海馬神經(jīng)元分離和原代培養(yǎng)方法及試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)方法及試劑。本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，改進(jìn)當(dāng)前海馬神經(jīng)元體外分離和培養(yǎng)的方法，解決了海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的增殖性和活性無法保持的問題。本發(fā)明建立了一套比較成熟的體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的方法，本發(fā)明得到的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量充足，生長狀態(tài)較好，能夠從哺乳動物的海馬組織中分離出高活性、高數(shù)量的海馬神經(jīng)細(xì)胞，符合原代海馬細(xì)胞培養(yǎng)的要求，可滿足神經(jīng)科學(xué)研究中細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的需求。
【專利說明】海馬神經(jīng)元分離和原代培養(yǎng)方法及試劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種海馬神經(jīng)細(xì)胞分離與原代培養(yǎng)方法及試劑。
【背景技術(shù)】
[0002]海馬(hippocampal)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，作為神經(jīng)元高度集中的區(qū)域，具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的典型特性，在學(xué)習(xí)、記憶、情緒反應(yīng)及自主神經(jīng)功能等方面發(fā)揮重要作用。神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)模型是研究神經(jīng)元發(fā)育分化、神經(jīng)再生、神經(jīng)疾病的發(fā)生機(jī)制等重要的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元已成為研究阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的重要技術(shù)手段。原代培養(yǎng)(primary culture)是指從活體細(xì)胞獲得細(xì)胞、組織或器官，在體外條件下進(jìn)行的第一次培養(yǎng)。神經(jīng)元原代培養(yǎng)是將胚胎哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部分組織，如海馬組織、大腦皮層、小腦、下丘腦、海馬、脊髓和神經(jīng)叢從機(jī)體直接取出，再接種培養(yǎng)的方法。目前國內(nèi)、外有關(guān)神經(jīng)元培養(yǎng)的方法較多，但在原代培養(yǎng)中神經(jīng)元的純度和產(chǎn)量方面還存在一些急待解決的問題。由于神經(jīng)元是一種高度分化的細(xì)胞，動物出生后很少分裂，相對于其它細(xì)胞而言，神經(jīng)元在體外更難以存活和生長。因此，體外培養(yǎng)神經(jīng)元要求的培養(yǎng)方法和營養(yǎng)條件均較為特殊。
[0003]目前，導(dǎo)致難以獲得足夠數(shù)量和活力的原代海馬神經(jīng)元的因素有以下幾方面:(I)海馬神經(jīng)組織分離過程中，多數(shù)人用D-hanV s或hanV s作為漂洗液，離體哺乳動物海馬組織中去除紅細(xì)胞、被膜及結(jié)締組織等雜質(zhì)，分離過程時間較長，有時候需要2小時以上，在漂洗液中時間會更長，海馬神經(jīng)元即已部分死亡，從而出現(xiàn)假陰性的培養(yǎng)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)上無法開展海馬神經(jīng)元的常規(guī)培養(yǎng)，主要可能是因?yàn)闆]有合適的用于海馬組織標(biāo)本的神經(jīng)元培養(yǎng)用漂洗液/解剖液 之故。在組織分離過程中，即使冰浴，神經(jīng)元依然進(jìn)行著很大程度代謝，hank' s液的無糖環(huán)境對神經(jīng)元分離很不利，在hank' s液中添加DMEM或者高糖來供給大腦的代謝，但葡萄糖濃度太高，易增加細(xì)菌污染的機(jī)會；添加DMEM培養(yǎng)液會堿性化，不利于神經(jīng)元細(xì)胞存活。