一種高產(chǎn)丁醇的基因工程菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)丁醇的基因工程菌株，它是在拜氏梭菌中插入失活編碼NADH-輔酶Q氧化還原酶關(guān)鍵亞基的基因Cbei_4110，從而得到基因Cbei_4110失活的重組菌株。本發(fā)明還公開了上述基因工程菌株的構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明的基因工程菌株，以葡萄糖為碳源時，在2L發(fā)酵罐中總?cè)軇┊a(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量分別達(dá)到了12.7g/L和9.9g/L，分別比出發(fā)菌提高了17.5%和25.3%，丁醇比高達(dá)78%，糖轉(zhuǎn)化率高達(dá)0.42，利用本發(fā)明方法構(gòu)建的重組菌株，能提高丁醇產(chǎn)量和糖轉(zhuǎn)化效率，降低生產(chǎn)成本。
【專利說明】—種高產(chǎn)丁醇的基因工程菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)丁醇的基因工程菌株及其應(yīng)用，屬于基因工程和發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]丁醇已廣泛應(yīng)用于化工、塑料、油漆等工業(yè)領(lǐng)域。丁醇具有能量密度大、可直接用于內(nèi)燃機(jī)、運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)；作為新型的可再生生物能源，丁醇有著廣闊的發(fā)展前景。隨著化石能源日近枯竭，生物法制備丁醇受到越來越多的關(guān)注。生物法制備丁醇一般是利用產(chǎn)丁醇梭菌(丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌等)在嚴(yán)格厭氧條件下進(jìn)行的，其主要產(chǎn)物是丁醇、丙酮和乙醇，簡稱ABE發(fā)酵。傳統(tǒng)的ABE發(fā)酵包括產(chǎn)酸期和產(chǎn)溶劑期，丁醇、丙酮和乙醇的比例約為6:3:1。在產(chǎn)酸期，細(xì)胞通過乙酸和丁酸的偶聯(lián)會通過一系列的質(zhì)子傳遞體，將兩個還原H形成一個H2釋放出菌體。在產(chǎn)溶劑期，產(chǎn)生的乙酸和丁酸在此階段被轉(zhuǎn)變?yōu)槿軇?丙酮、丁醇和乙醇)，釋放大量CO2和少量H2 ;導(dǎo)致底物的轉(zhuǎn)化利用率僅在35%左右。因此，提高底物轉(zhuǎn)化率和丁醇比例是生物丁醇研究的熱點(diǎn)之一。
[0003]中國專利ZL95111733.5報道，上海植物生理研究所通過化學(xué)誘變的方法得到一株高產(chǎn)丁醇的菌株C.acetobutylicum EA2018，最終發(fā)酵產(chǎn)溶劑比為B:A:E=7:2:1，得率在0.35-0.38之間。美國專利US2005/0089979A1報道了利用gas-stripping和連續(xù)發(fā)酵耦合來生產(chǎn)丙酮丁醇，在IL發(fā)酵罐中，以葡萄糖為底物，丁醇比停留在60-70%之間；Mutschlechner 等利用拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii) NRRL B592,通過兩階段調(diào)控的方法連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)溶劑，在穩(wěn)定期丁醇比例的平均值為61%，溶劑產(chǎn)率平均值為0.25。
[0004]NADH-輔酶Q氧化還原酶是拜氏梭菌專屬的一種位于細(xì)胞膜上的質(zhì)子傳遞體，作用是以輔酶Q作為質(zhì)子受體，脫下NADH上一個H，氫氣的溢出是菌體維持其內(nèi)部氧化還原電勢穩(wěn)定的一種方式，然而這種方式造成了還原力的極大浪費(fèi)，是ABE發(fā)酵得率不高的原因之一?？梢?，利用二型內(nèi)含子技術(shù)阻`斷位于細(xì)胞膜上的還原氫的傳遞，降低H2的溢出，提高還原力的利用效率，進(jìn)而提高丁醇產(chǎn)量，是提高ABE發(fā)酵經(jīng)濟(jì)性的手段之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高產(chǎn)丁醇的基因工程菌株。
[0006]本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述基因工程菌株的構(gòu)建方法。
[0007]本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述基因工程菌株的應(yīng)用。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0009]一種高產(chǎn)丁醇的基因工程菌，它是在拜氏梭菌中插入失活編碼NADH-輔酶Q氧化還原酶關(guān)鍵亞基的基因Cbei_4110從而得到重組菌株。
[0010]本發(fā)明通過在菌種中失活NADH-輔酶Q氧化還原酶關(guān)鍵亞基的基因Cbei_4110，以提高丁醇產(chǎn)量。所述菌株可以是所有能夠發(fā)酵產(chǎn)丁醇的拜氏梭菌，例如拜氏梭菌野生菌，或者經(jīng)過誘變和基因工程改造后能出產(chǎn)生丁醇的拜氏梭菌，例如拜氏梭菌(Clostridiumbei jerinckii) IB4 等。
[0011]其中，所述的拜氏梭菌優(yōu)選為拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii) NCIMB8052。
[0012]其中，所述的基因Cbei_4110，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
