一種復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備的降血脂酸馬乳及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備酸馬乳的方法及制備的酸馬乳。利用自篩選馬克思克魯維酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCC?No.8432基礎(chǔ)上，聯(lián)合乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）和紅曲霉菌（Monascusruber）組成復(fù)合菌種混合發(fā)酵，將接種比例、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、糖添加量多個單因素試驗(yàn)對發(fā)酵酸馬乳的影響，采用響應(yīng)面法優(yōu)化確定酸馬乳的最佳制備工藝參數(shù)，制備的酸馬乳具有顯著的降血脂功效，不僅保留了馬乳中豐富的營養(yǎng)，更賦予酸馬乳的保健功能，具有廣泛的應(yīng)用價值。
【專利說明】一種復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備的降血脂酸馬乳及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的，本發(fā)明涉及一種采用微生物菌種混合發(fā)酵制備功能酸馬乳的【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]馬乳是新疆少數(shù)民族飲食文化中的瑰寶。馬乳的營養(yǎng)價值很高，與其他畜類奶相比含有豐富的蛋白質(zhì)、乳糖、維生素和礦物質(zhì)，并含有人體不可缺少的氨基酸和脂肪酸。馬乳中富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，易被人體吸收利用，特別適合嬰幼兒和老弱病人飲用，且具有補(bǔ)虛強(qiáng)身、潤燥美膚、清熱止渴的作用。
[0003]酸馬乳是新疆少數(shù)民族特色食品中的一種，深受大家的喜愛。馬乳中富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，易被人體吸收利用，且具有補(bǔ)虛強(qiáng)身、潤燥美膚、清熱止渴的作用。臨床常用來輔助治療結(jié)核、肝損壞、壞血病、心臟病、高血壓、高血脂能等疾病。酸馬乳之所以具有良好的醫(yī)療保健功能，其一是因?yàn)樾迈r馬乳在微生物的 發(fā)酵作用下產(chǎn)生了大量的生物活性物質(zhì)；其二是因?yàn)轳R乳和酸馬乳中不飽和脂肪酸含量較高，其中亞油酸和亞麻酸含量則更高，使得酸馬乳具有降血脂等功能。據(jù)報道，現(xiàn)有成人高血脂癥的患病率為每天仍以萬人的速度遞增，早期控制并及時治療高脂血癥迫在眉睫。目前，國內(nèi)外未見采用多菌種復(fù)合發(fā)酵制備具備功能性酸馬乳的報道，研究開發(fā)具有實(shí)用性的微生物菌種獲得穩(wěn)定的具有降血脂功能的酸馬乳具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)中未見有關(guān)利用復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備降血脂酸馬乳開發(fā)利用的現(xiàn)狀，基于新疆地區(qū)各民族長期飲用酸馬乳的地緣優(yōu)勢，充分利用產(chǎn)地的微生物群落資源，開發(fā)適用于降血脂酸馬乳的復(fù)合微生物菌種制劑。本發(fā)明目的在于提供一種復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備的降血脂酸馬乳及其制備方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:通過以新疆產(chǎn)新鮮馬乳為原料，利用自篩選馬克思克魯維酵母菌基礎(chǔ)上，聯(lián)合干酪乳桿菌、乳酸乳球菌和紅曲霉菌組成復(fù)合菌種混合發(fā)酵，將接種比例、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、糖添加量多個單因素試驗(yàn)對發(fā)酵酸馬乳的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn),采用響應(yīng)面法優(yōu)化確定酸馬乳的最佳制備工藝參數(shù),確定提供一種復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備酸馬乳的方法及制備的酸馬乳，制備的酸馬乳具有降血脂功效，具有廣泛的實(shí)用性和開發(fā)價值，為充分開發(fā)利用馬乳資源具有重要的現(xiàn)實(shí)開發(fā)價值。
[0006]具體的，本發(fā)明提供了一種制備酸馬乳的馬克思克魯維酵母菌(Jluyveromycesmarxi anus ) WWMJ-1。
[0007]本發(fā)明選用的馬克思克魯維酵母菌fflarjria/ws) WWMJ-1,根據(jù)新疆的地理環(huán)境的特殊性，通過從新疆烏魯木齊南山地區(qū)哈薩克族牧民家采集的自制傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬乳中取樣，篩選出一批生長良好的微生物菌株，從酸馬乳中進(jìn)行微生物菌種的培養(yǎng)、分離與篩選，從中優(yōu)選出一株編號為WWMJ-1的菌株，菌種經(jīng)培養(yǎng)后菌落呈邊緣整齊、表面光滑、乳白色或奶油色，凸起的圓形，細(xì)胞呈橢圓或卵圓形，無性繁殖均為芽殖，有時有假菌絲，無子囊孢子和擲孢子；該細(xì)菌發(fā)酵半乳糖，有時緩慢，不發(fā)酵蔗糖及麥芽糖，不發(fā)酵蜜二糖，同化蔗糖，氮源同化(NH4)2S04、KN03 ;醇類同化乙醇和山梨醇。水解尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、類淀粉物質(zhì)的生成試驗(yàn)均為陰性，能夠在15°C生長，具有接種后生長穩(wěn)定，延遲期短，適應(yīng)快。經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定為馬克思克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus) ?