中國專利CN102978162A“一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)方法及試劑”、中國專利CN102994452A “一種高效分離和培養(yǎng)神經(jīng)元的方法”和中國專利CN102994451A “一種神經(jīng)元分離和培養(yǎng)的改進(jìn)型方法”，取腦組織放入盛有I X PBS的培養(yǎng)皿中，所采用清洗液均為PBS液，DMEM-高糖或DMEM-F12與馬血清來浸泡解剖過程中的大腦，來供給大腦的代謝，考慮到了神經(jīng)元能量代謝需要，但未添加任何抗菌物質(zhì)，葡萄糖濃度太高，就容易增加細(xì)胞污染的機(jī)會。(2)采用大劑量胰蛋白酶消化后，海馬神經(jīng)細(xì)胞勢必受到相當(dāng)程度的生比和機(jī)械損害；細(xì)胞表面的粘附分子或膜蛋白極易受到破壞，對于這類具有立體結(jié)構(gòu)用以維持細(xì)胞增殖及自我更新的細(xì)胞來說，很難迅速恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)，往往伴隨著大范圍的細(xì)胞死亡/凋亡，細(xì)胞“老化”嚴(yán)重，細(xì)胞活力將明顯減弱，組織中不能獲得大量活細(xì)胞；(3)細(xì)胞種植液對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元至關(guān)重要，細(xì)胞種植液不同于接下來的細(xì)胞維持液，需要給予神經(jīng)細(xì)胞特殊的生長因子，這樣才能保證獲得足夠數(shù)量和活力的海馬神經(jīng)元。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明提供了一種哺乳動物的海馬神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)的方法，目的是建立一種簡單易行、高純度的海馬神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)的方法及試劑，滿足神經(jīng)科學(xué)研究的需求。
[0005]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一為:
[0006]本發(fā)明的雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.)WZ002,已于2014年I月22日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為雙歧桿菌(Bif idobacteriumsp.)，保藏編號為 CGMCC N0.88O9。
[0007]本發(fā)明的雙歧桿菌WZ002分離于一名浙江省健康青年人糞便中。
[0008]本發(fā)明的雙歧桿菌WZ002菌株具有下述微生物學(xué)特征:
[0009](I)菌落形態(tài):WZ002菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光澤、表面光滑、凸起、質(zhì)地軟、邊緣整齊，直徑I~1.5_。
[0010](2)個體形態(tài):G+無芽孢桿菌，桿狀。
[0011](3)生理生化特征:D_核糖(+) ;L_阿拉伯糖(+);乳糖(+);纖維二糖㈠；松三糖(+);棉籽糖(+);山梨醇(-);淀粉(-);葡萄糖酸鈉(-);木糖(+);甘露糖(-);果糖(+);半乳糖(+);蔗糖(+);麥芽糖(+);海藻糖(-);密二糖(+);甘露醇(+);菊糖(-);水楊素(-);F6PPK酶⑴；對氧的反應(yīng)(在好氣固體培養(yǎng)基上不生長)；硝酸鹽還原㈠；觸酶㈠；靛基質(zhì)反應(yīng)(一)。
[0012]厭氧下生長良好，有氧環(huán)境中不生長。最適生長溫度37~41°C ;最低生長溫度25~28°C;最高43~45°C;生長最適ρΗ6.5~7.0 ;在ρΗ4.5~5.0或8.0~8.5不生長。
[0013]所述雙歧桿菌(Bifidobacteriumsp.)WZ002, CGMCC N0.8809 應(yīng)用于海馬神經(jīng)元的細(xì)胞種植液中。
[0014]我們實(shí)驗(yàn)過程中意外發(fā)現(xiàn):雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.)WZ002菌株的活性發(fā)酵濾液既能提供營養(yǎng)成分，又可促進(jìn)神經(jīng)元生長，獲取神經(jīng)元的數(shù)量可以滿足實(shí)驗(yàn)的需要。
[0015]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二為:海馬神經(jīng)元的分離、原代培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0016]1.漂洗:取離體哺乳動物的海馬組織，置冰浴的漂洗液中，去除紅細(xì)胞、被膜及結(jié)締組織，用漂洗液沖洗2~5次；
