番鴨細小病毒和鵝細小病毒的hrm鑒別方法、試劑盒和引物組的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種番鴨細小病毒和鵝細小病毒的HRM鑒別方法、試劑盒和引物組，所述檢測方法包括如下步驟：（1）設計一組可同時擴增番鴨細小病毒和鵝細小病毒的通用PCR引物；（2）從待測樣品中提取病毒基因組DNA作為模板DNA；（3）利用步驟（1）的引物組對模板DNA進行PCR擴增；（4）對擴增產(chǎn)物進行HRM分析，鑒別MDPV和GPV。本發(fā)明方法：可快速、有效鑒別MDPV和GPV；檢測速度快且高通量：5～10分鐘即可完成96/384孔板的PCR產(chǎn)物檢測，極大縮短了檢測時間；對PCR產(chǎn)物無損害，檢測后還可以進行后續(xù)分析，如測序和凝膠電泳等。
【專利說明】番鴨細小病毒和鵝細小病毒的HRM鑒別方法、試劑盒和引物組
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學【技術(shù)領域】，具體涉及一種番鴨細小病毒(MDPV)和鵝細小病毒(GPV)的HRM鑒別方法、鑒別試劑盒和引物組。
【背景技術(shù)】
[0002]番鴨細小病毒(Muscovyduck parvovirus, MDPV)和鶴細小病毒(gooseparvovirus, GPV)是兩種水禽病毒。MDPV和GPV兩種病毒粒子的理化特性、形態(tài)結(jié)構(gòu)非常相似，因此很難通過顯微觀察將這兩種病毒鑒別區(qū)分開來。其基因組同源性達81.9 %，氨基酸同源性達到88.96 %，其中結(jié)構(gòu)蛋白VPl的同源性達87.57 %，從而決定了它們在抗原性上的高度同源，同時也使這兩種病毒的抗血清之間存在交叉保護性。所以，在乳膠凝集試驗、瓊脂擴散試驗、熒光抗體試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗等常規(guī)的血清學檢測方法中，只有應用MDPV和GPV單克隆抗體才能將這兩種病毒區(qū)分開來。這無疑提高了鑒別的成本和操作復雜性。
[0003]雖然國內(nèi)的許多學者已經(jīng)針對MDPV和GPV基因組分別設計特異性的引物，建立了鑒別MDPV和GPV的PCR檢測技術(shù)，但是該方法通常需要設計2對特異性的引物，而且判定結(jié)果需要進行凝膠電泳，所以該方法在進行高通量的檢測任務時會顯得費時費力。
[0004]高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(High Resolution Melting ),簡稱HRM ,其技術(shù)原理主要是基于核酸分子物理性質(zhì)的不同:不同核酸分子的片段長短、GC含量、GC分布等是不同的，因此任何雙鏈DNA分子在加熱變性時都會有自己熔解曲線的形狀和位置。HRM技術(shù)的基本原理就是根據(jù)熔解曲線的不同來對樣品來進行區(qū)分。

【發(fā)明內(nèi)容】

`[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)中所存在的不足，本發(fā)明通過分析MDPV和GPV基因組，在VP3基因中找出了一段相對保守序列，針對該序列設計了一對既能擴增MDPV又能擴增GPV的通用弓丨物，我們利用該引物對MDPV和GPV DNA進行PCR擴增，然后通過實時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴增產(chǎn)物的結(jié)合情況，采集熒光數(shù)據(jù)，根據(jù)兩者熔解曲線的不同來鑒別MDPV 和 GPV。
[0006]因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種快速鑒別番鴨細小病毒和鵝細小病毒的HRM方法。
[0007]本發(fā)明的另一個目的在于提供一組用于快速鑒別番鴨細小病毒和鵝細小病毒的引物。
[0008]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用于快速鑒別番鴨細小病毒和鵝細小病毒的HRM試劑盒。
