Hcv重組融合抗原及其表達(dá)基因和制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了丙型肝炎重組融合抗原及其表達(dá)基因和制備方法。所述的丙型肝炎重組融合抗原的氨基酸組成由SEQ?ID?NO.1所示氨基酸、第一連接子、SEQ?ID?NO.2所示氨基酸、第二連接子、SEQ?ID?NO.3所示氨基酸、第三連接子及SEQ?ID?NO.4所示氨基酸順次組合構(gòu)成，每個連接子分別由6個柔性分子量小的、極性且親水的氨基酸構(gòu)成。其制備方法包括：重組質(zhì)粒pET41a-Core-NS3-NS41-NS42的構(gòu)建；丙型肝炎重組融合抗原的表達(dá)和純化。所述的丙型肝炎重組融合蛋白具有較高的靈敏度和特異性，可應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是應(yīng)用在丙型肝炎抗體膠體金檢測試紙條中。
【專利說明】HCV重組融合抗原及其表達(dá)基因和制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體是涉及一種HCV重組融合抗原及其表達(dá)基因和制備方法
【背景技術(shù)】
[0002]丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis c virus, HCV)感染引起的，非A,非B(NANB)病毒性肝炎。1974年Ianeld首次報告輸血后非甲非乙型(NANB)肝炎，1989年Choo等成功從受感染的黑猩猩血液標(biāo)本中分離得到(NANB)病毒，并從此展開對這一陌生病毒的研究。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球HCV的平均感染率為3%左右，約有117~210億人感染HCV，每年新發(fā)病例約315萬例，每年約有35萬人因丙肝相關(guān)疾病而死亡。
[0003]丙型肝炎病毒主要通過血液傳播，占據(jù)輸血后肝炎的80-90%，急性丙型肝炎中，50%-60%患者會發(fā)展成慢性肝炎，其中20%又有可能進(jìn)一步發(fā)展成肝硬化。由于目前沒有有效治療丙型肝炎的藥物，早期發(fā)現(xiàn)HCV感染，準(zhǔn)確判斷病毒亞型及患者感染狀況，是有效防控丙肝的重要手段。因此，研制特異性強(qiáng)、靈敏度高和穩(wěn)定性好的診斷試劑，對血源及血制品執(zhí)行嚴(yán)格篩查程序，是控制HCV傳播的必然選擇。
[0004]HCV是黃病毒科，正鏈RNA，全長9.5kb，僅有一個開放閱讀框，編碼一個3011個氨基酸的聚蛋白前體。蛋白前體在宿主及病毒自身蛋白酶的作用下，被切割成多個功能蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白:核衣殼蛋白Core，囊膜糖蛋白El和E2，和非結(jié)構(gòu)蛋白P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B。該病毒的這一復(fù)雜的蛋白組成體系給丙型肝炎病毒診斷試劑的研發(fā)帶來很大困難。從1989年HCV的發(fā)現(xiàn)至今，國際HCV診斷試劑的發(fā)展先后經(jīng)歷三個階段。第一代抗-HCV ELISA診斷試劑采用的抗原C100-3是HCV非結(jié)構(gòu)基因(NS3/NS4)和人超氧化物歧化酶(SOD)基因嵌合后表達(dá)的融合蛋白，由于ClOO只含363個氨基酸,而HCV基因組編碼的蛋白有長達(dá)3011個氨基酸，因此C100-3抗原-抗體系統(tǒng)只代表整個HCV抗原-抗體系統(tǒng)中很小部分，所以敏感性不高，很難滿足試劑檢測需求；另外，抗C100-3出現(xiàn)比較晚，不滿足早期診斷的基本條件。第二代抗-HCV ELISA診斷試劑在第一代基礎(chǔ)上增加了核心區(qū)重組蛋白C22和NS3區(qū)重組蛋白C33c，使檢出率提高了 25%~30%，而且檢測抗體的窗口期也有所縮短，但由于重組基因多肽抗原中仍有SOD多肽，所以仍存在抗-SOD造成的假陽性問題和少數(shù)漏檢問題。當(dāng)前用的第三代抗-HCV ELISA診斷試劑，其包被抗原為HCV核心抗原Core，NS3、NS4和NS5抗原，使特異性達(dá)到99%。雖然第三代HCV抗體ELISA診斷試劑增加了 HCV NS5區(qū)表達(dá)的蛋白作為抗原，提高了試劑敏感性，但從HCV感染到可檢測出抗體仍40多天，因此，第三代ELISA診斷試劑的質(zhì)量仍有很大改進(jìn)空間。
[0005]目前，國際上的主流試劑主要是采用HCV基因組表達(dá)的多區(qū)段優(yōu)勢抗原，如結(jié)構(gòu)區(qū)核殼蛋白C22、非結(jié)構(gòu)NS3區(qū)C33c、NS4區(qū)ClOO或5_1_1抗原等組裝成HCV診斷試劑，如CHIRON? RffiA? HCV3. 0sia。CHIRON? RIBA? HCV3.0sia 是目前公認(rèn)的丙型肝炎確診試劑，經(jīng)調(diào)查，該試劑也是國內(nèi)外很多科研院校相關(guān)學(xué)術(shù)研究成果報道中的確診參比試劑。該試劑也是選用了 HCV的主要的優(yōu)勢抗原表位，包括兩個重組抗原(C33C和NS5)及兩個合成多肽(C100P和5-1-1P)。但是單個小蛋白的表達(dá)耗時費(fèi)力，合成肽成本高，在膠體金檢測試劑中的應(yīng)用更加困難。