[0008]本發(fā)明采用的菌種編號為WWMJ-1的馬克思克魯維酵母菌UUuyveromycesmarxianus),該細(xì)菌經(jīng)YPD培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，挑取疑似酵母菌菌落進(jìn)行顯微鏡觀察，將其初步界定酵母菌菌株；該菌株在YPD培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)24-48h，能形成菌落呈邊緣整齊、表面光滑、乳白色或奶油色，凸起的圓形，細(xì)胞呈橢圓或卵圓形，無性繁殖均為芽殖，有時有假菌絲，無子囊孢子和擲孢子；該菌株培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度20-3(TC，最適培養(yǎng)溫度28°C ；優(yōu)先生長于Yro培養(yǎng)基表面，Yro培養(yǎng)基組分酵母膏10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，葡萄糖20.0g/L，蒸餾水1.0L, YPD固體培養(yǎng)基加瓊脂20.0g/L ;菌株在YPD固體培養(yǎng)基上菌落直徑大小為0.5-3mm,正面呈圓形，側(cè)面凸起；邊緣整齊、表面光滑；菌落不透明，呈乳白色或奶油色。該菌種的發(fā)酵工藝:在無菌條件下，挑取該菌株，28°C，135r/min培養(yǎng)24_48h。
[0009]參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》iiBergey，s Manual of SystematicBacterio-1ogy)))第九版和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》等對馬克思克魯維酵母菌(.Kluyveromyces marxianus)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測定、生理生化檢測，結(jié)合該菌種的菌落形態(tài)、生理生化特性，以及5.8S rDNA同源分析、系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，確定菌種編號為WWMJ-1菌株為馬克思克魯維酵母菌UUuyveromyces marxianus),該菌種于申請日前已保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101， 保藏日期是2013年11月5日，保藏號是CGMCC N0.8432。經(jīng)上述微生物學(xué)綜合鑒定歸屬為馬克思克魯維酵母菌(Λ7uyveromyces marxianus)。
[0010]本發(fā)明選用外購菌種。
[0011]本發(fā)明外購一株乳酸乳球菌(ZaciococciAs Jacii1S),該菌株具有產(chǎn)酸能力強(qiáng),發(fā)酵周期短的特點(diǎn)。該菌株培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度30_40°C，最適培養(yǎng)溫度37°C;h優(yōu)先生長于MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基表面；MRS培養(yǎng)基組分牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸鈉5.0g/L，檸檬酸氫二胺2.0g/L,吐溫-80 1.0 ml/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，七水硫酸鎂0.2g/L，七水硫酸錳0.05g/L，蒸餾水1.0L，MRS固體培養(yǎng)基加瓊脂20.0g/L。本發(fā)明提供了乳酸乳球菌(ZaciococcWs Iactis)的發(fā)酵工藝:在無菌條件下，挑取該菌株，37°C,135r/min 培養(yǎng) 18_24h。
[0012]本發(fā)明外購一株干酪乳桿菌casei),該菌株具有產(chǎn)酸能力強(qiáng),發(fā)酵周期短的特點(diǎn)。該菌株培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度30-40°C，最適培養(yǎng)溫度37°C;優(yōu)先生長于MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基表面；MRS培養(yǎng)基組分牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸鈉5.0g/L，檸檬酸氫二胺2.0g/L,吐溫-80 1.0 ml/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，七水硫酸鎂0.2g/L，七水硫酸錳0.05g/L，蒸餾水1.0L，MRS固體培養(yǎng)基加瓊脂20.0g/L。本發(fā)明提供了干酪乳桿菌casei)的發(fā)酵工藝:在無菌條件下,挑取該菌株,37°C,135r/min 培養(yǎng) 18_24h。
