一對(duì)用于綿羊dkk4基因打靶的前導(dǎo)rna的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一對(duì)用于綿羊DKK4基因打靶的前導(dǎo)RNA(sgRNA)，該sgRNA對(duì)由sgRNA-F和sgRNA-R組成，sgRNA-F和sgRNA-R分別由101個(gè)核苷酸組成，其中5’末端20nt的RNA片段能識(shí)別綿羊染色體上DKK4基因，其余81nt的RNA片段為能與Cas9n核酸酶結(jié)合的骨架RNA片段；所述的sgRNA-F如序列表的序列2所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列4所示。本發(fā)明通過Cas9系統(tǒng)在細(xì)胞或個(gè)體水平上對(duì)綿羊DKK4基因進(jìn)行敲除或修飾，以解析綿羊DKK4基因的功能、構(gòu)建綿羊DKK4基因突變庫，為綿羊育種服務(wù)。
【專利說明】—對(duì)用于綿羊DKK4基因打靶的前導(dǎo)RNA
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一對(duì)用于綿羊DKK4基因打靶的前導(dǎo) RNA。
【背景技術(shù)】
[0002]DKK基因家族是WNT信號(hào)通路的抑制因子，而WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控毛囊的生長發(fā)育。DKK4是DKK基因家族的重要成員。Sick等使用反應(yīng)-擴(kuò)散模型預(yù)測(cè)，DKK的表達(dá)量下降或降解加速會(huì)導(dǎo)致毛囊間距降低(Wnt and dkk determine hair follicle spacingthrough a react ion-diffus ion mechanism.Science.Sick et al,2006)。與這一予頁測(cè)相一致的是，抑制BMP信號(hào)導(dǎo)致毛囊密度增加(Making waves with hairs.J Invest Dermatol.Plikus etal, 2004),而抑制 BMP 可能降低 DKK4 表達(dá)(The Wnt antagonist Dickkopf-1isregulated by Bmp signaling and c-Jun and modulates programmed cell death.EMBOJ.Grotewold et al，2002)。由此可見，DKK4是細(xì)毛羊育種的重要候選基因。在細(xì)胞或個(gè)體水平上對(duì)綿羊DKK4基因進(jìn)行敲除或修飾，可解析綿羊DKK4基因的功能，為細(xì)毛羊的羊毛細(xì)度育種服務(wù)。
[0003]ZFN和TALEN打靶技術(shù)是目前研究較為成熟的兩種定點(diǎn)突變技術(shù)，但是這兩種技術(shù)構(gòu)建程序較為繁瑣，每一個(gè)位點(diǎn)需要構(gòu)建一對(duì)相應(yīng)的核酸酶，而CRISPR / Cas9系統(tǒng)對(duì)特異位點(diǎn)的識(shí)別靠小的crRNA的引導(dǎo)，CRISPR區(qū)可以有一系列的crRNA組成，每個(gè)針對(duì)特異位點(diǎn)的crRNA只有幾 十個(gè)堿基，整個(gè)載體較小，相對(duì)于ZFN和TALEN載體，更加容易構(gòu)建(CRISPR / Cas9新型基因打靶系統(tǒng)的研究進(jìn)展.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào).李輝等，2013)。
[0004](CRISPR) / CRISPR-associated (Cas)是細(xì)菌和古細(xì)菌一種不斷進(jìn)化適應(yīng)的免疫防御機(jī)制。CRISPR / Cas9利用一段小RNA來識(shí)別并剪切DNA以降解外來核酸分子。Cong等(Multiplex Genome Engineering Using CRlSPR / Cas Systems.Science.2013)及Mali 等(RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science.2013)證明 Cas9系統(tǒng)能在293T、K562、iPS等多種細(xì)胞中，進(jìn)行有效的靶向酶切，非同源重組(NHEJ)、同源重組(HR)效率在3-25%之間，與TALEN酶切效果相當(dāng)。他們還證明，多個(gè)靶點(diǎn)可以同時(shí)進(jìn)行祀向酶切。但是，隨后的研究表明，Cas9存在較為明顯的脫祀效應(yīng)(High-frequencyoff-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.NatureBiotechnology.Fu et al, 2013 ;High_throughput profiling of off-target DNAcleavage reveals RNA-programmed Cas9nuclease specificity.Nature Biotechnology.Pattanayak etal, 2013)。