[0009]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種快速鑒別番鴨細小病毒和鵝細小病毒的HRM方法，其步驟包括:(1)設計一組可同時擴增番鴨細小病毒和鵝細小病毒的通用PCR引物；
(2)從待測樣品中提取病毒基因組DNA作為模板DNA ；
(3 )利用步驟(1)的引物組對模板DNA進行PCR擴增；
(4)對擴增產(chǎn)物進行HRM分析，鑒別MDPV和GPV。
[0010]作為優(yōu)選的，所述PCR引物的序列如下所示:
MGV-Pl:ATGGCAGAGGGAGGAAGC (SEQ ID N0:1)；
MGV-P2:TGCGTCGTGACTTCTTTAACTTGC (SEQ ID NO:2)。
[0011]所述PCR擴增的反應體系為: ddH20 4.6 μ l
5XQ5 Reaction buffer 2 μ l
2.5 mM dNTP0.8 μ l
MGV-Pl0.5μ l
MGV-P20.5 μ l
模板DNA I μ l Q5 High-Fidelity DNA Polymerase0.1 μ l
LC green 染料0.5 μ l
Total 10 μl。
[0012]所述PCR擴增的反應程序為:98°C預變性30s ;98°C變性10s，55°C退火20s，72°C延伸20s ;循環(huán)35次；72°C終延伸2min。
[0013]一組用于快速鑒別番鴨細小病毒和鵝細小病毒的引物，其核苷酸序列分別如下所示:
MGV-Pl:ATGGCAGAGGGAGGAAGC (SEQ ID N0:1)；
MGV-P2:TGCGTCGTGACTTCTTTAACTTGC (SEQ ID NO:2)。
[0014]一種用于快速鑒別番鴨細小病毒和鵝細小病毒的HRM試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物組、Taq DNA聚合酶、PCR反應緩沖液、dNTP、熒光染料，陽性對照和陰性對照。
[0015]所述熒光染料為LC green飽和熒光染料。
[0016]所述陽性對照為含有MDPV的VP3基因序列(SEQ ID NO: 3)的質(zhì)粒和含有GPV的VP3基因序列(SEQ ID N0:4)的質(zhì)粒；所述陰性對照為ddH20。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明方法和試劑盒的穩(wěn)定性和重復性高，可準確、有效鑒別MDPV和GPV，且檢測速度快且高通量，5~10分鐘即可完成96/384孔板的PCR產(chǎn)物檢測，極大縮短了檢測時間，降低鑒別成本；
(2)本方法不需要進行PCR產(chǎn)物的分離，真正實現(xiàn)了閉管操作，避免污染；
(3)對PCR產(chǎn)物無損害，檢測后還可以進行后續(xù)分析，如測序和凝膠電泳等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是MDPV和GPV質(zhì)粒樣品標準化熔解曲線圖；圖2是MDPV和GPV質(zhì)粒樣品峰型化熔解曲線圖；
圖3是MDPV和GPV臨床樣品PCR的電泳圖；
圖4是MDPV和GPV臨床樣品DNA標準化熔解曲線圖；
圖5是MDPV和GPV臨床樣品DNA峰型化熔解曲線圖；
圖6是MDPV和GPV臨床樣品DNA差異化熔解曲線圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0020]實施例1番鴨細小病毒(MDPV)和鵝細小病毒(GPV)的HRM快速鑒別試劑盒的建立:
1、引物設計:以MDPV-FM和GPV-B的VP3基因(GenBank登錄號分別為U22967和U25749)為靶基因，設計一對引物，序列如下:
MGV-Pl:ATGGCAGAGGGAGGAAGC (SEQ ID N0:1)；
MGV-P2:TGCGTCGTGACTTCTTTAACTTGC (SEQ ID NO:2)。
[0021]2、PCR反應液:Taq DNA聚合酶；5XPCR反應緩沖液；2.5 mM dNTP ;熒光飽和染料；
3、陽性對照為MDPV和GPV的陽性質(zhì)粒，陰性對照為ddH20。
[0022]其中陽性質(zhì)粒的制備方法如下:
用TaKaRa公司的試劑盒將MDPV的VP3基因(SEQ ID NO: 3)和GPV的VP3基因(SEQID N0:4)分別連接至pMD-18T載體中，通過氨芐篩選、測序，篩選得到陽性克隆子即為陽性對照。