[0013]紅曲霉屬常見腐生真菌，能產(chǎn)生許多如紅曲色素、洛伐他汀A后文使用縮寫Μ.K)、桔霉素(桔青霉素)等活性成分次級代謝產(chǎn)物。紅曲中的Μ.K是醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的能夠降低人體膽固醇的理想藥劑，具有高效、安全、低毒的特點(diǎn)。而紅曲霉中有一種霉菌毒素一桔霉素已經(jīng)成為我國紅曲及相關(guān)產(chǎn)品出口的瓶頸。
[0014]本發(fā)明選用外購一株紅曲霉菌(ifoftascm rMer),該菌株具有產(chǎn)M.K能力高,桔霉素產(chǎn)量低的特點(diǎn)。該菌株培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度28-35°C，最適培養(yǎng)溫度30°C ;優(yōu)先生長于麥芽汁培養(yǎng)基，培養(yǎng)基表面；麥芽汁培養(yǎng)基組分麥芽浸粉130g/L、氯霉素0.lg/L，蒸餾水
1.0L，麥芽汁固體培養(yǎng)基加瓊脂20.0g/L。本發(fā)明提供了紅曲霉菌rMer)的發(fā)酵工藝:在無菌條件下，挑取該菌株，30 0C，135r/min培養(yǎng)48_72h。[0015]同時，本發(fā)明提供一種采用如上提供的菌種混合發(fā)酵制備酸馬乳的方法，具體制備方法步驟如下。
[0016](I)馬乳預(yù)處理:將新鮮馬乳通過過濾除去馬乳中的雜質(zhì)和異物，再將馬乳預(yù)熱到60-65°C，在20MPa條件下均質(zhì)10_15min，均質(zhì)后將馬乳巴氏殺菌，待發(fā)酵用；母發(fā)酵液、發(fā)酵液1、發(fā)酵液2需要預(yù)處理好的馬乳用量按體積比為3:20:20。
[0017](2)種子發(fā)酵液及母發(fā)酵液的制備。
[0018]種子發(fā)酵液:將4 °C下保存的乳酸乳球菌(ZaciococciAs 7acii5.)、干酪乳桿菌{Lactobacillus casei )、馬克思克魯維酵母菌 iKluyveromyces marxianus) WWMJ-1CGMCC N0.8432和紅曲霉菌(ifoftascws rwAer)菌種在無菌環(huán)境下接種,分別將乳酸乳球菌(.Lactococcus Jacii1S)和干釀乳桿菌{Lactobacillus casei)接種于 MRS 培養(yǎng)基置于 37°C培養(yǎng) 18-24h，將馬克思克魯維酵母菌焊cm marxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432接種于YPD培養(yǎng)基置于28°C培養(yǎng)24-48h，將紅曲霉菌iMonascus ruber)接種于麥芽汁培養(yǎng)基置于30°C培養(yǎng)48-72h活化，備用。
[0019]母發(fā)酵液:將步驟(1)預(yù)處理好的母發(fā)酵液選用馬乳用量按體積比分為3:3:10:14分裝于發(fā)酵容器中，在無菌條件下，將上述已活化好的乳酸乳球菌ilactococcuslactis.、、干酪乳桿菌{Lactobacillus casei )、馬克思克魯維酵母菌 iKluyveromycesmarxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432和紅曲霉菌(ifoaasciAs rwAer)種子發(fā)酵液按照體積比計5%接種量分別接入相應(yīng)的四個發(fā)酵容器中，分別置于37°C培養(yǎng)18-24h、28°C培養(yǎng)24-48h和30°C培養(yǎng)48-72h，備用。
[0020](3)發(fā)酵液的制備:發(fā)酵液由發(fā)酵液I和發(fā)酵液2組成。
[0021]發(fā)酵液I的制備:將步驟(2)制備的乳酸乳球菌、干酪乳桿菌、馬克思克魯維酵母菌發(fā)酵液用量按照體積比計(1.4-1.5):(1.4-1.5):(5-5.2)接種于步驟(1)預(yù)處理好選用發(fā)酵液I用量的馬乳中，在糖添加量為4-4.5g/100mL,發(fā)酵溫度32-33°C、發(fā)酵時間為50-55h條件下發(fā)酵得到發(fā)酵液I。
[0022]發(fā)酵液2的制備:將步驟(2)制備的紅曲霉母發(fā)酵液按照體積比計7-7.5%接種于步驟(1)預(yù)處理好選用發(fā)酵液2用量的馬乳中，在糖添加量為5 g/100ml，發(fā)酵溫度28-29°C、發(fā)酵時間7-8d條件下發(fā)酵得到發(fā)酵液2。