[0006]在近年病毒免疫學(xué)的研究中，有人提出“多表位抗原”的概念，將病毒主要的抗原表位進(jìn)行融合表達(dá)。通過基因工程技術(shù)手段，將多個優(yōu)勢表面抗原肽基因融合表達(dá)，不僅可以省去分別表達(dá)、單個純化不同抗原的煩瑣操作，而且還可以滿足診斷試劑盒所要求的等摩爾比混合的要求。如1994年CHIEN等表達(dá)了融合抗原C25，2001年沈小川等表達(dá)的Core-NS3-NS4抗原，都表現(xiàn)了良好的抗原性和特異性。黃建生等優(yōu)選了 5個高度保守的T細(xì)胞及(或)B細(xì)胞表位，組合成一個HCV多表位融合蛋白，氨基酸序列及位置分別為核心蛋白(I ~16，132 ~141)，El (126 ~135)，NS3 (139 ~147)及 NS5 (768 ~775)。但是該研究結(jié)果顯示，檢測HCV的陽性率高達(dá)90%，其中假陽率高達(dá)20%，因此顯然僅僅考慮抗原的線性表位是不合理的。2010年聶東宋等也發(fā)表了關(guān)于HCV融合多表位抗原的報道，但是該融合蛋白也僅僅處于實驗室研究階段，在靈敏度及特異性評價中僅檢測10慢性肝病患者和5份HCV陰性的血清進(jìn)行檢測，沒有涉及后續(xù)的研究。并且實驗選用的抗原表位過于簡短，雖然包括了主要的抗原表位，但不能折疊成HCV的空間構(gòu)象，這種蛋白如果用于診斷試劑用抗原，必定造成漏檢及假陽。
[0007]經(jīng)對丙型肝炎病毒的免疫學(xué)信息研究發(fā)現(xiàn)，HCV在患者血液中的抗體主要是對以下抗原表位的免疫應(yīng)答產(chǎn)生，Core (2-120aa), NS3 (1192-1457)，NS4 (1694-1735)，NS4(1859-1931)，NS5A(2212-2313)。2005年，余龍林課題組將第三代抗一 HCVELISA診斷試劑所需全長NS5A和高免疫源區(qū)NS5A蛋白(氨基酸2212~2313)的基因分別進(jìn)行原核表達(dá)后，靈敏度檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NS5A全長基因重組蛋白與NS5A高免疫區(qū)基因重組蛋白都具有良好的免疫學(xué)檢測效果，但NS5A全長重組蛋白的檢測靈敏度明顯高于NS5A高免疫區(qū)重組蛋白。且有研究報道顯示，NS5A和NS4免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體存在一定的交叉，即對NS5A免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體與NS4抗原有特異性的反應(yīng)。另外，第三代診斷試劑加入的NS5A全長基因表達(dá)的蛋白過大，與Core、NS3、NS4優(yōu)勢抗原表位串聯(lián)表達(dá)后，會因空間結(jié)構(gòu)的遮擋而使部分抗原表位不能暴露在分子表面；另外，查閱國內(nèi)外報道，沒有血清中僅與NS5發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體?；谝陨显?，該研究選取合適的Core (2-125aa)、NS3 (1192~1459)、NS4(1694-1735aa)、NS4 (1901_1936aa)基因`片段，通過6個氨基酸的柔性鏈接子進(jìn)行串聯(lián)，進(jìn)行融合表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供一種檢測HCV抗體的重組融合抗原。
[0009]解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:
[0010]一種HCV重組融合抗原，由SEQ ID N0.1所示氨基酸、第一連接子、SEQ ID N0.2所示氨基酸、第二連接子、SEQ ID N0.3所示氨基酸、第三連接子及SEQ ID N0.4所示氨基酸順次組合構(gòu)成，每個連接子分別由6個柔性分子量小的、極性且親水的氨基酸構(gòu)成。
[0011]在其中一個實施例中，所述第一連接子的氨基酸組成如SEQ ID N0.5 ;所述第二連接子的氨基酸組成如SEQ ID N0.6 ;所述第三連接子的氨基酸組成如SEQ ID N0.7所示。
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供編碼上述HCV重組融合抗原的表達(dá)基因。
[0013]解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:[0014]一種編碼權(quán)利要求1所示的HCV重組融合抗原的表達(dá)基因，包括a:由SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列、編碼第一連接子的核苷酸序列、SEQ ID N0.9所示的核苷酸序列、編碼第二連接子的核苷酸序列、SEQ ID N0.10所示的核苷酸序列、編碼第三連接子的核苷酸序列及SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列順次組合構(gòu)成；b:與a的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡并性而與a的核苷酸序列不同的序列；C:對上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列。