麻省理工學(xué)院Feng Zhang團(tuán)隊(duì)使用雙切刻技術(shù)將Cas9的特異性提高了 50 倍以上(Double nicking by RNA-guided CRlSPR Cas9for enhanced genomeediting specificity.Cell.Ran et al, 2013),維護(hù)了 Cas9 在基因打祀【技術(shù)領(lǐng)域】的地位。借助于這一技術(shù)，動(dòng)植物基因功能研究及育種等等都將得到迅猛的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一對(duì)用于綿羊DKK4基因打靶的前導(dǎo)RNA(SgRNA)。本發(fā)明利用編碼這對(duì)sgRNA部分序列的短片段DNA構(gòu)建表達(dá)載體，該表達(dá)載體能夠表達(dá)出這對(duì)sgRNA，這對(duì)sgRNA能夠特異性地識(shí)別綿羊DKK4基因。本發(fā)明還利用這對(duì)sgRNA引導(dǎo)Cas9n核酸酶(即Cas9切刻酶)對(duì)綿羊DKK4基因進(jìn)行準(zhǔn)確、高效的靶向修飾。
[0006]具體地，本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一對(duì)用于綿羊DKK4基因打祀的sgRNA,由sgRNA-F和sgRNA-R組成；所述sgRNA由101個(gè)核苷酸組成，其中5’末端20nt的RNA片段(分別命名為sgRNA_F20和sgRNA_R20)可以識(shí)別綿羊染色體上DKK4基因的特定DNA序列，其余81nt稱為骨架RNA片段。骨架RNA片段可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，與Cas9n核酸酶結(jié)合，從而引導(dǎo)Cas9n核酸酶切割靶標(biāo)DNA單鏈，兩個(gè)單鏈切口導(dǎo)致雙鏈斷裂(DSB)，細(xì)胞利用自身修復(fù)功能，使得靶標(biāo)位點(diǎn)附近的序列發(fā)生變化；另外，這對(duì)sgRNA識(shí)別的DNA靶序列呈“頭對(duì)頭”的排布方式(即二者的5’末端相互靠近)，二者相距39bp，即有39bp的間隔。
[0008]所述sgRNA-F具體可如序列表的序列2所示。
[0009]所述sgRNA-R具體可如序列表的序列4所示。
[0010]本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供一對(duì)DNA分子(命名為特異DNA分子對(duì))，由編碼所述sgRNA-F的DNA分子甲和編碼所述sgRNA-R的DNA分子乙組成。
[0011]所述DNA分子甲具體可如序列表的序列I所示。
[0012]所述DNA分子乙具體可如序列表的序列3所示。
[0013]本發(fā)明第三個(gè)目的是提供上述一對(duì)sgRNA在特異識(shí)別和靶向修飾綿羊DKK4基因中的應(yīng)用。所述綿羊DKK4基因，其基因組序列是NCBI GI為417531883的一段區(qū)域(35707361-35713520)。
[0014]本發(fā)明第四個(gè)目的是提供上述一對(duì)sgRNA在構(gòu)建綿羊DKK4基因突變庫中的應(yīng)用。所述綿羊DKK4基因，其基因組序列是NCBI GI為417531883的一段區(qū)域(35707361-35713520)。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一對(duì)特異識(shí)別綿羊DKK4基因的sgRNA，并提供了該sgRNA對(duì)的編碼DNA片段，從而通過Cas9系統(tǒng)在細(xì)胞或個(gè)體水平上對(duì)綿羊DKK4基因進(jìn)行敲除或修飾，以解析綿羊DKK4基因的功能、構(gòu)建綿羊DKK4基因突變庫，為綿羊育種服務(wù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為sgRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)果示意圖，其中”代表省略若干堿基，箭頭處代表單鏈切刻位點(diǎn)(兩個(gè)單鏈切口產(chǎn)生一個(gè)雙鏈斷裂)。
[0017]圖2為質(zhì)粒對(duì)pX335-sgRNA-F與pX335_sgRNA-R共轉(zhuǎn)染綿羊SEF細(xì)胞48小時(shí)后提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物克隆后的部分測(cè)序結(jié)果(突變序列)，其中.”代表省
略若干堿基。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中，如無特殊說明，均采用低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。
[0019]pX335載體購自Addgene，貨號(hào)42335。Bbs I內(nèi)切酶購自NEB公司，貨號(hào)R0539S。DNA寡核苷酸均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。