[0023](4)混合發(fā)酵液:將步驟(3)制備的發(fā)酵液I和發(fā)酵液2按照體積比計1:1的比例混合，進(jìn)行巴氏殺菌后進(jìn)行無菌灌裝，在4°C下保存。
[0024]進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種采用如上提供的復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備酸馬乳的方法，具體制備方法步驟如下。[0025](I)馬乳預(yù)處理:將新鮮馬乳通過過濾除去馬乳中的雜質(zhì)和異物，再將馬乳預(yù)熱到65°C，在20MPa條件下均質(zhì)lOmin，均質(zhì)后將馬乳巴氏殺菌，待發(fā)酵用；母發(fā)酵液、發(fā)酵液1、發(fā)酵液2需要預(yù)處理好的馬乳用量按體積比為3:20:20。
[0026](2)種子發(fā)酵液及母發(fā)酵液的制備:
種子發(fā)酵液:將4 °C下保存的乳酸乳球菌Ueictococcus Iactis),干酪乳桿菌{Lactobacillus casei)、馬克思克魯維酵母菌菌UUuyveromyces marxianus) WWMJ-1CGMCC N0.8432和紅曲霉菌(ifoftascws rwAer)菌種在無菌環(huán)境下接種,分別將乳酸乳球菌(.Lactococcus Jacii1S)和干釀乳桿菌{Lactobacillus casei)接種于 MRS 培養(yǎng)基置于 37°C培養(yǎng) 24h，將馬克思克魯維酵母菌marxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432 接
種于YPD培養(yǎng)基置于28°C培養(yǎng)48h，將紅曲霉菌rMer)接種于麥芽汁培養(yǎng)基置于30°C培養(yǎng)48h活化,備用。
[0027]母發(fā)酵液:將步驟(1)預(yù)處理好的選用母發(fā)酵液用量的馬乳按體積比分為3:3:10:14分裝于發(fā)酵容器中，在無菌條件下，將上述已活化好的乳酸乳球菌ilactococcuslactis.、、干酪乳桿菌{Lactobacillus casei )、馬克思克魯維酵母菌 iKluyveromycesmarxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432和紅曲霉菌(ifoaasciAs rwAer )種子發(fā)酵液用量按照體積比計5%接種量接入發(fā)酵容器中，分別置于37°C培養(yǎng)24h、28°C培養(yǎng)48h和30°C培養(yǎng)48h，備用。
[0028](3)發(fā)酵液的制備:發(fā)酵液由發(fā)酵液I和發(fā)酵液2組成。
[0029]發(fā)酵液I的制備:將步驟(2)制備的乳酸乳球菌、干酪乳桿菌、馬克思克魯維酵母菌發(fā)酵液按照體積比計1.5: 1.5:5接種于步驟(1)預(yù)處理好選用發(fā)酵液I用量的馬乳中，在糖添加量為4g/100mL，發(fā)酵溫度33°C、發(fā)酵時間為53h條件下發(fā)酵得到發(fā)酵液I。
[0030]發(fā)酵液2的制備:將步驟(2)制備的紅曲霉母發(fā)酵液按照體積比計7%接種于步驟(I)預(yù)處理好選用發(fā)酵液2用量的馬乳中，在糖添加量為5 g/100ml，發(fā)酵溫度29°C、發(fā)酵時間7d條件下發(fā)酵得到發(fā)酵液2。
[0031](4)混合發(fā)酵液:將步驟(3)制備的發(fā)酵液I和發(fā)酵液2按照體積比計1:1的比例混合，進(jìn)行巴氏殺菌后進(jìn)行無菌灌裝，在4°C下保存。
[0032]本發(fā)明提供采用上述確定的發(fā)酵工藝方法制備的酸馬乳，制備的酸馬乳具備特有產(chǎn)品典型性，其質(zhì)量特征如下。
[0033](I)感官指標(biāo):色澤:微黃色；香氣:具有酸馬乳固有的奶味香，酸味適中；滋味:口感微澀；體態(tài):乳濁液容許少許沉淀。
[0034](2)理化指標(biāo):總酸:150~160° T，還原糖含量≤6g/L，M.K含量為2.947Pg/mL，
桔霉素含量未檢出。
[0035](3)微生物指標(biāo):菌落總數(shù)(cfu/mL) ( 100 ;大腸菌群(MPN/100 mL) ( 3 ;致病菌:未檢出。
[0036]通過實(shí)施本發(fā)明具體的
【發(fā)明內(nèi)容】
，可以達(dá)到以下技術(shù)效果。
