一種納豆激酶高效表達(dá)的方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種納豆激酶高效表達(dá)的方法及其用途，其特征在于：運(yùn)用基因工程技術(shù)構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒，優(yōu)化工程菌發(fā)酵條件實(shí)現(xiàn)納豆激酶的低成本、高活性、高產(chǎn)量生產(chǎn)。用PCR的方法從分泌納豆激酶的枯草芽孢桿菌基因組DNA中擴(kuò)增得到全長為1056bp的前導(dǎo)肽+成熟肽納豆激酶原基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBE2S-Pro-NK，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒到枯草芽孢桿菌WB600菌株后取培養(yǎng)液，用硫酸銨分級(jí)沉淀法純化分泌到培養(yǎng)液中的納豆激酶，經(jīng)聚丙烯酰銨凝膠電泳SDS-PAGE成單一條帶，經(jīng)纖維平板法檢測(cè)出現(xiàn)透明圈，得到有活性的純度較高的納豆激酶。這些方法可以用于工業(yè)化生產(chǎn)用于生產(chǎn)納豆激酶膠囊、納豆激酶腸溶片和注射針劑。
【專利說明】一種納豆激酶高效表達(dá)的方法及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥、保健和生物工程領(lǐng)域，具體地說是一種納豆激酶高效表達(dá)的方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]納豆是一種在日本廣受歡迎的具有1000多年歷史的傳統(tǒng)營養(yǎng)食品，我國稱之為“臘八豆”。與源于我國歷史更悠久的真菌發(fā)酵食品豆豉有所不同，納豆是由一種細(xì)菌枯草芽孢桿菌{Bacillus subtil is)的變種納豆菌(Bacillus subtil is (natto))發(fā)酵煮熟的大豆而制成的。據(jù)說長期食用納豆可以預(yù)防和治療心血管疾病。[0003]1986年日本的須見洋行博士發(fā)現(xiàn)納豆及其提取物在體外具有溶解血栓的作用。后來研究發(fā)現(xiàn)納豆在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生一種絲氨酸蛋白酶，這種酶能夠有效的溶解血栓，模仿尿激酶(Urokinase)將其命名為納豆激酶(Nattokinase)。這是一種胞外絲氨酸蛋白酶(extracellular serine protease),由 aprE (納豆菌中稱 aprN)基因編碼。
[0004]由于我國心腦血管發(fā)病率日益增高，心腦血管疾病的防治受到越來越多的關(guān)注。納豆作為一種保健食品也更多地受到人們的喜愛，納豆激酶顯著的溶解血栓作用在醫(yī)藥研究及臨床應(yīng)用方面也受到廣泛重視，市場(chǎng)上有已經(jīng)一些日本進(jìn)口和國內(nèi)的納豆激酶保健品。每克濕納豆含有相當(dāng)于目前臨床使用的溶栓制劑(尿激酶)1600IU，納豆激酶作為一種溶栓制劑具有很好的應(yīng)用前景。
[0005]納豆激酶由275個(gè)氨基酸組成，程單鏈多肽結(jié)構(gòu)，無二硫鍵，其分子量大小為27.728KD，等電點(diǎn)約為8.6。納豆激酶最敏感底物是血纖維溶酶的底物S-2251(H-D-Val-Leu-Lys-PNA)，對(duì)凝血酶底物 S-2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA)和激肽釋放底物S-2302 (H-D-Pro-Phe-Arg-pNA)也有一定作用。納豆激酶在pH值6.0~12.0的范圍具有很強(qiáng)的血纖維蛋白溶解能力，對(duì)溫度比較敏感，40°C保溫30min活力無變化，溫度超過50°C活力逐漸喪失，超過60°C酶活性急速下降，反復(fù)凍融對(duì)酶活性影響不大。有研究表明將納豆激酶與胃黏液蛋白，血清蛋白及煮沸鍋的大米混合后活性幾乎沒變化，在酸性條件下活性也只部分喪失，這說明納豆菌酶作為一種口服制劑有良好的應(yīng)用前景。
[0006]納豆激酶可以直接溶解血栓。納豆激酶作用于交聯(lián)纖維蛋白底物 S-2251(H-D-Val-Leu-Lys-PNA)、 S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA)和 S-2302(H-D-Pro-Phe-Arg-pNA)使其水解成可溶性的小分子,從而直接溶解血栓。
[0007]納豆激酶刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源t-PA。納豆激酶可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源t-PA，t-PA催化纖溶酶原變成纖溶酶，從而使累積的纖維蛋白或血栓溶解，同時(shí)t-PA的活性又受到纖溶酶激活劑的抑制劑(pA1-1)的抑制，調(diào)控纖溶酶的作用以保證體內(nèi)纖溶系統(tǒng)的正常機(jī)能。納豆激酶還可以通過降解和失活纖溶酶原激活劑的抑制劑(PA1-1)調(diào)控纖溶作用(圖一)。
