基于dCAPS技術(shù)對(duì)日本看麥娘抗藥性相關(guān)突變的分子檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于dCAPS技術(shù)檢測(cè)導(dǎo)致日本看麥娘對(duì)ACCase抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的相關(guān)突變的分子檢測(cè)方法，可用于對(duì)日本看麥娘抗性相關(guān)突變進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。根據(jù)日本看麥娘與抗性相關(guān)的ACCase基因，針對(duì)不同突變分別設(shè)計(jì)引物，以日本看麥娘基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并獲得擴(kuò)增片段；選擇相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對(duì)上述的PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切；酶切后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳可判斷日本看麥娘是否具有抗性相關(guān)突變及其突變的基因型。相對(duì)于傳統(tǒng)的突變檢測(cè)方法，本發(fā)明的特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，方法更加快速簡(jiǎn)單，并且大大降低了檢測(cè)成本，為日本看麥娘抗性相關(guān)突變的檢測(cè)提供了一種優(yōu)良的分子檢測(cè)方法。
【專利說(shuō)明】基于dCAPS技術(shù)對(duì)日本看麥娘抗藥性相關(guān)突變的分子檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性(derivedcleaved amplified polymorphic sequence, dCAPS)方法來(lái)檢測(cè)導(dǎo)致日本看麥娘對(duì)乙酸輔酶A羧化酶(Acetyl coenzyme A carboxylase, ACCase)抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的相關(guān)突變的分子檢測(cè)方法?？捎糜趯?duì)日本看麥娘抗性相關(guān)突變進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]日本看麥娘(Alopecurus japonicus Steud.)是我國(guó)油菜田和麥田的惡性禾本科雜草，因其與作物爭(zhēng)肥、爭(zhēng)水、爭(zhēng)陽(yáng)光、爭(zhēng)空間，而對(duì)油菜和小麥的產(chǎn)量及品質(zhì)造成嚴(yán)重危害。
[0003]ACCase抑制劑類除草劑是一類包括芳氧苯氧基丙酸酯類，環(huán)己烯酮類，新苯基吡唑啉類的具有殺草活性高、殺草譜廣和選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的除草劑。自70年代后期在我國(guó)油菜田和小麥田開始廣泛使用，一直是油菜田和小麥田防除一年生禾本科雜草的主導(dǎo)藥劑。但是近年來(lái)，日本看麥娘對(duì)此類除草劑的抗藥性問(wèn)題逐步顯現(xiàn)，對(duì)我國(guó)油菜和小麥的糧食生產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅。因此，對(duì)日本看麥娘的抗藥性檢測(cè)對(duì)于保障我國(guó)糧食生產(chǎn)安全至關(guān)重要。研究表明，在日本看麥娘中編碼ACCase氨基酸的某些位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致其對(duì)ACCase抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗藥性，這些氨基酸突變?yōu)镮le-1781-Leu，Trp-1999-Cys，Trp-1999-Leu，Trp-2027-Cys, Ile-2041-Asn, Asp-2078-Gly。
[0004]對(duì)抗性相關(guān)突變的檢測(cè)對(duì)于抗性日本看麥娘的監(jiān)控及治理具有重要意義。dCAPS技術(shù)是一種通過(guò)等位基因快速準(zhǔn)確檢測(cè)SNP位點(diǎn)的技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)在引物中導(dǎo)入錯(cuò)配堿基，使擴(kuò)增的序列在一種基因型中產(chǎn)生酶切位點(diǎn)，而在另一種沒(méi)有，PCR產(chǎn)物再經(jīng)過(guò)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切，通過(guò)限制性圖譜分析可`知SNP位點(diǎn)是否存在，從而對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)。該技術(shù)已經(jīng)在其他抗性雜草的抗性突變檢測(cè)中得到了應(yīng)用，但是在我國(guó)惡性雜草日本看麥娘的抗性檢測(cè)中尚無(wú)應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了對(duì)日本看麥娘抗ACCase抑制劑類除草劑的抗性相關(guān)突變進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明建立了一套基于dCAPS技術(shù)對(duì)抗性相關(guān)突變進(jìn)行快速準(zhǔn)確檢測(cè)的分子檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)該方法，本發(fā)明針對(duì)不同突變?cè)O(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物，篩選了合適的限制性內(nèi)切酶，并對(duì)PCR擴(kuò)增條件、瓊脂糖凝膠電泳條件進(jìn)行了優(yōu)化。
[0006]本發(fā)明所述分子檢測(cè)方法通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007](I)根據(jù)日本看麥娘編碼ACCase基因中與抗性相關(guān)的不同的突變位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使擴(kuò)增產(chǎn)物在不同的基因型之間產(chǎn)生不同的酶切位點(diǎn)。
[0008]PCR擴(kuò)增所用的引物為:
【權(quán)利要求】
1.一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)抗ACCase抑制劑類除草劑的日本看麥娘、看麥娘、茼草等雜草中與抗性相關(guān)的突變位點(diǎn)(Ile-1781-Leu, Trp-1999-Cys，Trp-1999-Leu, Trp-2027-Cys,Ile-2041-Asn, Asp-2078-Gly)的分子檢測(cè)方法，其特征是基于衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性(dCAPS)技術(shù)對(duì)抗性相關(guān)突變的檢測(cè)，該方法包括以下步驟: 步驟1:提取雜草DNA樣本； 步驟2:進(jìn)行PCR ； 步驟3:用限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物； 步驟4:瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子檢測(cè)方法，其特征在于: (1)步驟2中所述的用于PCR反應(yīng)中的引物具有特異性，所述的引物分別為:
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分子檢測(cè)方法，所述雜草可以是日本看麥娘、看麥娘、茼草、棒頭草、硬草等禾本科雜草。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103882121SQ201410066925
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】董立堯, 徐洪樂(lè), 李俊, 潘浪 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)