bǔ)體參與并以綿羊紅細(xì)胞和溶血素為指標(biāo)系統(tǒng)的免疫檢測方法。(3)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)0包被抗原通常為重組抗原，可用于急性病例診斷和流行病學(xué)調(diào)查。由于立克次氏體較難分離培養(yǎng)，使得試劑盒中抗原提純不足而使結(jié)果中經(jīng)常出現(xiàn)假陽性或交叉感染。
[0005]3.免疫組化。免疫組化熒光檢測立克次氏體能在血清轉(zhuǎn)化前診斷病人或動物的感染。新鮮組織、福爾馬林固定或石蠟包埋的標(biāo)本均可用于免疫檢測，在普通顯微鏡下觀察到細(xì)胞周圍感染的立克次氏體具有較高的靈敏性和特異性，尤其在沒有熒光顯微鏡的實(shí)驗(yàn)室更加方便。但此方法專業(yè)性較強(qiáng)，且操作繁瑣。
[0006]4.分子生物學(xué)。以PCR擴(kuò)增及測序?yàn)橹饕侄蔚姆肿由飳W(xué)技術(shù)目前已取代病原分離作為直接診斷依據(jù)。PCR技術(shù)包括常規(guī)PCR、巢式PCR和實(shí)時熒光定量PCR(real-timequantitative PCR)。(I)常規(guī)PCR。通常選用屬、群或種特異基因進(jìn)行擴(kuò)增。如立克次氏體屬16SrRNA，斑疹傷寒和斑點(diǎn)熱群17KD、gltA和外膜蛋白o(hù)mpB等。(2)巢式PCR。如17KD、gltA、ompB、56KD巢式PCR分別被用來檢測斑疹傷寒群和斑點(diǎn)熱群、恙蟲病立克次氏體。(3)實(shí)時熒光定量PCR。這是目前檢測病原體最快速、準(zhǔn)確、特異、靈敏的核酸檢測技術(shù)。如根據(jù)gltA基因序列設(shè)計引物和探針建立了斑疹傷寒和斑點(diǎn)熱群立克次氏體的熒光定量PCR檢測技術(shù)。然而，目前的分子診斷方法還不夠成熟。部分通過傳統(tǒng)PCR和瓊脂糖凝膠電泳的檢測方法可以涵蓋所有的立克次氏體種屬，但是操作繁瑣，不適應(yīng)于大量樣本的檢測?，F(xiàn)存的定量PCR僅能檢測立克次氏體的部分種，而且不能區(qū)分有致病性差異的不同種立克次氏體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]1.要解決的技術(shù)問題
[0008]目前立克次氏體的檢測方法如下:1)病原菌的分離和培養(yǎng)。通過從感染人或動物體內(nèi)分離得到立克次氏體，然后接種細(xì)胞等并培養(yǎng)來判斷。但由于立克次氏體的嚴(yán)格胞內(nèi)寄生性使得立克次氏體病原菌的分離和培養(yǎng)較為困難。2)血清學(xué)檢測。用抗原和抗體結(jié)合的理論，通過包被的抗原檢測人或動物的血清抗體來判斷。但由于試劑盒中抗原提純不夠或檢測過程中出現(xiàn)的交叉感染，使結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)假陽性。3)分子生物學(xué)檢測。主要通過PCR方法檢測樣本中有無立克次氏體核酸來判斷。立克次氏體有3個屬、12個種，不同屬和種的立克次氏體的致病性及感染后的預(yù)后明顯不同。因此，我們亟需建立一種快速、精確地檢測并區(qū)分所有種立克次氏體的方法。
[0009]2.技術(shù)方案
[0010]本發(fā)明的原理和最核心的思路是發(fā)明一種高度靈敏、特異、快速檢測和分型所有立克次氏體種的方法體系。同時確保此系統(tǒng)不擴(kuò)增其它非立克次氏體的微生物，尤其是與其相近的其他病原體，如埃里克體、貝納柯克斯體和無形體等。本發(fā)明選擇檸檬酸合成酶基因作為目標(biāo)基因，并選擇相對保守的區(qū)域設(shè)計引物和探針?？傮w的思路是:巧妙地設(shè)計FRET-PCR的引物和探針，可以特異地擴(kuò)增所有立克次氏體種屬的核酸，從而快速的判斷出陽性樣品；然后選擇相同基因的其他保守區(qū)間設(shè)計巢式PCR的2對引物，并通過巢式PCR、瓊脂糖凝膠電泳和測序確定相應(yīng)陽性樣品的立克次氏體種屬。因此，此系統(tǒng)不僅能快速、特異的檢測到所有種屬的立克次氏體，而且能確定其種屬。
[0011](I) FRET-PCR。首先從NCBI上獲得所有立克次氏體種的gltA基因序列，并選擇相對保守的區(qū)間設(shè)計引物(FRET-上游引物和FRET-下游引物)和探針(FRET-6-FAM探針和FRET-LCRed640探針)。然后用該引物和探針對樣品進(jìn)行實(shí)時、定量和快速檢測。對于含有立克次氏體核酸的樣品，在FRET-PCR結(jié)果中其熒光曲線會在640nm處出現(xiàn)或增強(qiáng)，同時在其高分辨率熔解曲線中其熔解峰會出現(xiàn)在不同的溫度處。因此，可以根據(jù)熔解峰溫度區(qū)分貓立克次氏體和其它種的立克次氏體。(2)巢式PCR?；趃ltA基因設(shè)計內(nèi)部和外部2對引物(N-上游引物-1和N-下游引物-1、N-上游引物-2和N-下游引物_2)，然后用此引物對實(shí)時FRET-PCR檢測為陽性的樣品做巢式PCR。首先用外部引物擴(kuò)增目的片段，然后用內(nèi)部引物擴(kuò)增外部引物的PCR產(chǎn)物。將最終的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測序，最后將測序結(jié)果和各個立克次氏體種的標(biāo)準(zhǔn)核酸序列進(jìn)行比對，從而確定其立克次氏體的種。