[0017]2.消化:將步驟I漂洗后的海馬組織剪成直徑Imm3小塊，用5倍組織體積的消化液37°C作用5~10分鐘，組織成粥糜狀，用細(xì)胞種植液終止消化，輕輕吹打至組織塊10次以分散細(xì)胞。
[0018]3.制備細(xì)胞懸液:收集步驟2消化后初次細(xì)胞懸液，經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾后，800~1000rpm4°C離心5~10分鐘，棄去上清液，加入細(xì)胞種植液，重懸細(xì)胞，制成5 X IO5~10 X IO5個/mL的單細(xì)胞懸液；
[0019]4.接種、培養(yǎng):將步驟3細(xì)胞懸液種植于預(yù)先鋪好多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，種植后24~72小時換成細(xì)胞維持液，之后每隔兩天用細(xì)胞維持液換液，每次更換的量為原體積的1/2。
[0020]試劑購買:[0021]DMEM/F12神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基和B27購于Gibco公司；多聚賴氨酸、胎牛血清(FBS)、海藻糖和L-谷氨酰胺購于美國Sigma公司；青鏈霉素混合液(雙抗)，購于美國HyClone公司。
[0022]試劑的配置:
[0023](I)所述的D-Hank ' s液，經(jīng)過如下步驟得到:NaC18.0g, KC10.4g,Na2HPO4.12H200.12g，KH2PO40.06g, NaHCO30.35g ;依次將各成分溶解于約 500mL 三蒸水中混勻，加三蒸水定容至1000mL,調(diào)整pH值至7.2~7.4，分裝，高壓滅菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0024](2)所述的漂洗液，經(jīng)過如下步驟得到:2g海藻糖、3g葡萄糖和IOmL雙抗溶于IOOmLD-Hank' s液中，混勻,加D-Hank' s液定容至1000mL, 0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4~6小時，氫氣終濃度達(dá)到為0.5mmol/L，Y射線消毒滅菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0025](3)所述的消化液，經(jīng)過如下步驟得到:1.0g胰蛋白酶和0.1g EDTA溶于IOOmLD-Hank' s液中，混勻，加D-Hank' s液定容至1000mL, 0.22 μ m濾膜過濾除菌,0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4~6小時，氫氣終濃度達(dá)到為0.5mmol/L，Y射線消毒滅菌,分裝,4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0026](4)所述的活性發(fā)酵濾液，經(jīng)過如下步驟得到:
[0027]①雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.) WZ002,該菌株已于2014年I月22日保存于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8809 ；
[0028]②雙歧桿菌WZ002采用改良MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為:以重量計(jì)，取蛋白胨IOg,牛肉膏IOg,酵母膏5g，葡萄糖20g,乙酸鈉5g，K2HP042g, MgSO4.7Η200.5g，MnSO4.4Η200.2g，低聚果糖3g，檸檬酸二銨2g，吐溫_801mL，蒸餾水1L，加熱溶解校正pH值至6.5，115°C高壓滅菌15-20分鐘。
[0029]③將雙歧桿菌WZ002接種于冷卻至40±2°C的步驟②改良MRS培養(yǎng)基中，菌種接種量為0.2~0.5%，35±2°C厭氧培養(yǎng)24小時，用分光光度計(jì)測定上述培養(yǎng)液A58tlnm值為1.2時，將上述培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)數(shù)5000~8500rpm下離心10分鐘后，取上清液，0.22 μ m濾膜過濾除菌，即得到活性發(fā)酵液濾液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0030](5)所述的多聚賴氨酸，經(jīng)過如下步驟得到:IOmg多聚賴氨酸溶于IOmL三蒸水中，混勻，加三蒸水定容至IOOmL, 0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌,分裝,冰凍備用。
[0031](6)所述的細(xì)胞種植液，經(jīng)過如下步驟得到:DMEM/F12培養(yǎng)基加入胎牛血清、活性發(fā)酵濾液和雙抗，使胎牛血清終濃度為10%、活性發(fā)酵濾液終濃度為0.2%，雙抗終濃度為