[0015]在其中一個實施例中，所述編碼第一連接子的核苷酸序列為SEQ ID N0.12;所述編碼第二連接子的核苷酸序列為SEQ ID N0.13、所述編碼第三連接子的核苷酸序列為SEQID N0.14 所示。
[0016]本發(fā)明另一發(fā)明目的是提供上述HCV重組融合抗原的制備方法。
[0017]實現(xiàn)該目的的技術(shù)方案如下:
[0018]上述HCV重組融合抗原的制備方法，其步驟如下:
[0019](I)得到堿基組成序列為SEQ ID N0.26的基因片段；
[0020](2)將所述基因片段經(jīng)BamHI和HindII雙酶切，酶切產(chǎn)物純化回收后，與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶酶切后的表達(dá)載體連接；
[0021 ] (3)通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5 α，涂布于含50 μ g/ml Kan+的LB瓊脂培養(yǎng)基上，篩選得到陽性質(zhì)粒；
[0022](4)將步驟(3)中得到的陽性質(zhì)粒，通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Kan+的LB瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)；挑取單菌落接種至Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜；次日，轉(zhuǎn)接于新鮮的含Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D600~0.4~
0.6時加入IPTG至終濃度0.2~0.6mM,低溫`誘導(dǎo)培養(yǎng)4~5h ;得到HCV重組融合抗原。
[0023]優(yōu)選地，步驟(4)為:將步驟(3)中得到的陽性質(zhì)粒，通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Kan+濃度為50 μ g/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)16h ;挑取單菌落接種至含50 μ g/ml Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，培養(yǎng)過夜；次日，以1:100轉(zhuǎn)接于新鮮的含50 μ g/ml Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，培養(yǎng)至0D600 ^ 0.4~0.6時加入IPTG至終濃度0.2~0.6mM,低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)4~5h ;得到HCV重組融合抗原。
[0024]在其中一個實施例中，所述表達(dá)載體為pET41a。利用該表達(dá)載體上促進(jìn)蛋白可溶表達(dá)的GST標(biāo)簽得到上清表達(dá)的HCV重組融合抗原。
[0025]在其中一個實施例中，步驟(4)誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為20~37°C (更優(yōu)選為20~25°C)。該低溫誘導(dǎo)可以降低蛋白表達(dá)速率，提高蛋白可溶表達(dá)量。
[0026]在其中一個實施例中，所述制備方法還包括步驟(5)純化:誘導(dǎo)培養(yǎng)后收集菌體，并用蒸餾水洗滌兩次后用20mM PBS pH7.3的緩沖液重懸；加入ImM PMSF后冰浴條件下超聲破碎，離心；取上清進(jìn)行純化；上樣緩沖液為20mM PBS pH7.3 ;平衡緩沖液為:20mMTrisUOmM GSHUM NaCl pH8.0 ;洗脫緩沖液為:50mM Tris、50mM GST pH8.0 ;最后將洗脫的目的蛋白在保存Buffer中透析過夜。
[0027]發(fā)明的有益效果如下:
[0028]1、本發(fā)明旨在研發(fā)一種重組融合HCV抗原，該融合抗原涵蓋了 HCV核衣殼蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白NS3、NS4的主要抗原表位，具有很高的靈敏度及特異性。
[0029]2、此外，此融合抗原在設(shè)計上，經(jīng)過對蛋白的疏水氨基酸截除，很大程度提高了抗原的親水性而不損害抗原性。
[0030]3、進(jìn)一步地，為了最大程度提高此抗原的親水性，根據(jù)各抗原表位自身一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)選擇不同的親水性較強(qiáng)的連接子連接不同的抗原表位，該連接子的選擇也很大程度提高了重組抗原的親水性。