[0012]從GenBank (www.ncb1.nlm.nih.gov)獲取如下立克次氏體種屬的檸檬酸合成酶基因的序列后，用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法對所有序列進(jìn)行比對:Rickettsia africae U59733, R.akari U59717, R.australis U59718, R.canadensis U59713, R.conorii U59730, R.felis JQ674484, R.helvetica U59723, R.honei AF018074,R.japonica U59724, R.massiliae U59719, R.mongolotimonae U59731, R.montana U74756, R.pakeri U59732, R.rhipicephali U59721, R.rickettsii U59734, R.solvaca U59725, R.thphi U59714, R.hoogstraalii FJ767737, R.japonica AY743327, R.prowazekii U59715。據(jù)此,本發(fā)明設(shè)計的引物和探針為(圖1_8):具體序列如下
[0013](I)定量FRET-PCR引物及探針
[0014]FRET-上游引物:5’-TTRCAAATAGCAATAGAACTTGAAGCT-3，(SEQ ID N0.1)
[0015]FRET-下游引物:5，-ATCCAGCCTACGGTTCTTGCT-3，(SEQ ID N0.2)
[0016]6-FAM 探針:5，-ATCGCTCTTAAAGATGAATATTTTATTGAG-6-FAM-3，(SEQ ID N0.3)
[0017]LCRed640 探針:5’ -LCRed-640-GAAAATTATATCCAAATGTTGATTTTTATTC-磷酸 _3’(SEQ ID N0.4)
[0018](2)巢式 PCR
[0019]N-上游引物-1:5’ -AGTAAATCCAATAATAAAAAATGCKCTTAATA-3’ (SEQ ID N0.5)
[0020]N-下游引物-1:5，-ATTTTCTCTCAATAAAATATTCATCTTTAAG-3，(SEQ ID N0.6)
[0021]N-上游引物-2:5’ -ATGAGCAGAATGCTTCTACTTCAACA-3’ (SEQ ID N0.7)
[0022]N-下游引物-2:5’ -AGCTTCAAGTTCTATTGCTATTTGYAA-3，(SEQ ID N0.8)
[0023]本發(fā)明還提供了用于實(shí)時FRET-PCR和巢式PCR檢測和分型立克次氏體的試劑盒，包括:
[0024]( I)實(shí)時熒光定量PCR試劑
[0025]20 μ I的擴(kuò)增體系包含:10 μ I的樣品DNA模板或者定量標(biāo)準(zhǔn)試劑、IxPCR緩沖液、I μ MFRET-上游引物、I μ M FRET-下游引物、0.2 μ M 的 6-FAM 探針、0.2 μ M 的 LCRed640 探針、2個單位的商業(yè)化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0026](2)巢式PCR試劑
[0027]巢式PCR-外部:
[0028]20 μ I的擴(kuò)增體系包含:10 μ I的樣品DNA模板或者定量標(biāo)準(zhǔn)試劑、IxPCR緩沖液、I μ MN-上游引物_1、1 μ M N-下游引物-1、2個單位的商業(yè)化Taq酶、200 μ M dNTP ；
[0029]巢式PCR-內(nèi)部:
[0030]20 μ I的擴(kuò)增體系包含:10μ I巢式PCR外部引物產(chǎn)物、IxPCR緩沖液、I μ M N-上游引物_2、1μΜ N-下游引物_2、2個單位的商業(yè)化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0031]檸檬酸合成酶-PCR特異性的確定。本發(fā)明的特異性從四個方面得到保證:
[0032]I)設(shè)計的引物和探針經(jīng)過GenBank的BLAST搜索，確認(rèn)本發(fā)明設(shè)計的引物能特異地擴(kuò)增所有的立克次氏體，而不擴(kuò)增其它非立克次氏體尤其是與其相近種屬病原體的核酸。通過BLAST確認(rèn)，F(xiàn)RET-PCR探針和引物及巢式PCR的引物能特異地擴(kuò)增和檢測所有立克次氏體種的核酸；
[0033]2)本發(fā)明檢測貓立克次氏體和傷寒立克次氏體標(biāo)準(zhǔn)品、埃立克體陽性樣品和無形體陽性樣品。結(jié)果表明，本發(fā)明系統(tǒng)可以擴(kuò)增貓立克次氏體和傷寒立克次氏體的核酸，而不擴(kuò)增埃立克體和無形體陽性樣品的核酸；