[0037](I)本發(fā)明提供的用于發(fā)酵制備酸馬乳的馬克思克魯維酵母菌焊marxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432,該菌株發(fā)酵能力強(qiáng)、熱穩(wěn)定性好,產(chǎn)香能力強(qiáng),產(chǎn)生抗生素，且具有抑菌性；在發(fā)酵過程中產(chǎn)生主要是二氧化碳和酒精，使其富有更加獨(dú)特的滋味和氣味。[0038](2)本發(fā)明提供了采用特定發(fā)酵工藝方法制備酸馬乳，本發(fā)明通過篩選獲得的馬克思克魯維酵母菌OffiiFce1S marxianus ) WWMJ-1 CGMCC N0.8432 基礎(chǔ)上，聯(lián)合乳酸乳球菌iLac tococcus lac iis )、干釀乳桿菌iLac tobaciIlus casei )、和紅曲霉菌(.Monascus ruber、組成復(fù)合菌種混合發(fā)酵,將接種比例、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、糖添加量多個單因素試驗(yàn)對發(fā)酵酸馬乳的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計，采用響應(yīng)面法優(yōu)化確定酸馬乳的最佳制備工藝參數(shù)，制備的酸馬乳具備特有產(chǎn)品典型性，且具有顯著的降血脂功效，不僅保留了馬乳中豐富的營養(yǎng)賦予酸馬乳的保健功能，具有廣泛的實(shí)用性和開發(fā)價值。
[0039]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1顯示為采用復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備降血脂酸馬乳的工藝流程圖。
[0040]圖2顯示為保藏菌株馬克思克魯維酵母菌的菌落形態(tài)圖。
[0041]圖3顯示為干馬克思克魯維酵母菌保藏菌株的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹圖。
[0042]圖4酸馬乳發(fā)酵接種比例與發(fā)酵溫度交互作用的響應(yīng)面圖。
[0043]圖5酸馬乳發(fā)酵發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間交互作用的響應(yīng)面圖。
[0044]圖6酸馬乳發(fā)酵糖添加量與發(fā)酵溫度交互作用的響應(yīng)面圖。
[0045]圖7顯示為不同紅曲霉接種量對馬乳的影響圖。
[0046]圖8顯示為不同發(fā)酵溫度對馬乳的影響圖。
[0047]圖9顯示為不同發(fā)酵時間對馬乳的影響圖。
[0048]圖10接種量和發(fā)酵溫度交互作用對M.K含量影響的響應(yīng)面圖。
[0049]圖11接種量和發(fā)酵時間交互作用對M.K含量影響的響應(yīng)面圖。
[0050]圖12發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度交互作用對M.K含量影響的響應(yīng)面圖。
【具體實(shí)施方式】
[0051]下面，舉實(shí)施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。
[0052]采用的主要的試劑:MRS培養(yǎng)基；YPD培養(yǎng)基；麥芽汁培養(yǎng)基；洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%，規(guī)格25mg)、桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.9%，規(guī)格IOmg) sigma公司；乙腈(色譜純)Fisher Chemicals公司；甲醇、95%乙醇、磷酸均為分析純；陽性對照藥品血脂康膠囊，北京北大維信生物科技有限公司產(chǎn)品；膽固醇、豬膽鹽，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)試劑盒及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；試驗(yàn)動物選用普遍的昆明種小鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。
[0053]本發(fā)明中選用的所有原輔材料、試劑和儀器、設(shè)備都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實(shí)施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實(shí)施方式的實(shí)施。
[0054]實(shí)施例一:馬克思克魯維酵母菌UUuyveromyces marxianus ) WWMJ-1 CGMCCN0.8432的篩選、分離純化和鑒定