I%，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0032](J)所述的細(xì)胞維持液,經(jīng)過如下步驟得到:Neurobasal培養(yǎng)基加入B27和谷氨酰胺，使B27終濃度為2 %，谷氨酰胺終濃度I %，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0033](8)所述的雙抗,為青霉素-鏈霉素溶液(100 X),青霉素含量為10000U/mL,鏈霉素含量為10mg/mL。1%雙抗:青霉素含量為100U/mL,鏈霉素含量為0.lmg/mL。
[0034]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0035]1.漂洗步驟中，海馬組織浸潤在氫氣環(huán)境下，最大化減少組織的分離操作對海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷，而且，氫氣具有極強(qiáng)的生物學(xué)活性，最大限度保護(hù)海馬神經(jīng)細(xì)胞不受傷害，可提高了原代海馬神經(jīng)細(xì)胞的存活率和生物活性。[0036]2.漂洗液含有海藻糖，替換常規(guī)使用的蔗糖，蔗糖粘度較大，不利于組織分離操作。海藻糖對生物體具有神奇的保護(hù)作用，在細(xì)胞表面能形成獨(dú)特的保護(hù)膜，有效地保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，維持生命體的生命過程和生物特征，而自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖類，均不具備這一功能。
[0037]3.消化步驟中，采用了富含氫氣的消化液，使得胰蛋白酶與所消化組織充分接觸和作用，氣體攪拌均勻，胰蛋白酶消化效率大大提高，胰蛋白酶使用劑量和經(jīng)歷的時間有所縮短(從原來的10~20分鐘縮短到不超過10分鐘)，同時又增加了海馬神經(jīng)元生理呼吸，氫氣本身又是健康因子，使海馬神經(jīng)元細(xì)胞更多地保持了原有的生物活性。短時間、低濃度胰酶即達(dá)到必要的消化效果，對神經(jīng)元損傷更小，也提高了神經(jīng)元的體外存活率。
[0038]總之，本發(fā)明建立了一套比較成熟的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的方法，即在氫氣環(huán)境下漂洗和酶消化，漂洗液含有保護(hù)功能的海藻糖，低濃度、短時間的酶分離細(xì)胞和含活性發(fā)酵濾液的特殊種植培養(yǎng)基；本發(fā)明得到的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量充足，生長狀態(tài)較好，能夠從哺乳動物的海馬組織中分離出高活性、高數(shù)量的海馬神經(jīng)細(xì)胞，符合海馬細(xì)胞神經(jīng)元原代培養(yǎng)的要求。
【具體實(shí)施方式】
[0039]以下結(jié)合具體實(shí)施例，實(shí)驗(yàn)材料取新生SD大鼠的海馬組織，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0040]實(shí)施例1
[0041]本發(fā)明的雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.)WZ002,已于2014年I月22日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為雙歧桿菌(Bifidobacterium sp),保藏編號為 CGMCC N0.8809。
[0042]本發(fā)明的雙歧桿菌WZ002分離于一名浙江省健康青年人糞便中。
[0043]本發(fā)明的雙歧桿菌WZ002菌株具有下述微生物學(xué)特征:
[0044](1)菌落形態(tài):WZ002菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光澤、表面光滑、凸起、質(zhì)地軟、邊緣整齊，直徑1-1.5_。
[0045](2)個體形態(tài):G+無芽孢桿菌，桿狀。
[0046](3)生理生化特征:D_核糖(+) ;L_阿拉伯糖(+);乳糖(+);纖維二糖㈠；松三糖(+);棉籽糖(+);山梨醇(-);淀粉(-);葡萄糖酸鈉(-);木糖(+);甘露糖(-);果糖(+);半乳糖(+);蔗糖(+);麥芽糖(+);海藻糖(-);密二糖(+);甘露醇(+);菊糖(-);水楊素(-);F6PPK酶⑴；對氧的反應(yīng)(在好氣固體培養(yǎng)基上不生長)；硝酸鹽還原㈠；觸酶㈠；靛基質(zhì)反應(yīng)(_)。
[0047]厭氧下生長良好，有氧環(huán)境中不生長。最適生長溫度37_41°C ;最低生長溫度25-280C ;最高 43-450C ;生長最適 pH6.5-7.0 ;在 ρΗ4.5-5.0 或 8.0-8.5 不生長。