[0034]3)觀察以上擴(kuò)增對象在PCR過程中熒光強(qiáng)度(640nm)的變化，以及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳的條帶的大小。熒光在640nm波長出現(xiàn)或增強(qiáng)，顯示陽性；在瓊脂糖凝膠電泳中，RT-PCR顯示167堿基對(bp)和巢式PCR外部444bp和內(nèi)部352bp的條帶大?。?br> [0035]4)對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序的結(jié)果和GenBank的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對，從而判定其立克次氏體的種。
[0036]檸檬酸合成酶-PCR靈敏度的確定:由IDT合成立克次氏體中的貓立克次氏體和傷寒立克次氏體檸檬酸合成酶基因的序列。依據(jù)合成物的分子量和絕對重量，計算合成物所含的基因拷貝的絕對數(shù)目。隨后，對合成物進(jìn)行稀釋，制備每IOyl合成物的稀釋試劑含10，000拷貝、1，000拷貝、100拷貝、10拷貝、I拷貝的基因。用本發(fā)明系統(tǒng)擴(kuò)增含不同基因濃度的稀釋液，來確定本發(fā)明檢測此基因的靈敏度。結(jié)果顯示，此發(fā)明可以在反應(yīng)系統(tǒng)中擴(kuò)增單拷貝的目的檸檬酸合成酶基因。
[0037]3.有益效果
[0038]1)本發(fā)明可以特異性地檢測所有的立克次氏體。目前為止，立克次氏體可以分為斑點(diǎn)熱群、傷寒群和恙蟲病立克次氏體3個屬,共12個種，如R.rickettsia、R.akar1、R.conori1、R.sibirica、R.australis、R.felis、R.japonica、R.africae、R.hoogstraali1、R.prowazeki1、R.typhi等。因此,能夠同時檢測到立克次氏體的所有種很重要,尤其對于同源性差別較大的種屬。同時，檢測到所有的種可以更方便的發(fā)現(xiàn)新的立克次氏體的種或株，并及時的更新立克次氏體的分類，從而更好地認(rèn)識該病原體。
[0039]2)本發(fā)明可以對不同種的立克次氏體進(jìn)行分型。不同的立克次氏體種可以引起不同的疫病，如普氏立克次氏體(Rickettsia prowazekii)是流行性斑疫傷寒和斑疫傷寒的病原體，莫氏立克次氏體(Rickettsia mooseri)是地方性斑疹傷寒(也稱鼠型斑疹傷寒)的病原體，立克次氏立克次氏體(Rickettsia rickettsii)是引起落基山斑疫傷寒的病原體，恙蟲病立克次氏體(Rickettsia tsutsugamushi )是恙蟲病(叢林斑疫傷寒)的病原體。因此，確定陽性樣本的立克次氏體的種從而根據(jù)對應(yīng)的病原體特點(diǎn)采取相應(yīng)的治療和控制措施，同時可以根據(jù)不同傳染病的傳染源和傳播途徑采取相應(yīng)的防治措施，從而更好的預(yù)防和控制立克次氏體的感染。
[0040]3)本發(fā)明操作便捷，適合于檢測大量樣本。由于立克次氏體是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生，且感染立克次氏體的人或動物在菌血癥及其后期機(jī)體內(nèi)(如血液)立克次氏體的細(xì)菌含量相對較低，這就需要通過鑒定較多的樣品或極其靈敏的檢測方法來確診感染。在實(shí)際應(yīng)用中，如流行病學(xué)調(diào)查或檢測大量送檢樣品，對于普通PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳等方法需要極大的工作量。而本發(fā)明可以先從大量樣本中篩選出陽性樣本，然后再通過巢式PCR、瓊脂糖凝膠電泳和測序確定其立克次氏體的種。
[0041]立克次氏體是一種細(xì)菌，但其嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生性、缺乏特異性的臨床表現(xiàn)和較短的菌血癥時間等特點(diǎn)決定了立克次氏體檢測不同于傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測。由于檢測時間和樣本量的限制，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測成為主要的檢測手段和方法，尤其是定量FRET-PCR 和巢式 PCR。
[0042]4)本發(fā)明綜合了定量PCR和巢式PCR的優(yōu)點(diǎn)，而摒棄了他們的缺點(diǎn)。本發(fā)明能夠特異、靈敏和快速的檢測所有的立克次氏體且確定相關(guān)陽性樣品的立克次氏體的種，這將為立克次氏體感染的檢測和控制提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1.本發(fā)明的定量FRET-PCR的上游引物。FRET-上游引物序列:5 ‘-TTRCAAATAGCAATAGAACTTGAAGCT-3 ’( 27bp )，其中有一個兼并堿基R。此兼并堿基R可以同時擴(kuò)增A和G堿基，所以R.hoogstraalii有一個錯配堿基,而其他種的立克次氏體和此引物完全吻合。
[0044]圖2.本發(fā)明的定量FRET-PCR的下游引物。FRET-下游引物序列:5’ -ATCCAGCCTACGGTTCTTGCT-3’(21bp)，此序列為圖中獲得序列對稱鏈的核苷酸序列。在立克次氏體的所有種中，R.prowazekii和R.typhi有I個錯配，R.helvetica有2個錯配。