初篩:取傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬乳ImL放入裝有9mL無菌生理鹽水的試管中，在旋渦混合器上充分混合均勻。將發(fā)酵酸馬乳以?ο倍級進(jìn)行稀釋，稀釋度為ιο'ιο'ιο'ιο'ιο'ιο-6。用移液器吸取上述稀釋度樣液各lmL，采用傾注法倒入YPD培養(yǎng)基，平板置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。觀察并記錄菌落特征并挑取疑似酵母菌菌落，并對疑似的菌種進(jìn)行編號。
[0055]菌種的純化:將疑似菌株再接種于YPD瓊脂培養(yǎng)基，于28 °C培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24-48h，重復(fù)3-4次純化酵母菌。純化后的酵母菌菌株接種于YPD斜面，28 °C培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24-48h后，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0056]根據(jù)新疆的地理特殊性，從新疆烏魯木齊南山地區(qū)哈薩克族自制傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬乳中進(jìn)行微生物菌種的培養(yǎng)、分離與篩選，獲得一批細(xì)菌，從中分離篩選出編號為CGMCCN0.8432的馬克思克魯維酵母菌(JUuyveromyces marxianus),其能夠產(chǎn)乙醇。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》iiBergey，s Manual of Systematic ifecierio-Jo#》)第九版和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》等對馬克思克魯維酵母菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)測定，生理生化檢測，確定編號為WWMJ-1的馬克思克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus)菌株為馬克思克魯維酵母菌{Kluyveromyces marxianus)中的成員。該菌株已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101，保藏日期是2013年11月5日，保藏號是CGMCC N0.8432。
[0057]菌株編號為WWMJ-1的培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度20_30°C，最適培養(yǎng)溫度28°C ;優(yōu)先生長于Yro培養(yǎng)基表面，Yro培養(yǎng)基組分采用酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，固體培養(yǎng)基加入20g/L瓊脂。菌株在固體培養(yǎng)基上菌落直徑大小為0.5-3mm，正面呈圓形，側(cè)面凸起；邊緣整齊；菌落不透明，呈乳白色或奶油色。見附圖2。
[0058]菌株馬克思克魯維酵母菌fflarjria/ws)WWMJ_1CGMCC N0.8432 的鑒定。
[0059](I)生理生化鑒定:該菌種經(jīng)Yro培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，挑取疑似酵母菌菌落進(jìn)行顯微鏡觀察，將其初步界定酵母菌菌株；該菌株在YPD培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)24-48 h，能形成菌落呈邊緣整齊、表面光滑乳白色或奶油色，凸起的圓形，細(xì)胞呈橢圓或卵圓形，參見附圖2。該細(xì)菌發(fā)酵半乳糖，有時緩慢，不發(fā)酵蔗糖及麥芽糖，不發(fā)酵蜜二糖，同化蔗糖，氮源同化(NH4)2SCV KNO3 ;醇類同化乙醇和山梨醇。水解尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、類淀粉物質(zhì)的生成試驗(yàn)均為陰性，能夠在15°C生長，經(jīng)5.8S r DNA同源分析、系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果都表明，編號為WWMJ-1的菌株經(jīng)生理生化鑒定鑒定為馬克思克魯維酵母菌QUuyverowcesmarxianus)。