[0023]實施例2建立番鴨細小病毒(MDPV)和鵝細小病毒(GPV) HRM快速鑒別方法 利用實施例1的試劑盒快速鑒別番鴨細小病毒(MDPV)和鵝細小病毒(GPV)的方法，包
括如下步驟:
1、對實施例1制備的MDPV和GPV的陽性質(zhì)粒進行DNA濃度測定，使PCR起始模板濃度
相對一致。
[0024]2、PCR擴增反應
(I) PCR 反應體系:5XQ5 Reaction buffer 2μ 1,2.5 mM dNTP 0.8 μ I, MGV-Pl(10 μ Μ) 0.5 μ I, MGV-Pl (10 μ Μ) 0.5 μ I, Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.1μ 1，質(zhì)粒DNA 0.5 μ 1，LC Green 0.5 μ 1，用超純水補齊到10 μ I ;將配制好的反應管混勻、離心后上機。
[0025](2) PCR反應程序如下:
98°C預變性30s ；
98°C變性10s，55。。退火20s，72。。延伸20s ;循環(huán)35次；
72°C終延伸2min。
[0026]HRM分析設定的熔解速率為0.3°C /s ；
3、質(zhì)粒PCR擴增產(chǎn)物的HRM分析:
利用Rotor-Gene Q(Qiagen)進行PCR擴增和HRM分析。番鴨細小病毒(MDPV)和鵝細小病毒(GPV)陽性質(zhì)粒的HRM分析圖見圖1~2。從質(zhì)粒標準化和峰型化熔解曲線圖可以看出，MDPV和GPV質(zhì)粒PCR擴增產(chǎn)物具有各自特有的熔解曲線，表明本發(fā)明的方法可以有效區(qū)分MDPV和GPV。
[0027]實施例3番鴨細小病毒(MDPV)和鵝細小病毒(GPV)HRM快速鑒別方法的應用評價
1、待檢樣品基因組DNA的提取:用試劑盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit
Ver.4.0提取樣品中的MDPV和GPV的基因組DNA。本發(fā)明的樣品為病毒的尿囊液和細胞上清。
[0028]2、普通PCR擴增反應:
(I)PCR 反應體系:25μ I 反應體系:5XQ5 Reaction buffer 5μ 1,2.5 mM dNTP 2 μ 1，MGV-Pl (10 μ Μ) 1.25 μ 1，MGV-Pl (10 μ Μ) 1.25 μ 1，Q5 High-Fidelity DNA Polymerase
0.25 μ 1，待測樣品DNA I μ 1，用超純水補齊到25 μ I ;將配制好的反應管混勻、離心后上機。
[0029](2) PCR 反應程序:
98°C預變性30s ；
98°C變性10s，55。。退火20s，72。。延伸20s ;循環(huán)35次；
72°C終延伸2min。
`[0030]3、將上述普通PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，其電泳圖如圖3所示。圖中，M為DL1000 DNA marker, 1-3為MDPV待檢樣品，4-6為GPV的待檢樣品，7為陰性對照。從圖中可以看出，所設計的通用引物均能對MDPV和GPV DNA進行擴增，并得到目的片段大小為371bp的擴增條帶。
[0031]4、樣品擴增產(chǎn)物HRM分析:
DNA的PCR擴增與實施例2的質(zhì)粒PCR擴增操作相同，每個DNA樣品重復2次。利用Rotor-Gene Q(Qiagen)進行 PCR 擴增和 HRM 分析。3 株 MDPV (M1,M2,M3)^P 3 株 GPV (G1,G2，G3)序列HRM結(jié)果分別如圖4~6所示。圖4、圖5和圖6分別為標準化熔解曲線圖、峰型化熔解曲線圖和差異化熔解曲線圖。從3種不同形式的熔解曲線圖上可看出MDPV和GPVHRM圖相互分開，已達到鑒別兩種病毒的目的。標準化熔解曲線圖是由原始熔解曲線圖經(jīng)過標準化處理后得到，最大限度地消除了由于起始模板濃度不同而造成熒光信號值的差異。峰型化熔解曲線圖是對標準化熔解曲線圖進行導數(shù)化處理后得到，峰型化熔解曲線圖更加明顯地反應出了 MDPV和GPV VP3序列的差異。為了更直觀地區(qū)分MDPV和GPV，對熔解曲線圖進行差異化處理，即使Gl的信號變化設為零并與其它5個毒株比較。從圖6上可看出3個MDPV和3個GPV的毒株明顯地分開。以上3種不同形式的熔解曲線圖是由Rotor-GeneQ software version 2.1.0 軟件完成。