[0045]圖3.本發(fā)明的定量FRET-PCR的6-FAM探針。6-FAM探針序列為:5 ‘-ATCGCTCTTAAAGATGAATATTTTATTGAG-6-FAM-3’(21bp)，在其3’端標(biāo)記有熒光激發(fā)基團(tuán)。此探針在R.canadensis 和 R.slovaca 有 I 個錯配，在 R.prowazekii 和 R.typhi 有 2 個錯配，而和其他種的立克次氏體完全吻合。
[0046]圖4.本發(fā)明的定量FRET-PCR的LCRed640探針。FRET-PCR中LCRed640探針的核苷酸序列:5 ‘ -LCRed-640-GAAAATTATATCCAAATGTTGATTTTTATTC-磷酸-3 ’( 3 Ibp )，其 5 ’端標(biāo)記640熒光接受基團(tuán)，3’端標(biāo)記磷酸基團(tuán)阻止其在PCR反應(yīng)體系中繼續(xù)向下延伸。此段引物序列和所有種的立克次氏體檸檬酸合成酶基因完全相同。
[0047]圖5.本發(fā)明的巢式PCR的N-上游引物-1。巢式PCR外部引物N-上游引物-1的核苷酸序列為:5’ -AGTAAATCCAATAATAAAAAATGCKCTTAATA-3’(32bp)，且引物中含有一個兼并堿基K。兼并堿基K可以同時擴(kuò)增堿基G和T，使得引物可以涵蓋更多的立克次氏體種屬。引物在R.canadensis中有2個錯配堿基,而與其他種的立克次氏體的核苷酸序列完全吻合。
[0048]圖6.本發(fā)明的巢式PCR的N-下游引物-1。巢式PCR中外部引物N-下游引物-1的核苷酸序列為:5’ -ATTTTCTCTCAATAAAATATTCATCTTTAAG-3’( 3Ibp)，此引物序列為圖中獲得核苷酸鏈的對稱鏈序列。此引物是巢式PCR擴(kuò)增外面部分的下游引物,其在R.prowazekii中有I個錯配堿基，而與其他立克次氏體種對應(yīng)gltA基因核苷酸的序列全部相同。
[0049]圖7.本發(fā)明的巢式PCR的N-上游引物_2。此巢式PCR內(nèi)部上游引物N-上游引物_2的核苷酸序列為:5’ -ATGAGCAGAATGCTTCTACTTCAACA-3’，長26個核苷酸。此引物在R.felis和R.canadensis中分別有I個錯配喊基，在R.hoogstraalii中有2個錯配喊基。
[0050]圖8.本發(fā)明的巢式PCR的N-下游引物-2。此巢式PCR內(nèi)部引物N-下游引物_2的核苷酸序列為:5’ -AGCTTCAAGTTCTATTGCTATTTGYAA-3’，其長27個堿基，同時含有一個兼并堿基Y。此兼并堿基Y可以同時擴(kuò)增堿基C和T。此引物為下游引物，其序列為圖中核苷酸鏈的對稱鏈的核苷酸序列。除兼并堿基位點(diǎn)外，此引物和R.hoogstraalii有I個錯配堿基。
[0051]圖9.本發(fā)明中立克次氏體的熔解曲線。本發(fā)明結(jié)束后，對于不同種的立克次氏體，其熔解曲線中熔解峰的溫度會不同。如圖表示貓立克次氏體、陰性對照和其它種立克次氏體的熔解曲線中的熔解峰?？梢酝ㄟ^熔解峰溫度的不同初步判斷立克次氏體的種屬。如圖所示，貓立克次氏體溶解峰溫度為61.9°C,而其它種的立克次氏體溶解峰溫度為57.9℃。
[0052]圖10.實(shí)施例1 中 ompB-F 和 ompB-R 引物。文章 “Molecular evidence ofRickettsia felis infection in dogs from northern territory, Australia，，(Hii SFet al., Parasit Vectors.2011 ;4:198)中的 ompB-F 和 ompB-R 引物。該文章的引物只能檢測貓立克次氏體的核酸，而不能涵蓋立克次氏體其他種屬。
[0053]圖11.實(shí)施例1 中引物 CS-78、CS-323、CS-239 和 CS-1069 以及引物 CS-5 和CS-6。(I)文章“A novel Rickettsia infecting Amblyomma dubitatum ticks inBrazil^ (Almeida AP et al.，Ticks Tick Borne Dis.2011; 2 (4):209-212)中的引物CS-78,CS-323,CS-239和CS-1069。此套引物需要和瓊脂糖凝膠電泳相結(jié)合，這會加大檢測時的工作量，尤其是面對大量樣本。
[0054](2)文章“Rickettsia Species Infecting Amblyomma cooperi Ticks froman Area in the State of Sa ~o Paulo, Brazil, Where Brazilian Spotted Fever IsEndemic^dabruna MB et al.,J Clin Microbiol.2004; 42 (I):90-98.)中的引物 CS-5 和CS-6。此文章中的引物和探針只是檢測到了蜱中立克次氏體的存在，并沒有通過更多動物種類樣品的檢測。