[0048]所述雙歧桿菌(Bifidobacteriumsp.)WZ002, CGMCC N0.8809 應(yīng)用于海馬神經(jīng)元的細(xì)胞種植液中。
[0049]我們實(shí)驗(yàn)過程中意外發(fā)現(xiàn):雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.)WZ002菌株的活性發(fā)酵濾液既能提供營養(yǎng)成分，又可促進(jìn)神經(jīng)元生長，獲取神經(jīng)元的數(shù)量可以滿足實(shí)驗(yàn)的需要。
[0050]實(shí)施例2
[0051]試劑購買:
[0052]DMEM/F12神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基和B27購于Gibco公司；多聚賴氨酸、胎牛血清(FBS)、海藻糖和L-谷氨酰胺購于美國Sigma公司；青鏈霉素混合液(雙抗)，購于美國HyClone公司。
[0053]試劑的配置:
[0054](I)所述的D-Hank ' s液，經(jīng)過如下步驟得到:NaC18.0g, KC10.4g,Na2HPO4.12H200.12g，KH2PO40.06g, NaHCO30.35g ;依次將各成分溶解于約 500mL 三蒸水中混勻，加三蒸水定容至1000mL,調(diào)整pH值至7.2~7.4，分裝，高壓滅菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0055](2)所述的漂洗液，經(jīng)過如下步驟得到:2g海藻糖、3g葡萄糖和IOmL雙抗溶于IOOmLD-Hank' s液中，混勻,加D-Hank' s液定容至1000mL, 0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4~6小時，氫氣終濃度達(dá)到為0.5mmol/L，Y射線消毒滅菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0056](3)所述的消化液，經(jīng)過如下步驟得到:1.0g胰蛋白酶和0.1g EDTA溶于IOOmLD-Hank' s液中，混勻，加D-Hank' s液定容至1000mL, 0.22 μ m濾膜過濾除菌,0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4~6小時，氫氣終濃度達(dá)到為0.5mmol/L，Y射線消毒滅菌,分裝,4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0057](4)所述的活性發(fā)酵濾液，經(jīng)過如下步驟得到:
[0058]①雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.) WZ002,該菌株已于2014年I月22日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8809 ；
[0059]②雙歧桿菌WZ002采用改良MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為:以重量計(jì)，取蛋白胨IOg,牛肉膏IOg,酵母膏5g，葡萄糖20g,乙酸鈉5g，K2HP042g, MgSO4.7Η200.5g，MnSO4.4Η200.2g，低聚果糖3g，檸檬酸二銨2g，吐溫_801mL，蒸餾水1L，加熱溶解校正pH值至6.5，115°C高壓滅菌15-20分鐘。
[0060]③將雙歧桿菌WZ002接種于冷卻至40±2°C的步驟②改良MRS培養(yǎng)基中，菌種接種量為0.2~0.5%，35±2°C厭氧培養(yǎng)24小時，用分光光度計(jì)測定上述培養(yǎng)液A58tlnm值為1.2時，將上述培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)數(shù)5000~8500rpm下離心10分鐘后，取上清液，0.22 μ m濾膜過濾除菌，即得到活性發(fā)酵液濾液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0061](5)所述的多聚賴氨酸，經(jīng)過如下步驟得到:10mg多聚賴氨酸溶于IOmL三蒸水中，混勻，加三蒸水定容至IOOmL, 0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌,分裝,冰凍備用。
[0062](6)所述的細(xì)胞種植液，經(jīng)過如下步驟得到:DMEM/F12培養(yǎng)基加入胎牛血清、活性發(fā)酵濾液和雙抗，使胎牛血清終濃度為10%、活性發(fā)酵濾液終濃度為0.2%，雙抗終濃度為