[0008]納豆激酶可激活體內(nèi)尿激酶原轉(zhuǎn)為尿激酶。納豆激酶通過激活體內(nèi)尿激酶原轉(zhuǎn)化為尿激酶，尿激酶也能激活纖溶酶原產(chǎn)生纖溶酶，從而增加內(nèi)源纖溶酶活性，進(jìn)一步加強(qiáng)溶栓作用。
[0009]納豆激酶是具有溶栓活性的纖溶酶，它的生物學(xué)活性測(cè)定是根據(jù)體內(nèi)纖維蛋白溶解系統(tǒng)的過程建立的。體外測(cè)定其活性的方法主要有纖維蛋白平板法、纖維蛋白塊溶解時(shí)間法，酶聯(lián)免疫法、四肽底物法、血清平板法等。最多運(yùn)用的是纖維蛋白平板法，溶栓劑的酶活性與透明圈面積的對(duì)數(shù)成一定的線性關(guān)系，此方法較為直觀。納豆激酶活性測(cè)定時(shí)，纖維蛋白平板法以標(biāo)準(zhǔn)納豆激酶、尿激酶或纖溶酶等作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。
[0010]隨著各類心腦血管疾病的發(fā)病率逐年增加,每年用于治療血栓類疾病的花費(fèi)在逐年增加。目前臨床使用的抗血栓藥物如鏈激酶、尿激酶等在臨床使用中存在穩(wěn)定性差、藥效短、易引起患者全身性出血等副作用，也存在半衰期短、產(chǎn)量低、成本高等缺點(diǎn)。
[0011]目前，國內(nèi)外在抗血栓藥物研究方面，正趨于向低價(jià)高效，易吸收，體內(nèi)半衰期長的藥物方向發(fā)展。納豆激酶是目前開發(fā)的近200多種具有口服制劑纖溶作用的藥物中最具潛力的纖溶蛋白酶。
[0012]近年納豆激酶作為功能性食品、食品添加劑和普通食品發(fā)展十分迅速。由于納豆激酶具有目前正在使用的一些溶栓劑所無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，人們很渴望能將其開發(fā)為新一代溶栓劑。但是，從目前狀況來看，納豆激酶產(chǎn)量不高，純度比較低，制成制劑后活性不高，以及活性穩(wěn)定性差，免疫原性高。因而，要將其開發(fā)為實(shí)用的新型溶栓劑，提高其產(chǎn)量、純度，保持高的穩(wěn)定的纖溶活性，降低其免疫原性是急需解決的問題。
[0013]
【發(fā)明內(nèi)容】
[0014]一種納豆激酶高效表達(dá)的方法為:運(yùn)用基因工程技術(shù)構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒，優(yōu)化工程菌發(fā)酵條件實(shí)現(xiàn)納豆激酶的低成本、高活性、高產(chǎn)量生產(chǎn)。用PCR的方法從分泌納豆激酶的枯草芽孢桿菌基因組DNA中擴(kuò)增得到全長為1056bp的前導(dǎo)肽+成熟肽納豆激酶原基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBE2S-Pro-NK，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒到枯草芽孢桿菌WB600菌株后取培養(yǎng)液，用硫酸銨分級(jí)沉淀法純化分泌到培養(yǎng)液中的納豆激酶，經(jīng)聚丙烯酰銨凝膠電泳SDS-PAGE成單一條帶，經(jīng)纖維平板法檢測(cè)出現(xiàn)透明圈，得到有活性的純度較高的納豆激酶。我們使用的pBE2S質(zhì)粒為分泌型載體，WB600為枯草芽孢桿菌6種分泌蛋白缺陷菌株，有利于納豆激酶的純化，并且枯草芽孢桿菌為生物安全菌株。
[0015]一種納豆激酶高效表達(dá)的方法及其用途:
1.用帶P43強(qiáng)啟動(dòng)子的穿梭質(zhì)粒克隆aprN基因，成功轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB600株，其大多數(shù)胞外蛋白酶基因已經(jīng)敲除，既可以防止其他蛋白酶對(duì)納豆激酶蛋白的降解，也可以提高納豆激酶產(chǎn)品純度。P43是一個(gè)重疊啟動(dòng)子，分別在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。P43大致比納豆激酶基因自身的啟動(dòng)子強(qiáng)10倍，后者的轉(zhuǎn)錄受群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，只在特定階段表達(dá)。納豆激酶同類產(chǎn)品是從納豆中提取，納豆激酶含量和純度都不高。
[0016]2.成功nattokinase的表達(dá)及其活性檢測(cè)。
[0017]3.成功利用蛋白提取及純化手段提純活性高的nattokinase O;
4.提出利用40升以上的發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵和生產(chǎn)。