[0055]圖12:本發(fā)明定量FRET-PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳的條帶位置。圖中共11個泳道，其中I泳道為標(biāo)準(zhǔn)品，8泳道為陰性樣品，其余泳道為陽性樣品。本試驗(yàn)所使用的標(biāo)準(zhǔn)品條帶大小如圖標(biāo)注，從下到上依次為IOObp，250bp, 500bp, 750bp等。本發(fā)明中FRET-PCR產(chǎn)物的條帶大小為167bp。
[0056]圖13.本發(fā)明巢式PCR內(nèi)部引物和外部引物PCR產(chǎn)物的條帶位置。巢式PCR用內(nèi)外兩對引物分兩步擴(kuò)增目的條帶，首先用外部引物擴(kuò)增目的片段，然后用其產(chǎn)物作為模板并用內(nèi)部引物擴(kuò)增。圖中共12個泳道，其中1、12泳道是標(biāo)準(zhǔn)品，2-6泳道為外部引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，7-11泳道為內(nèi)部引物擴(kuò)增產(chǎn)物。在樣品中，2 (7)、5 (10),6 (11)泳道為陽性樣品，3 (8)、4 (9)泳道為陰性樣品。本試驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)品的條帶大小如圖所示，從下到上依次為lOObp，250bp, 500bp, 750bp等。巢式PCR產(chǎn)物中，外部產(chǎn)物的條帶大小為444bp，而內(nèi)部產(chǎn)物的條帶大小為352bp。
【具體實(shí)施方式】
[0057]1.立克次氏體PCR檢測方法所用引物和探針的核苷酸序列如下:
[0058](1) FRET-PCR
[0059]FRET-上游引物:5 ’ -TTRCAAATAGCAATAGAACTTGAAGCT-3 ’
[0060]FRET-下游引物:5 ’ -ATCCAGCCTACGGTTCTTGCT-3 ’
[0061 ]6-FAM 探針:5，-ATCGCTCTTAAAGATGAATATTTTATTGAG-6-FAM-3，
[0062]LCRed640 探針:5，-LCRed640_GAAAATTATATCCAAATGTTGATTTTTATTC-磷酸-3，
[0063](2)巢式 PCR
[0064]N-上游引物-1:5 ’ -AGTAAATCCAATAATAAAAAATGCKCTTAATA-3 ’[0065]N-下游引物-1:5’ -ATTTTCTCTCAATAAAATATTCATCTTTAAG-3’
[0066]N-上游引物-2:5 ’ -ATGAGCAGAATGCTTCTACTTCAACA-3 ’
[0067]N-下游引物-2:5’ -AGCTTCAAGTTCTATTGCTATTTGYAA-3’
[0068]2.制備PCR用的標(biāo)準(zhǔn)定量試劑。由IDT合成立克次氏體種屬(貓立克次氏體、傷寒立克次氏體)的基因gltA的序列。依據(jù)合成物的分子量和絕對重量，計算合成物所含的基因拷貝的絕對數(shù)目。隨后，對合成物進(jìn)行稀釋，制備每?ο μ I合成物的稀釋試劑分別含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝、I拷貝的基因，作為PCR用的標(biāo)準(zhǔn)定量試劑；
[0069]3.制備待檢樣品的DNA模板。本發(fā)明所用的檢測模板包括人全血、犬全血、跳蚤、蜱、虱子以及蚊子。
[0070]I)從貓和犬身上采集跳蚤、蜱和虱子經(jīng)種屬鑒定后，以單個個體保存于含有400ul核酸保護(hù)劑的試管中，經(jīng)PRECELLUS粉碎器60秒粉碎后，用商業(yè)化核酸提取試劑盒對所有樣品進(jìn)行核酸抽提。核酸提取的相關(guān)操作流程按照相應(yīng)試劑盒的使用說明書操作，且最后用 T10Eai (含 IOmM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, ρΗ8.5)洗脫核酸至 IOOul 作為 PCR 擴(kuò)增模板。
[0071]2)收集人和犬的全血樣品于含EDTA的采血管中，用商業(yè)化核酸提取試劑盒對相關(guān)樣品進(jìn)行核酸提純。核酸提取的相關(guān)程序按照相應(yīng)的商業(yè)化試劑盒的使用說明書操作，最后洗脫在200 μ I TltlEai洗脫液中作為PCR的擴(kuò)增模板；
[0072]3)被捕捉的單個蚊子經(jīng)屬種鑒定后，立即保存于含有400微升核酸保護(hù)劑的試管中，經(jīng)PRECELLUS粉碎器30秒粉碎后，用于DNA純化；按照商業(yè)化試劑盒相關(guān)操作說明對粉碎后的蚊子樣品進(jìn)行核酸提純，最后洗脫在80 μ I TltlEai洗脫液中作為PCR的擴(kuò)增模板；
[0073]4.PCR擴(kuò)增體系。
[0074]I)實(shí)時熒光定量PCR
[0075]20 μ I的擴(kuò)增體系包含:10 μ I的樣品DNA模板或者定量標(biāo)準(zhǔn)試劑、IxPCR緩沖液、I μ MFRET-上游引物、I μ M FRET-下游引物、0.2 μ M 的 6-FAM 探針、0.2 μ M 的 LCRed640 探針、2個單位的商業(yè)化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0076]2)巢式 PCR