[0032]從圖4~6可以看出，同一樣品具有基本相同的HRM曲線，說明本發(fā)明方法具有很好地穩(wěn)定性和可重復性。從圖2和圖5可以看出，質(zhì)粒的熔解曲線和實際DNA樣本熔解曲線的形狀基本相同，具有很好的符合性。
[0033]從上述HRM結(jié)果來看，3株MDPV和3株GPV可以通過HRM區(qū)分，盡管3株MDPV在Tm值有細微差異，但是熔解曲線基本一致；3株GPV的Tm值和熔解曲線基本一致。
[0034]綜上所述，MDPV和GPV具有各自特異性的HRM曲線，且該HRM曲線具有很好的穩(wěn)定性，通過簡單對比，可以快速有效地鑒別MDPV和GPV。
【權(quán)利要求】
1.一種快速鑒別番鴨細小病毒和鵝細小病毒的HRM方法，其步驟包括: (O設計一組可同時擴增番鴨細小病毒和鵝細小病毒的通用PCR引物； (2)從待測樣品中提取病毒基因組DNA作為模板DNA ； (3 )利用步驟(1)的引物組對模板DNA進行PCR擴增； (4)對擴增產(chǎn)物進行HRM分析，鑒別MDPV和GPV。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR引物是以番鴨細小病毒和鵝細小病毒的VP3基因為靶基因設計的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PCR引物的序列如下所示: MGV-Pl:ATGGCAGAGGGAGGAAGC (SEQ ID N0:1)；
MGV-P2:TGCGTCGTGACTTCTTTAACTTGC (SEQ ID NO:2)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應體系為: ddH20 4.6 μl 5XQ5 Reaction buffer 2 μl 2.5 mM dNTP0.8 μl MGV-Pl0.5μ l MGV-P20.5 μ l 模板DNA l μ l Q5 High-Fidelity DNA Polymerase0.1 μ l LC green 染料0.5 μ l
Total 10 μ l
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應程序為:98°C預變性30s ;98°C變性10s，55。。退火20s，72。。延伸20s ;循環(huán)35次；72°C終延伸2min ;HRM分析設定的熔解速率為0.3°C /s。
6.一組用于快速鑒別番鴨細小病毒和鵝細小病毒的引物，其核苷酸序列分別如下所示:
MGV-Pl:ATGGCAGAGGGAGGAAGC (SEQ ID N0:1)；
MGV-P2:TGCGTCGTGACTTCTTTAACTTGC (SEQ ID NO:2)。
7.一種用于快速鑒別番鴨細小病毒和鵝細小病毒的HRM試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括權(quán)利要求6所述的引物組。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還含有TaqDNA聚合酶、PCR反應緩沖液、dNTP、熒光染料，陽性對照和陰性對照。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光染料為LCgreen飽和熒光染料。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照為含有番鴨細小病毒VP3基因序列的質(zhì)粒和含有鵝細小病毒VP3基因序列的質(zhì)粒；所述陰性對照為ddH20。
【文檔編號】C12Q1/68GK103866048SQ201410069519
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】郭鵬舉, 董嘉文, 張建峰, 陳琴苓, 嘎利兵嘎, 孫敏華, 李林林 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所