[0018]5.提出將純化的高活性nattokinase投入實(shí)際應(yīng)用，生產(chǎn)納豆激酶腸溶片、膠囊，進(jìn)一步開發(fā)注射針劑。[0019]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1納豆激酶作用方式示意圖【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)說明的是，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
[0021]實(shí)施例1:
一種納豆激酶高效表達(dá)的方法及其用途，納豆激酶可以用來溶解血栓 (圖1)，其步驟是:
用PCR的方法從分泌納豆激酶的枯草芽孢桿菌基因組DNA中擴(kuò)增得到全長為1056bp的前導(dǎo)肽+成熟肽納豆激酶原基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBE2S-Pio-NK (啟動(dòng)子為P43)。轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒到枯草芽孢桿菌WB600菌株后取培養(yǎng)液，用硫酸銨分級(jí)沉淀法純化分泌到培養(yǎng)液中的納豆激酶，經(jīng)SDS-PAGE成單一條帶，經(jīng)纖維蛋白平板法檢測(cè)出現(xiàn)透明圈，得到有活性的純度較高的納豆激酶。
[0022]實(shí)施例2:
納豆激酶活性的纖維蛋白平板法檢測(cè)，僅含空載體的菌落周圍無透明圈；含有克隆有aprN基因質(zhì)粒的菌落周圍出現(xiàn)因纖維蛋白質(zhì)被降解而出現(xiàn)的透明圈。 [0023]實(shí)施例3:
納豆激酶表達(dá)SDS-PAGE檢測(cè)，菌體中的納豆激酶前體的大小比分泌到細(xì)菌胞外的成熟納豆激酶蛋白略大，這是因?yàn)榧{豆激酶分泌到胞外后分泌信號(hào)肽被切除。
[0024]實(shí)施例4:
培養(yǎng)液中的納豆激酶純化，利用硫酸銨分級(jí)沉淀法即可得到純度較高的納豆激酶。
【權(quán)利要求】
1.一種納豆激酶高效表達(dá)的方法，其特征在于:納豆激酶高效表達(dá)的方法是，運(yùn)用基因工程技術(shù)構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒，優(yōu)化工程菌發(fā)酵條件實(shí)現(xiàn)納豆激酶的低成本、高活性、高產(chǎn)量生產(chǎn)，用PCR的方法從分泌納豆激酶的枯草芽孢桿菌基因組DNA中擴(kuò)增得到全長為1056bp的前導(dǎo)肽+成熟肽納豆激酶原基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBE2S-Pro-NK，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒到枯草芽孢桿菌WB600菌株后取培養(yǎng)液，用硫酸銨分級(jí)沉淀法純化分泌到培養(yǎng)液中的納豆激酶，經(jīng)聚丙烯酰銨凝膠電泳SDS-PAGE成單一條帶，經(jīng)纖維平板法檢測(cè)出現(xiàn)透明圈，得到有活性的純度較高的納豆激酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納豆激酶高效表達(dá)的方法，其特征在于使用PBE2S質(zhì)粒為分泌型載體，WB600為枯草芽孢桿菌6種分泌蛋白缺陷菌株，有利于納豆激酶的純化，并且枯草芽孢桿菌為生物安全菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納豆激酶高效表達(dá)的方法，其用途在于:用帶P43強(qiáng)啟動(dòng)子的穿梭質(zhì)?？寺prN基因，成功轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB600株，其大多數(shù)胞外蛋白酶基因已經(jīng)敲除，既可以防止其他蛋白酶對(duì)納豆激酶蛋白的降解，也可以提高納豆激酶產(chǎn)品純度，P43是一個(gè)重疊啟動(dòng)子，分別在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，P43大致比納豆激酶基因自身的啟動(dòng)子強(qiáng)10倍，后者的轉(zhuǎn)錄受群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，只在特定階段表達(dá)，納豆激酶同類產(chǎn)品是從納豆中提取，納豆激酶含量和純度都不高；成功nattokinase的表達(dá)及其活性檢測(cè)；成功利用蛋白提取及純化手段提純活性高的nattokinase ;提出將純化的高活性nattokinase投入實(shí)際應(yīng)用，生產(chǎn)納豆激酶腸溶片、膠囊,進(jìn)一步開發(fā)注射針劑。
【文檔編號(hào)】C12N15/75GK103923896SQ201410068833
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】邱東茹, 阮晶, 洪峰 申請(qǐng)人:武漢萬密齋養(yǎng)生堂科技發(fā)展有限公司