[0077]巢式PCR-外部:20 μ I的擴(kuò)增體系包含:10 μ I的樣品DNA模板或者定量標(biāo)準(zhǔn)試劑、IxPCR緩沖液、I μ M N-上游引物-1、I μ M N-下游引物-1、2個單位的商業(yè)化Taq酶、200 μ M dNTP ο
[0078]巢式PCR-內(nèi)部:20μ I的擴(kuò)增體系包含:10μ I巢式PCR外部引物產(chǎn)物、IxPCR緩沖液、I μ M N-上游引物_2、1μΜ N-下游引物_2、2個單位的商業(yè)化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0079]5.PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)。
[0080]I) FRET-PCR
[0081]PCR擴(kuò)增包括:預(yù)變性、18個溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)、40個欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒晒猥@得循環(huán)、I個持續(xù)熒光獲得的熔解循環(huán)和I個降溫循環(huán)。預(yù)變性:lX2min@95°C ；18個溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán):6xlsec@95 °C，12seci70 °C,8seci72 °C ；9xlseci95 °C, 12seci68 °C,8seci72 °C ; 3xlseci95 °C，12seci66 °C，8seci72 °C ;40 個欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒晒猥@得循環(huán):40xlseci95°C，8seci57°C (在此收集熒光)，30seci67°C，and30seci72°C ；1 個熔解循環(huán):lxlseci95°C，10sec@38°C，@85°C持續(xù)收集熒光；降溫循環(huán):lxlsec@38°C。
[0082]2)巢式PCR (內(nèi)部和外部巢式PCR兩部分反應(yīng)用以下相同的PCR循環(huán)程序)[0083]PCR擴(kuò)增包括:預(yù)變性、18個溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)、40個欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒晒猥@得循環(huán)和I個降溫循環(huán)。預(yù)變性:lX2min@95 °C ;18個溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán):6xlsec@95 °C , 12seci70 °C,8seci72 °C ；9xlseci95 °C, 12seci68 °C,8seci72°C ; 3xlseci95°C, 12seci66°C，8sec@72°C ;40 個欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒晒猥@得循環(huán):40xlsec@95°C，8seci57°C，30seci67°C，and30seci72°C ;降溫循環(huán):lxlsec@38°C。
[0084]6.PCR結(jié)果的判定。
[0085]DNA模板的制備過程均設(shè)有DNA提取的陰性和陽性對照，隨后的PCR擴(kuò)增對象包括待測樣品的DNA模板、DNA提取的陰性和陽性對照。此發(fā)明有著高度的特異性，不僅能檢測到所有立克次氏體的核酸，而且能夠確定相應(yīng)樣品的立克次氏體種屬。陽性樣品和陽性對照在FRET-PCR的熒光擴(kuò)增曲線中有熒光的出現(xiàn)或增強(qiáng)，且熔解曲線中有熔解峰出現(xiàn)。對于不同種屬的立克次氏體，其熔解峰的溫度會有差異。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中的條帶大小不同，F(xiàn)RET-PCR目的條帶大小出現(xiàn)在167bp，巢式PCR外部產(chǎn)物條帶大小為444bp、內(nèi)部產(chǎn)物為352bp。I) FRET-PCR對于陽性樣品和陽性對照，熒光在640nm出現(xiàn)或增強(qiáng)；在熔解曲線中會有熔解峰出現(xiàn)，且對于貓立克次氏體和其它種的立克次氏體其熔解峰會出現(xiàn)在不同的溫度值處(圖9)。2)巢式PCR首先使用外部引物(N-上游引物-2和N-下游引物-2)擴(kuò)增陽性樣品；然后用外部引物的PCR產(chǎn)物作為模板，用內(nèi)部引物(N-上游引物-1和N-下游引物-1)擴(kuò)增目的核酸。且二者在瓊脂糖凝膠電泳的條帶大小為:外部引物444bp，內(nèi)部引物352bp。
[0086]實(shí)施例1:本發(fā)明檢測方法與相關(guān)分子檢測方法的比較
[0087]本發(fā)明可以快速、準(zhǔn)確、特異的檢測各種物種樣本中的立克次氏體核酸，并確定其立克次氏體的種。