[0031]4、經(jīng)驗證，本發(fā)明制備的重組抗原溶解性好，可在大腸桿菌菌體內(nèi)完成折疊，可溶表達(dá)，不需要后期的復(fù)性而有很高的活性，從而克服了重組HCV抗原由于溶解性差而在免疫檢測的應(yīng)用中受限的缺點(diǎn)。
[0032]5、同時，本發(fā)明也公布了經(jīng)篩選優(yōu)化后的HCV各抗原表位的基因序列，及整個抗原設(shè)計構(gòu)建的技術(shù)路線，為高品質(zhì)HCV抗體快速檢測試劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1:實施例2中重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定圖；從左到右，依次為=Marker DL5000、酶切結(jié)果、PET41a-Core-NS3-NS41-NS42。
[0034]圖2:實施例3中重組抗原誘導(dǎo)表達(dá)鑒定圖；從左到右，依次為:蛋白Marker、沉淀、上清、全菌。
[0035]圖3:實施例4中重組抗原純化電泳圖。從左到右，依次為:蛋白Marker、破碎上清、流穿樣品、洗脫目的 蛋白。
【具體實施方式】
[0036]實施例一:HCV融合抗原的設(shè)計
[0037]由于病毒性傳染病的抗原往往較大，難以實現(xiàn)體外完整蛋白的表達(dá)，即使能夠?qū)崿F(xiàn)完整蛋白的表達(dá)，由于種屬差異，分子量比較大的蛋白往往不能正確折疊，后期的復(fù)性困難，而制約檢測試劑的開發(fā)。因此利用基因工程技術(shù)，將多個優(yōu)勢表面抗原肽基因融合表達(dá)成為抗原研究的方向。本發(fā)明通過大量實驗的篩選，最后確定選取core (2-125aa)、NS3(1192 ~1459aa)、NS4 (1694_1735aa)、NS4 (1901_1936aa)四個有優(yōu)勢抗原表位，對密碼子進(jìn)行優(yōu)化后分別通過親水性較強(qiáng)的柔和連接子GGGGGG、SGGGGS, GGGSGG將其串聯(lián)。選取的Core的抗原表位為2-125aa，其氨基酸序列為SEQ ID N0.1，對應(yīng)的優(yōu)化后的核苷酸序列為SEQ ID N0.8。選取的NS3的優(yōu)勢抗原表位為1192~1459aa，其氨基酸序列為SEQ IDN0.2，對應(yīng)的優(yōu)化后的核苷酸序列為SEQ ID N0.9。選取的NS4的兩個優(yōu)勢抗原表位分別為 1694-1735aa、1901-1936aa，其對應(yīng)的氨基酸序列分別為 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4，對應(yīng)的優(yōu)化后的核苷酸序列分比為SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11。將上述四個抗原表位通過相應(yīng)的連接子串聯(lián)后的氨基酸序列為SEQ ID N0.23，該HCV重組融合抗原對應(yīng)優(yōu)化后的核苷酸組成序列為SEQ ID N0.24。
[0038]以上優(yōu)化的整一條編碼融合抗原的表達(dá)基因序列采用化學(xué)合成的方法得到四個抗原表位的核苷酸序列(SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.11)，然后以SEQ ID N0.8為模板，以SEQ ID N0.15,SEQ ID N0.16為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化回收后得到基因片段I ;以SEQ ID N0.9為模板，以SEQ ID N0.17,SEQ ID N0.18為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化回收后得到基因片段I1:以SEQ ID N0.10為模板，以SEQ ID N0.19,SEQ ID N0.20為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化回收后得到基因片段III ;以SEQ ID N0.11為模板，以SEQ IDN0.21、SEQ ID N0.22為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化回收后得到基因片段IV ;將片段I和片段111:1混合后的混合片段為模板，以SEQ ID N0.15,SEQ ID N0.18為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化回收后得到片段V;將片段V和片段1115:1混合后的混合片段為模板，以SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.20為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化回收后得到片段VI ;將片段VI和片段IV5:1混合后的混合片段為模板，以SEQ ID N0.15,SEQ ID N0.22為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化回收后得到目的基因片段SEQ ID N0.26。
[0039]實施例二:HCV融合抗原表達(dá)載體的構(gòu)建