[0020]實(shí)施例1、sgRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)的構(gòu)建
[0021]1、sgRNA 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)
[0022]在GI =417531883的序列中提取綿羊DKK4基因的一段序列(包括第一外顯子的編碼區(qū)及其5’端部分非翻譯區(qū)域，region:35713285_35713472，如下所示)，設(shè)計(jì)靶標(biāo)位點(diǎn)(http: / / zifi 七.partners, org / ziFiT)。
[0023]I ccatctcggc caaagctcca ctgcgggtgc agagctgccc agcttcaaag aggacgcggg
[0024]61 gaggtctgag agggtcgagg atgatgctgg tggtcctgct ggggctcggc tggctgtgcg
[0025]121 ccccccttgg agccctggtt atggatttca gcgttaagaa ctctgctgat gaacaagagg
[0026]181 cccaggag
[0027]正向靶序列是GATGATGCTGGTGGTCCTGC (80-99)、反向靶序列是GGGCAGCTCTGCACCCGCAG (21-40)。兩個(gè)靶序列呈“頭對(duì)頭”的排布方式，二者相距39bp，即有39bp的間隔。分別命名為正向靶標(biāo)Tl、反向靶標(biāo)T2。靶標(biāo)設(shè)計(jì)如圖1所示。
[0028]2、sgRNA表達(dá) 質(zhì)粒對(duì)的構(gòu)建
[0029]首先根據(jù)設(shè)計(jì)的靶序列送北京六合華大基因科技股份有限公司合成單鏈寡核苷酸，具體序列如下:
[0030]Tl-F:CACCGATGATGCTGGTGGTCCTGC
[0031]Tl-R:AAACGCAGGACCACCAGCATCATC
[0032]T2-F: CACCGGGCAGCTCTGCACCCGCAG
[0033]T2-R:AAACCTGCGGGTGCAGAGCTGCCC
[0034]其中Tl-F與Tl-R退火獲得帶粘性末端的雙鏈DNA片段，經(jīng)Bbs I酶切，連入pX335載體中，獲得pX335-sgRNA-F載體；T2_F與T2-R退火獲得帶粘性末端的雙鏈DNA片段，經(jīng)Bbs I酶切，連入pX335載體中，獲得pX335-sgRNA-R載體。兩個(gè)質(zhì)粒均送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序引物bbsR的序列為:5’ AAAGTCCCTATTGGCGTTAC3'。
[0035]實(shí)施例2、通過測(cè)序驗(yàn)證實(shí)施例1構(gòu)建的sgRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)的生物活性
[0036]綿羊胎兒成纖維細(xì)胞(SEF):分離培養(yǎng)方法參見文獻(xiàn):孟凡華，肖紅梅，張東，周歡敏.蒙古綿羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)與特性分析.《中國畜牧獸醫(yī)》2012年第3期，136-140.[0037]1、將重組質(zhì)粒pX335-sgRNA-F與pX335_sgRNA-R各4yg通過電轉(zhuǎn)化的方式共轉(zhuǎn)染IXlO6SEF細(xì)胞，得到重組細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的具體步驟是:使用核轉(zhuǎn)儀(Amnaxa，型號(hào):AAD-100IS)及配套的哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒(Amnaxa，貨號(hào):VPI_1002)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。首先使用0.05%胰蛋白酶(Gibco，貨號(hào):610-5300AG)消化貼壁細(xì)胞，用胎牛血清(Gibco，貨號(hào):16000-044)終止消化，磷酸鹽緩沖液(Gibco，貨號(hào):10010-023)洗滌細(xì)胞兩次，添加轉(zhuǎn)染試劑，使用程序T-016轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0038]2、將步驟I得到的重組細(xì)胞37°C (培養(yǎng)48小時(shí)，然后收集細(xì)胞。具體步驟是:首先使用0.05%胰蛋白酶(Gibco，貨號(hào):610-5300AG)消化貼壁細(xì)胞，用胎牛血清(Gibco，貨號(hào):16000-044)終止消化，磷酸鹽緩沖液(Gibco，貨號(hào):10010-023)洗滌細(xì)胞兩次，添加200微升細(xì)胞裂解液GA (TIANGEN公司DNA提取試劑盒DP304中的組分)。