[0088]I)本發(fā)明可以檢測所有的立克次氏體種屬。立克次氏體可以分為斑點(diǎn)熱(spotted fever group SFG)、斑疫傷寒(typhus group)和恙蟲病(scrub typhus group)等，而對于不同的種屬會引起不同的疾病，如普氏立克次氏體(Rickettsia prowazekii)是流行性斑疫傷寒和斑疫傷寒的病原體，莫氏立克次氏體(Rickettsia mooseri)是地方性斑疹傷寒(也稱鼠型斑疹傷寒)的病原體，立克次氏立克次氏體(Rickettsiarickettsii)是落基山斑疹傷寒的病原體，而恙蟲病立克次氏體是恙蟲病(叢林斑疹傷寒)的病原體。目前很多檢測方法只能檢測出斑點(diǎn)熱或者斑疹傷寒，而不能檢測所有的立克次氏體，如 “Molecular evidence of Rickettsia felis infection in dogs fromnorthern territory, Australia，，(Hii SF 等，Parasit Vectors.201 IOctlI; 4:198.do1:10.1186/1756-3305-4-198)中的 ompB-F 和 ompB-R (圖 10.)就只能檢測所有的斑點(diǎn)熱且不能通過PCR熒光發(fā)光來快速判斷樣品是否為陽性，所以操作較為繁瑣。
[0089]2)本發(fā)明可以快速檢測從而減少工作量。對于普通PCR，必須要通過瓊脂糖凝膠電泳來判斷PCR產(chǎn)物中目的條帶的有無，對于從大量樣品中篩選陽性樣品就需要及其繁瑣的工作，由此勢必會影響樣本檢測的速度和準(zhǔn)確性。如“A novel Rickettsia infectingAmblyomma dubitatum ticks in Brazil，，(Almeida AP et al., Ticks Tick BorneDis.2011; 2 (4):209-12)中的引物 CS-78 (forward)和 CS-323 (reverse)及引物 CS-239和CS-1069 (圖11.)就是通過普通PCR和電泳來判斷樣品中是否含有立克次氏體相關(guān)種屬的。[0090]3)本發(fā)明從更多的物種的不同類型的樣品中檢測到了立克次氏體的相關(guān)種屬。對于一種檢測方法需要從來自多種物種的樣本中檢測到目的核酸才更能說明其可行性，為相關(guān)立克次氏感染的檢測和診斷提供技術(shù)支持。如“Rickettsia Speciesinfecting Amblyomma cooperi ticks from an area in the state of Sa ~oPaulo, Brazil, where Brazilian spotted fever is endemic，，(Labruna MB et al.,J ClinMicrobiol.2004; 42 (I):90-98.)中的引物 CS-5 (forward)和 CS-6 (reverse)(圖-11)及探針5，6-FAM d (CATTGTGCCATCCAGCCTACGGT) BHQ-13，只是從蜱中檢測到了立克次氏體種屬的相關(guān)核酸，未能通過其他種類的樣本進(jìn)行確定。
[0091]實(shí)施例3:檢測人血樣中的貓立克次氏體。
[0092]從揚(yáng)州市某醫(yī)院獲取人全血樣品822份，置于含有EDTA的商業(yè)采血管中。然后用商業(yè)核酸提取試劑盒并按照相關(guān)說明書操作對人全血樣品進(jìn)行核酸提取，作為PCR擴(kuò)增模板。然后通過FRET-PCR和巢式PCR相結(jié)合的方式判斷出陽性樣品并確定其立克次氏體的種。結(jié)果顯示，在822份人全血樣品中檢測出1份立克次氏體陽性樣品。這是揚(yáng)州市首次也是中國國內(nèi)首次證實(shí)人感染貓立克次氏體的病例。
[0093]實(shí)施例4:檢測狗血樣中的立克次氏體。
[0094]從云南省昆明市和上海市某動物醫(yī)院和動物門診共采取犬全血146份。其中昆明162份，上海84份。運(yùn)用本發(fā)明對所有樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，有8只犬的樣品感染了立克次氏體。在感染立克次氏體的狗中，有6只來自云南省昆明市，有2只來自上海市。對陽性樣品經(jīng)測序種屬鑒定后發(fā)現(xiàn)，有6個陽性樣品為貓立克次氏體，而另外2個陽性樣品為新的立克次氏體菌株，并且將該新型菌株提交到NCBI(http://www.ncb1.nlm.nih.gov),并獲得了對應(yīng)的編號(GenBank N0.:KJ440515和KJ440516)。這不僅是在昆明市和上海市，同時也是在中國國內(nèi)首次貓立克次氏體的報道，同時也發(fā)現(xiàn)了新的立克次氏體菌株。
[0095]實(shí)施例5:檢測尼加拉瓜犬血樣中的立克次氏體。
[0096]從中美洲加勒比海島國-尼加拉瓜采集39份狗全血樣品，并用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，其中有2只犬感染了立克次氏體，且該立克次氏體屬于貓立克次氏體。這是該國家首次報道貓立克次氏體，同時也是該國家首次在犬血樣中發(fā)現(xiàn)貓立克次氏體。
[0097]實(shí)施例6:檢測哥斯達(dá)黎加的犬血樣中的立克次氏體。