[0040]經(jīng)生物學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)該重組蛋白疏水性強(qiáng)，為了增加該蛋白的水溶性，本發(fā)明優(yōu)先選擇主要的抗原表位，并盡量去掉疏水性較強(qiáng)的非抗原表位區(qū)；同時優(yōu)先的選擇pET41a作為表達(dá)載體，利用該表達(dá)載體上親水性較強(qiáng)的促溶標(biāo)簽GST使蛋白可溶表達(dá)。
[0041]將實施例一中得到的目的基因片段(SEQ ID N0.26)和表達(dá)載體pET41a分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII雙酶切后，16°C過夜連接，并將連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5 α，涂布于含50 μ g/ml Kan+的LB瓊脂培養(yǎng)基上，篩選得到陽性質(zhì)粒。次日挑取陽性克隆子培養(yǎng)提取質(zhì)粒測序及酶切鑒定。測序結(jié)果與預(yù)期一致，沒有任何堿基置換；雙酶切鑒定可見一條大小1400bp左右的目的片段(SEQ ID N0.24)，大小正確，說明目的基因已成功克隆入表達(dá)載體pET41a，并命名為pET41a-Core-NS3-NS41-NS42 (見圖1)。
[0042]實施例三:HCV融合抗原的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 [0043]3.1融合抗原的誘導(dǎo)表達(dá):將測序正確的酶切鑒定過的陽性重組質(zhì)粒用熱激發(fā)轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇后涂布于Kan+濃度為50 μ g/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)16h ;挑取4個單菌落接種至含50 μ g/ml Kan+的5ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200r/min培養(yǎng)過夜;次日，以1:100比例轉(zhuǎn)接于5ml新鮮含50 μ g/ml Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200r/min培養(yǎng)至0D600 ^0.6時，按正交試驗進(jìn)行表達(dá)因素篩選，包括溫度、誘導(dǎo)劑量、誘導(dǎo)時間、宿主菌OD值以及培養(yǎng)基pH值等；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入IPTG至終濃度0.5mM，25°C誘導(dǎo)培養(yǎng)5h時，蛋白可以部分可以可溶性上清表達(dá)，且上清表達(dá)量達(dá)到最高(圖 2)。
[0044]3.2融合抗原的純化按上述確定的誘導(dǎo)條件進(jìn)行大量發(fā)酵培養(yǎng)400ml。收集菌體，并用蒸餾水洗滌兩次后用20mM PBS pH7.3的緩沖液重懸；加入ImM PMSF后冰浴條件下超聲破碎(超聲破碎條件為:超聲5s,間隔12s,超聲總時間為15min);12000rpm/min,4°C離心15min ;取上清進(jìn)行純化。上樣緩沖液為20mM PBS pH7.3 ;平衡緩沖液為:20mM TrisUOmMGSHUM NaCl pH8.0 ;洗脫緩沖液為:50mM Tris、50mM GST pH8.0 ;最后將洗脫的目的蛋白在保存Buffer中透析過夜。HCV重組融合蛋白保存Buffer為:20mM TrisUmM EDTA、0.02%疊氮鈉、20%甘油。透析后蛋白純度大于90% (圖3)。
[0045]實施例四:HCV融合抗原靈敏度檢測
[0046]在其它生產(chǎn)工藝完全一致的情況下，用本發(fā)明的實施例3所制備的HCV重組融合抗原代替廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的HCV膠體金檢測試紙條的標(biāo)記蛋白(暫命名為:所述HCV重組融合抗原制備的CS3S4膠體金試紙條)，并檢測公司內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)陽性樣本，進(jìn)行本發(fā)明蛋白的靈敏度評價。結(jié)果表明本發(fā)明重組融合抗原對公司現(xiàn)有陽性質(zhì)控品的檢測均能達(dá)到公司對該產(chǎn)品的要求，能滿足免疫診斷試劑開發(fā)的需求(表1)
[0047]表1CS3S4膠體金試紙條靈敏度檢測結(jié)果[0048]
【權(quán)利要求】
1.一種HCV重組融合抗原，其特征是，由SEQ ID N0.1所示氨基酸、第一連接子、SEQ IDN0.2所示氨基酸、第二連接子、SEQ ID N0.3所示氨基酸、第三連接子及SEQ ID N0.4所示氨基酸順次組合構(gòu)成，每個連接子分別由6個柔性分子量小的、極性且親水的氨基酸構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HCV重組融合抗原，其特征是，所述第一連接子的氨基酸組成如SEQ ID N0.5 ;所述第二連接子的氨基酸組成如SEQ ID N0.6 ;所述第三連接子的氨基酸組成如SEQ ID N0.7所示。