[0013]上述高產(chǎn)丁醇的基因工程菌的構(gòu)建方法，它包括如下步驟:
[0014](I)構(gòu)建Cbei_4110基因的插入失活載體pWJ-392;
[0015](2)將步驟⑴得到的載體pWJ-392轉(zhuǎn)化入拜氏梭菌中，獲得Cbei_4110基因插入
失活的重組菌株。
[0016]具體可通過如下方法構(gòu)建基因工程菌:在線設(shè)計內(nèi)含子序列并基因合成，構(gòu)建Cbei_4110基因缺失載體，并將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化拜氏梭菌，篩選出陽性重組菌。將含有重組載體的菌株劃線挑選，菌落PCR篩出內(nèi)含子插入的重組菌株，再將內(nèi)含子插入的重組菌株在含有和不含有紅霉素抗性平板上復(fù)篩，獲得載體丟失、且Cbei_4110基因插入失活的目標(biāo)重組菌株。
[0017]步驟⑴中，以含有二型內(nèi)含子的大腸桿菌-拜氏梭菌穿梭載體pWJ為出發(fā)載體，構(gòu)建Cbei_4110基因的插入失活載體pWJ-392。
[0018]步驟(2)中，將載體pWJ-392引入拜氏梭菌中，實(shí)現(xiàn)Cbei_4110基因的插入失活，采用電轉(zhuǎn)化法。
[0019]上述高產(chǎn)丁醇的基因工程菌株在發(fā)酵制備丁醇中的應(yīng)用。
[0020]有益效果:本發(fā)明 是借助含有二型內(nèi)含子的大腸桿菌-拜氏梭菌穿梭載體pWJ，實(shí)現(xiàn)拜氏梭菌中編碼NADH-輔酶Q氧化還原酶關(guān)鍵亞基的Cbei_4110基因的插入失活，構(gòu)建得到Cbei_4110基因失活的重組菌株。本發(fā)明的基因工程菌株，以葡萄糖為碳源時，在2L發(fā)酵罐中總?cè)軇┊a(chǎn)量和丁醇產(chǎn)量分別達(dá)到了 12.7g/L和9.9g/L，分別比出發(fā)菌提高了 17.5%和25.3%，丁醇比高達(dá)78%，糖轉(zhuǎn)化率高達(dá)0.42，利用本發(fā)明方法構(gòu)建的重組菌株，能提高丁醇產(chǎn)量和糖轉(zhuǎn)化效率，降低生產(chǎn)成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明Cbei_4110基因插入失活載體pWJ-392的質(zhì)粒圖譜。
[0022]圖2為本發(fā)明使用二型內(nèi)含子插入失活的機(jī)理圖。
[0023]圖3為挑取轉(zhuǎn)化子菌落PCR電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0025]實(shí)施例1:
[0026]本實(shí)例說明拜氏梭菌Cbei_4110基因插入失活重組菌株的構(gòu)建方法。
[0027]1.設(shè)計內(nèi)含子序列
[0028]根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的拜氏梭菌的Cbei_4110基因序列，借助軟件設(shè)計合適的插入基因位點(diǎn)(http://www.clostron.com),選擇插入在392和393之間，并生成內(nèi)含子序列，合成內(nèi)含子序列S-392，其序列如SEQ ID NO:2所示，并設(shè)計引物:[0029]
【權(quán)利要求】
1.一種高產(chǎn)丁醇的基因工程菌株，其特征在于，它是在拜氏梭菌中插入失活編碼NADH-輔酶Q氧化還原酶關(guān)鍵亞基的基因Cbei_4110，從而得到重組菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)丁醇的基因工程菌株，其特征在于，所述的拜氏梭菌為拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NCIMB8052。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)丁醇的基因工程菌株，其特征在于，所述的基因Cbei_4110，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
4.權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)丁醇的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，它包括如下步驟: (1)構(gòu)建Cbei_4110基因的插入失活重組載體； (2)將步驟(1)得到的重組載體轉(zhuǎn)化入拜氏梭菌中，獲得Cbei_4110基因插入失活的重組菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高產(chǎn)丁醇的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中，以含有二型內(nèi)含子的大腸桿菌-拜氏梭菌穿梭載體PWJ為出發(fā)載體，構(gòu)建Cbei_4110基因的插入失活載體pWJ-392。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高產(chǎn)丁醇的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中，將PWJ-392引入拜氏梭菌中，實(shí)現(xiàn)Cbei_4110基因的插入失活，采用電轉(zhuǎn)化法。
7.權(quán)利要求1所述 的高產(chǎn)丁醇的基因工程菌株在發(fā)酵制備丁醇中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12P7/16GK103820367SQ201410069441
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】應(yīng)漢杰, 王冬, 郭亭, 劉俊, 華瑩, 謝婧婧, 陳勇 申請人:南京工業(yè)大學(xué)