[0098]從中美洲的島國-哥斯達(dá)黎加采集犬全血樣品40份，并用本發(fā)明系統(tǒng)體系檢測其立克次氏體的感染狀況。結(jié)果顯示，樣品全部顯示陰性，即沒有立克次氏體的感染。同時用此40份狗全血樣品,通過埃立克體(Ehrlichia)和無形體(Anaplasma)的引物及探針分別檢測埃立克體和無形體病原體。結(jié)果顯示,感染埃立克體的個體達(dá)36個，同時有3份樣品感染了無形體。此結(jié)果同時也說明了，本發(fā)明不僅可以特異的檢測到所有立克次氏體的種屬，而且不會擴(kuò)增非立克次氏體種屬，尤其是與其同源性較高的種屬，如埃立克體、無形體等。
[0099]實(shí)施例7:檢測跳蚤、蜱、虱子樣本中的立克次氏體。
[0100]從揚(yáng)州市的流浪貓身上采集60只跳蚤，經(jīng)種屬鑒定全部為貓櫛首蚤；從揚(yáng)州市某狗場的商業(yè)狗身上采集146只蜱和47只虱子，經(jīng)種屬鑒定蜱全部為血紅扇頭蜱。用商業(yè)化核酸提取試劑盒對全部樣品進(jìn)行核酸抽提后作為PCR擴(kuò)增模板，然后用本發(fā)明檢測所有樣本。結(jié)果顯示，在60只跳蚤中有57只感染了立克次氏體，且所有的立克次氏體為貓立克次氏體；所有的蜱樣本中有15只為陽性，其中14只為貓立克次氏體，有I只攜帶的立克次氏體為新的菌株(GenBank N0.:KJ440521) ；47只虱子中有6只為陽性，其中有3只為貓立克次氏體，其他3個為新的立克次氏體菌株(GenBank N0.:KJ440517、KJ440518、KJ440522)。這是揚(yáng)州地區(qū)首次報道跳蚤、虱子和蜱感染立克次氏體，同時也是中國國內(nèi)首次從跳蚤、虱子和蜱中檢測到貓立克次氏體的報道，而且發(fā)現(xiàn)了新的立克次氏體菌株。
[0101]實(shí)施例8:檢測蚊子樣本中的立克次氏體。
[0102]從揚(yáng)州市捕捉428只蚊子檢驗(yàn)本發(fā)明方法，從而為本發(fā)明更廣闊的樣本應(yīng)用范圍提供理論支撐。用商業(yè)化核酸提取試劑盒對所有蚊子樣品進(jìn)行核酸提取后，通過本發(fā)明方法檢測蚊子樣本是否攜帶了立克次氏體病原體。結(jié)果表明，在428只蚊子中有153只蚊子攜帶立克次氏體病原體。其中，有150只蚊子攜帶的立克次氏體為貓立克次氏體，而其余的3只蚊子 攜帶了三種新的立克次氏體菌株(GenBank N0.:KJ440519、KJ440520、KJ440523)。這是揚(yáng)州市首次立克次氏體的報道、首次蚊子攜帶立克次氏體的報道，同時也是中國國內(nèi)首次報道貓立克次氏體、首次報道蚊子攜帶貓立克次氏體病原體報道，而且發(fā)現(xiàn)了新的立克次氏體菌株。
【權(quán)利要求】
1.用于實(shí)時FRET-PCR和巢式PCR檢測和分型立克次氏體的引物及探針，其特征在于，由FRET-PCR引物、探針，以及巢式PCR引物組成，所述引物、探針的具體序列如下: (1)FRET-PCR 引物、探針: FRET-上游引物:5’ -1TRCAAATAGCAATAGAACTTGAAGCT-3’ FRET-下游引物:5’ -ATCCAGCCTACGGITCTTGCT-3’
6-FAM 探針:5’ -ATCGCTCTTAAAGATGAATATTTTATTGAG-6-FAM-3’ LCRed640 探針:5’ -LCRed-640-GAAAATTATATCCAAATGTTGATTTTTATTC-磷酸-3’ ； (2)巢式PCR: N-上游引物-1:5’ -AGTAAATCCAATAATAAAAAATGCKCTTAATA-3’ N-下游引物-1:5’ -AnTTCTCTCAATAAAATAITCATCTTTAAG-3’ N-上游引物-2:5’ -ATGAGCAGAATGCTTCTACTTCAACA-3’ N-下游引物-2:5’ -AGCTTCAAGTTCTAITGCTAITTGYAA-3’。
2.用于實(shí)時FRET-P CR和巢式PCR檢測和分型立克次氏體的試劑盒，其特征在于由以下構(gòu)成: .1)實(shí)時熒光定量PCR試劑 . 20 u I的擴(kuò)增體系包含=IOiU的樣品DNA模板或者定量標(biāo)準(zhǔn)試劑、IxPCR緩沖液、IU MFRET-上游引物、I U M FRET-下游引物、0.2 y M 的 6-FAM 探針、0.2 y M 的 LCRed640 探針、2個單位的Taq酶、200 U M dNTP ； . 2)巢式PCR試劑 巢式PCR-外部: .20 u I的擴(kuò)增體系包含=IOiU的樣品DNA模板或者定量標(biāo)準(zhǔn)試劑、IxPCR緩沖液、Iii MN-上游引物-l、lii M N-下游引物_1、2個單位的Taq酶、200 ii M dNTP ； 巢式PCR-內(nèi)部:. 20 u I的擴(kuò)增體系包含:10u I巢式PCR外部引物產(chǎn)物、IxPCR緩沖液、Iii M N-上游引物-2、Iii M N-下游引物_2、2個單位的Taq酶、200 ii M dNTP。
【文檔編號】C12Q1/04GK103789442SQ201410061800
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
【發(fā)明者】王成明, 張繼壘, 陸光武, 張毅 申請人:揚(yáng)州大學(xué)