3.一種編碼權(quán)利要求1所示的HCV重組融合抗原的表達(dá)基因，其特征是，包括a:由SEQID N0.8所示的核苷酸序列、編碼第一連接子的核苷酸序列、SEQ ID N0.9所示的核苷酸序列、編碼第二連接子的核苷酸序列、SEQ ID N0.10所示的核苷酸序列、編碼第三連接子的核苷酸序列及SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列順次組合構(gòu)成； b ?與a的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡并性而與a的核苷酸序列不同的序列； c:對上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)基因，其特征是，所述編碼第一連接子的核苷酸序列為SEQ ID N0.12 ;所述編碼第二連接子的核苷酸序列為SEQ ID N0.13、所述編碼第三連接子的核苷酸序列為SEQ ID N0.14所示。
5.一種權(quán)利要求1所述HCV重組融合抗原的制備方法，其特征是，其步驟如下: (1)得到堿基組成序列為SEQID N0.26的基因片段； (2)將所述基因片段經(jīng)BamHI和HindII雙酶切，酶切產(chǎn)物純化回收后，與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶酶切后的表達(dá)載體連接； (3)通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α，涂布于含50 μ g/ml Kan+的LB瓊脂培養(yǎng)基上，篩選得到陽性質(zhì)粒； (4)將步驟(3)中得到的陽性質(zhì)粒，通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL2KDE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Kan+的LB瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)；挑取單菌落接種至Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜；次日，轉(zhuǎn)接于新鮮的含Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D600~0.4~0.6時加入IPTG至終濃度0.2~0.6mM，低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)4~5h ;得到HCV重組融合抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征是，步驟(4)為:將步驟(3)中得到的陽性質(zhì)粒，通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Kan+濃度為50 μ g/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)16h ;挑取單菌落接種至含50 μ g/ml Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，370C，培養(yǎng)過夜；次日，以1:100轉(zhuǎn)接于新鮮的含50 μ g/ml Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，培養(yǎng)至0D600 ^ 0.4~0.6時加入IPTG至終濃度0.2~0.6mM，低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)4~5h ;得到HCV重組融合抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征是，所述表達(dá)載體為pET41a。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征是，步驟(4)誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為20~37°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征是，所述制備方法還包括步驟(5)純化:誘導(dǎo)培養(yǎng)后收集菌體，并用蒸餾水洗滌兩次后用20mM PBS pH7.3的緩沖液重懸;加入ImM PMSF后冰浴條件下超聲破碎，離心；取上清進(jìn)行純化；上樣緩沖液為20mM PBS pH7.3 ;平衡緩沖液為:20mM Tris、10mM GSH、1M NaCl pH8.0 ;洗脫緩沖液為:50mM Tris、50mM GST ρΗ8.0。
【文檔編號】C12N15/62GK103819565SQ201410068106
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月26日
【發(fā)明者】任艷娜, 才蕾, 唐時幸, 王繼華 申請人:廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司