[0060](2)5.8S rDNA序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析:將測序得到的5.8S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行BLAST分析，從中獲取相近的5.8S rDNA序列，用DNAstar構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果參見附圖3所示。菌株WWMJ-1隸屬于馬克思克魯維酵母菌Q(1 uyveromyces marxianus)，與 Kluyveromyces marxianus 親源關(guān)系最近，同源相似性達(dá)99%，但從基因序列菌株屬性分析存在明顯差異，確定菌株WWMJ-1為馬克思克魯維酵母菌，結(jié)合上述提供的菌種編號為WWMJ-1的菌落形態(tài)、生理生化特性，生物學(xué)分類名稱為馬克思克魯維酵母菌{Kluyveromyces marxianus)。菌株WWMJ-1的具體序列參見附后的序列表。
[0061]實(shí)施例二:培養(yǎng)基的選用
MRS培養(yǎng)基:葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸二胺2g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，吐溫_801mL，蒸餾水1000mL。
[0062]YPD培養(yǎng)基:酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL。[0063]麥芽汁培養(yǎng)基:麥芽浸粉130g、氯霉素0.1g,蒸餾水1000mL。
[0064]上述各培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基采用相應(yīng)添加瓊脂20.0g/L。
[0065]馬克思克魯維酵母菌fflarjria/ws)WWMJ-1CGMCC N0.8432 的生理生化試驗(yàn)培養(yǎng)基:硝酸鹽還原培養(yǎng)基:牛膏3g，蛋白胨5g，硝酸鉀lg，蒸餾水I OOOmL，將各成分溶于蒸餾水中，調(diào)PH至7.2-7.4，分裝試管，每管約5mL，121°C滅菌15min ；)產(chǎn)酸培養(yǎng)基:葡萄糖5g，滅菌的CaCO3 0.5g，酵母浸出液IOOmL,瓊脂2g，滅菌12rC，20min;產(chǎn)酯培養(yǎng)基:葡萄糖5g，10%豆芽汁100ml，分裝于50ml三角瓶中，每瓶20ml，滅菌121°C，20min ；無維生素基礎(chǔ)培養(yǎng)基:硫酸銨5g，葡萄糖10g，組氨酸鹽酸鹽10mg，甲硫氨酸20mg，色氨酸20mg,硼酸500mg,硫酸銅40 mg,碘化鉀100 mg,三氯化鐵200 mg,硫酸猛400 mg,鑰酸鈉200 mg,硫酸鋅400 mg,磷酸二氫鉀0.85g，磷酸氫二鉀0.15g，硫酸鎂0.5g，氯化鈉0.1g,氯化鈣0.lg，蒸餾水1000mL ;碳源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基:(NH4)2SO4 5 g, KH2PO4 lg, MgSO4.7H205g, CaCl2.2Η20 0.1g7NaCl 0.1g,糖或其他碳源5g,酵母膏0.2g,蒸懼水1000mL ;氮源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖20g, KH2PO4 lg, MgSO4.7H20 5g，酵母膏0.2g，蒸餾水1000mL ;尿素水解基礎(chǔ)培養(yǎng)基:蛋白胨lg，氯化鈉5g，葡萄糖lg，磷酸二氫鉀2g，0.4%酚紅溶液3mL，20%尿素溶液lOOmL，蒸餾水1000mL ;糖發(fā)酵培養(yǎng)基:牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，所試糖、苷或醇5g，1.6%溴甲酚紫酒精溶液lmL，蒸餾水lOOOmL，加熱溶解各成分于蒸餾水中，調(diào)pH值至7.4，加入指示劑混勻，分裝于裝有倒置小玻管的小試管內(nèi)，121°C滅菌15min。[0066]實(shí)施例三:復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備酸馬乳
參見附圖1，采用自篩選的馬克思克魯維酵母菌marxianus) WWMJ-1和選用的干釀乳桿菌casei)、乳酸乳球菌(Lac iococcws I act is)和紅曲霉菌iMonascus ruber)組成的復(fù)合菌種發(fā)酵制備酸馬乳的方法,具體制備方法步驟如下。