I%，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0063](J)所述的細(xì)胞維持液,經(jīng)過如下步驟得到:Neurobasal培養(yǎng)基加入B27和谷氨酰胺，使B27終濃度為2 %，谷氨酰胺終濃度I %，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0064](8)所述的雙抗,為青霉素-鏈霉素溶液(100 X),青霉素含量為10000U/mL,鏈霉素含量為10mg/mL。1%雙抗:青霉素含量為100U/mL,鏈霉素含量為0.lmg/mL。
[0065]實(shí)施例3[0066]以SD大鼠海馬神經(jīng)元的分離、原代培養(yǎng)方法包括以下步驟:
[0067]以實(shí)施例1和實(shí)施例2所準(zhǔn)備的試劑和配置試劑。
[0068](I)漂洗:取離體哺乳動物的海馬組織，置冰浴的漂洗液中，去除紅細(xì)胞、被膜及結(jié)締組織，用漂洗液沖洗2~5次；
[0069](2)消化:將步驟I漂洗后的海馬組織剪成直徑Imm3小塊，用5倍組織體積的消化液37°C作用5~10分鐘，組織成粥糜狀，用細(xì)胞種植液終止消化，輕輕吹打至組織塊10次以分散細(xì)胞。
[0070](3)制備細(xì)胞懸液:收集步驟2消化后初次細(xì)胞懸液，經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾后，800~1000rpm4°C離心5~10分鐘，棄去上清液，加入細(xì)胞種植液，重懸細(xì)胞，制成
5X IO5~10 X IO5個/mL的單細(xì)胞懸液；
[0071](4)接種、培養(yǎng):將步驟3細(xì)胞懸液種植于預(yù)先鋪好多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，種植后24~72小時換成細(xì)胞維持液，之后每隔兩天用細(xì)胞維持液換液，每次更換的量為原體積的1/2。
[0072](5)鏡檢判定:神經(jīng)細(xì)胞種植后12小時后，倒置顯微鏡觀察，顯示:大部分細(xì)胞貼壁，形態(tài)呈圓形，其中少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞外觀為長梭型，并開始伸出I~2個突起。第2天更換細(xì)胞維持液，培養(yǎng)24小時后，細(xì)胞形態(tài)多樣，如梭形、三角形、椎體形或不規(guī)則形，伸出突起的神經(jīng)細(xì)胞逐漸增多長短不一。培養(yǎng)第72小時，神經(jīng)元胞體增大，飽滿；3天后神經(jīng)元形狀已很典型:胞體飽滿，多呈梭形、錐形，少數(shù)呈多邊形，胞漿豐富，核大，核仁隱約可見，突起明顯增長，背景中仍然 可見極少數(shù)扁平狀多邊形的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞鋪墊。
[0073]在培養(yǎng)第3~5天，進(jìn)行顯微鏡鏡檢，培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)體積變大、且大部分細(xì)胞出現(xiàn)典型的神經(jīng)元形態(tài)，沒有雜細(xì)胞增殖，則說明培養(yǎng)成功。
[0074]本發(fā)明方法建立的海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)細(xì)胞可存活5~9天，能夠滿足開展神經(jīng)元細(xì)胞功能研究的需要。
[0075](6)細(xì)胞純化
[0076]如果觀測到有雜細(xì)胞存在，則進(jìn)行細(xì)胞純化處理。
[0077]如果細(xì)胞培養(yǎng)48~72小時，觀察到有雜細(xì)胞存在，每孔加入阿糖胞苷(濃度為
2~10 μ g/mL) lmL，再加入與阿糖胞苷溶液等體積的步驟(3)配制的細(xì)胞種植液，使阿糖胞苷終濃度為I~5μ g/mL，24~48小時后，用步驟(4)配制的細(xì)胞維持液完全換液。
[0078]實(shí)施例4
[0079]1.細(xì)胞活力試驗(yàn)
[0080]表1培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的細(xì)胞活力
[0081]
【權(quán)利要求】
1.一種海馬神經(jīng)元的分離和原代培養(yǎng)方法包括以下步驟: (1)漂洗:取離體哺乳動物的海馬組織，置冰浴的漂洗液中，去除紅細(xì)胞、被膜及結(jié)締組織，用漂洗液沖洗2~5次； (2)消化:將步驟I漂洗后的海馬組織剪成直徑Imm3小塊，用5倍組織體積的消化液37°C作用5~10分鐘，組織成粥糜狀，用細(xì)胞種植液終止消化，輕輕吹打至組織塊10次以分散細(xì)胞。 (3)制備細(xì)胞懸液:收集步驟2消化后初次細(xì)胞懸液，經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾后，800~1000rpm4°C離心5~10分鐘，棄去上清液，加入細(xì)胞種植液，重懸細(xì)胞，制成5X IO5~IOXlO5個/mL的單細(xì)胞懸液； (4)接種、培養(yǎng):將步驟3細(xì)胞懸液種植于預(yù)先鋪好多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，種植后24~72小時換成細(xì)胞維持液，之后每隔兩天用細(xì)胞維持液換液，每次更換的量為原體積的1/2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬神經(jīng)元的分離和原代培養(yǎng)方法，其特征在于所述漂洗液，經(jīng)過如下步驟得到:2g海藻糖、3g葡萄糖和IOmL雙抗溶于IOOmL D-Hanki s液中，混勻，加D-HanV s液定容至1000mL, 0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4~6小時，氫氣終濃度達(dá)到為0.5mmol/L，Y射線消毒滅菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬神經(jīng)元的分離和原代培養(yǎng)方法，其特征在于所述消化液，經(jīng)過如下步驟得:1.0g胰蛋白酶和0.1g EDTA溶于IOOmL D-Hank' s液中，混勻，加D-Hank; s液定容至1000mL，0.22 μ m濾膜過濾除菌，0.4MPa大氣壓下溶入氫氣4~6小時，氫氣終濃度達(dá)到為0.5mmol/L，Y射線消毒滅菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬神經(jīng)元的分離和原代培養(yǎng)方法，其特征在于所述細(xì)胞種植液，經(jīng)過如下步驟得到:DMEM/F12培養(yǎng)基加入胎牛血清、活性發(fā)酵濾液和雙抗，使胎牛血清終濃度為10%、活性發(fā)酵濾液終濃度為0.2%，雙抗終濃度為I %，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬神經(jīng)元的分離和原代培養(yǎng)方法，其特征在于所述細(xì)胞維持液，經(jīng)過如下步驟得到=Neurobasal培養(yǎng)基加入B27和谷氨酰胺，使B27終濃度為2%，谷氨酰胺終濃度1%，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的漂洗液，其特征在于所述D-Hank's液經(jīng)過如下步驟得到:NaC18.0g, KC10.4g, Na2HPO4.12Η200.12g, KH2PO40.06g, NaHCO30.35g ;依次將各成分溶解于約500mL三蒸水中混勻，加三蒸水定容至1000mL,調(diào)整pH值至7.2~7.4，分裝，高壓滅菌，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的漂洗液，其特征在于所述雙抗是青霉素-鏈霉素溶液(100X):青霉素含量為10000U/mL，鏈霉素含量為10mg/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞種植液，其特征在于所述活性發(fā)酵濾液經(jīng)過如下步驟得到: ①雙歧桿菌(Bifidobacteriumsp.)WZ002,該菌株已于2014年I月22日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8809 ； ②雙歧桿菌WZ002采用改良MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為:以重量計(jì)，取蛋白胨10g，牛肉膏 10g，酵母膏 5g，葡萄糖 20g,乙酸鈉 5g，K2HP042g，MgSO4.7Η200.5g，MnSO4.4Η200.2g，低聚果糖3g，檸檬酸二銨2g，吐溫-801mL，蒸餾水1L，加熱溶解校正pH值至6.5，115°C高壓滅菌15-20分鐘。 ③將雙歧桿菌WZ002接種于冷卻至40 ± 2°C的步驟②改良MRS培養(yǎng)基中，菌種接種量為0.2~0.5%，35±2°C厭氧培養(yǎng)24小時，用分光光度計(jì)測定上述培養(yǎng)液A58tol值為1.2時，將上述培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)數(shù)5000~8500rpm下離心10分鐘后，取上清液，0.22 μ m濾膜過濾除菌，即得到活性發(fā)酵液濾液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號】C12R1/01GK103805565SQ201410066740
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月21日
【發(fā)明者】孫晶, 劉佳明 申請人:溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、育英兒童醫(yī)院