[0039]3、提取步驟2收集的細(xì)胞的基因組DNA并作為模板，用PCRF與PCRR組成的引物對(duì)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，回收 260bp 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物(PCRF:5’ CTGGCTTATGGCATTTCAC3’ ；PCRR:5’ CCTGGGCCTCTTGTTCATC3’)。DNA提取具體步驟是:使用TIANGEN公司DNA提取試劑盒(貨號(hào):DP304)提取DNA。在上一步所得裂解產(chǎn)物中添加20微升蛋白酶K溶液，混勻。加入200微升緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶液變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。加入200微升無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。將上述溶液加入一個(gè)吸附柱CB3中，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500微升緩沖液GD，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入700微升緩沖液Pw，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500微升緩沖液PW，12000rpm離心30秒，倒掉廢液。將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2分鐘。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200微升洗脫緩沖液TE，室溫放置5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。
[0040]4、將步驟3得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體(寶生物，貨號(hào):D101A)連接，得到連接產(chǎn)物。具體的連接步驟是:在微量離心管中配置下列DNA溶液:pMD18-T載體I微升，PCR產(chǎn)物4微升。加入5微升Solution I。16°C反應(yīng)30分鐘。
[0041]5、取5微升連接產(chǎn)物加入50微升DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(寶生物，D9057S)中，冰上放置30分鐘。42°C加熱90秒，再在冰上放置I分鐘。加入500微升SOC培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60分鐘。涂布于氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)挑取20個(gè)克隆并進(jìn)行測(cè)序，計(jì)算突變的克隆占總體克隆數(shù)的比例，從而估算出該對(duì)sgRNA質(zhì)粒的效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)克隆在預(yù)期切 割位點(diǎn)附近出現(xiàn)突變(詳見圖2)，即重組質(zhì)粒pX335-sgRNA-F與pX335-sgRNA-R組成的質(zhì)粒對(duì)在SEF細(xì)胞基因組中的切割效率達(dá)10%。
【權(quán)利要求】
1.一對(duì)用于綿羊DKK4基因打靶的SgRNA，由sgRNA-F和sgRNA-R組成，sgRNA-F和sgRNA-R分別由101個(gè)核苷酸組成，其中5’末端20nt的RNA片段能識(shí)別綿羊染色體上DKK4基因，其余81nt的RNA片段為能與Cas9n核酸酶結(jié)合的骨架RNA片段；所述的sgRNA-F如序列表的序列2所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列4所示。
2.—對(duì)DNA分子，由編碼權(quán)利要求1中的所述sgRNA-F的DNA分子甲和編碼權(quán)利要求1中的所述sgRNA-R的DNA分子乙組成。
3.如權(quán)利要求2所述的一對(duì)DNA分子，其特征在于:所述的DNA分子甲如序列表的序列I所示。
4.如權(quán)利要求2所述的一對(duì)DNA分子，其特征在于:所述的DNA分子乙如序列表的序列3所示。
5.權(quán)利要求1所述的一對(duì)sgRNA在特異識(shí)別和靶向修飾綿羊DKK4基因中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述 的一對(duì)sgRNA在構(gòu)建綿羊DKK4基因突變庫中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103805599SQ201410069931
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】趙金山, 柳楠, 劉積鳳, 李和剛, 劉開東 申請(qǐng)人:青島市畜牧獸醫(yī)研究所