[0067](I)馬乳預(yù)處理:將新鮮馬乳通過過濾除去馬乳中的雜質(zhì)和異物，再將馬乳預(yù)熱到60-65°C，在20MPa條件下均質(zhì)10_15min，均質(zhì)后將馬乳巴氏殺菌，待發(fā)酵用；母發(fā)酵液、發(fā)酵液1、發(fā)酵液2需要預(yù)處理好的馬乳用量按體積比為3:20:20。
[0068](2)種子發(fā)酵液及母發(fā)酵液的制備。
[0069]種子發(fā)酵液:將4 °C下保存的乳酸乳球菌(Zaciococcws /aciis)、干酪乳桿菌{Lactobacillus casei )、馬克思克魯維酵母菌 iKluyveromyces marxianus) WWMJ-1CGMCC N0.8432和紅曲霉菌(ifoftascws rwAer)菌種在無菌環(huán)境下接種,分別將乳酸乳球菌(.Lactococcus Jacii1S)和干釀乳桿菌{Lactobacillus casei)接種于 MRS 培養(yǎng)基置于 37°C培養(yǎng) 18-24h，將馬克思克魯維酵母菌焊cm marxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432接種于YPD培養(yǎng)基置于28°C培養(yǎng)24-48h，將紅曲霉菌iMonascus ruber)接種于麥芽汁培養(yǎng)基置于30°C培養(yǎng)48-72h活化，備用。
[0070]母發(fā)酵液:將步驟(1)預(yù)處理好的母發(fā)酵液選用馬乳用量按體積比分為3:3:10:14分裝于發(fā)酵容器中，在無菌條件下，將上述已活化好的乳酸乳球菌ilactococcuslactis.、、干酪乳桿菌{Lactobacillus casei )、馬克思克魯維酵母菌 iKluyveromycesmarxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432和紅曲霉菌(ifoaasciAs rwAer)種子發(fā)酵液按照體積比計5%接種量分別接入相應(yīng)的四個發(fā)酵容器中，分別置于37°C培養(yǎng)18-24h、28°C培養(yǎng)24-48h和30°C培養(yǎng)48-72h，備用。
[0071](3)發(fā)酵液的制備:發(fā)酵液由發(fā)酵液I和發(fā)酵液2組成。[0072]發(fā)酵液I的制備:將步驟(2)制備的乳酸乳球菌、干酪乳桿菌、馬克思克魯維酵母菌發(fā)酵液用量按照體積比計(1.4-1.5):(1.4-1.5):(5-5.2)接種于步驟(1)預(yù)處理好選用發(fā)酵液I用量的馬乳中，在糖添加量為4-4.5g/100mL,發(fā)酵溫度32-33°C、發(fā)酵時間為50-55h條件下發(fā)酵得到發(fā)酵液I。
[0073]發(fā)酵液2的制備:將步驟(2)制備的紅曲霉母發(fā)酵液按照體積比計7-7.5%接種于步驟(1)預(yù)處理好選用發(fā)酵液2用量的馬乳中，在糖添加量為5 g/100ml，發(fā)酵溫度28-29°C、發(fā)酵時間7-8d條件下發(fā)酵得到發(fā)酵液2。
[0074](4)混合發(fā)酵液:將步驟(3)制備的發(fā)酵液I和發(fā)酵液2按照體積比計1:1的比例混合，進(jìn)行巴氏殺菌后進(jìn)行無菌灌裝，在4°C下保存。
[0075]采用上述確定的發(fā)酵工藝方法制備的酸馬乳，制備的酸馬乳具備特有產(chǎn)品典型性，其質(zhì)量特征:感官指標(biāo):色澤:微黃色；香氣:具有酸馬乳固有的奶味香，酸味適中；滋味:口感微澀；體態(tài):乳濁液容許少許沉淀；理化指標(biāo):總酸:150~160° T，還原糖含量(6g/L，Μ.K含量為2.947Pg/mL，桔霉素含量未檢出;微生物指標(biāo):菌落總數(shù)(cfu/mL)(100 ;大腸菌群(MPN/100 mL) ( 3 ;致病菌:未檢出。
[0076]實(shí)施例四:復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備酸馬乳
參見附圖1，采用自篩選的馬克思克魯維酵母菌marxianus) WWMJ-1和選用的干釀乳桿菌casei)、乳酸乳球菌(Lac iococcws I act is)和紅曲霉菌iMonascus ruber)組成的復(fù)合菌種發(fā)酵制備酸馬乳的方法,具體制備方法步驟如下。
[0077](I)馬乳預(yù)處理:將新鮮馬乳通過過濾除去馬乳中的雜質(zhì)和異物，再將馬乳預(yù)熱到65°C，在20MPa條件下均質(zhì)lOmin，均質(zhì)后將馬乳巴氏殺菌，待發(fā)酵用；母發(fā)酵液、發(fā)酵液1、發(fā)酵液2需要預(yù)處理好的馬乳用量按體積比為3:20:20。
[0078](2)種子發(fā)酵液及母發(fā)酵液的制備。
[0079]種子發(fā)酵液:將4 °C下保存的乳酸乳球菌iLac tococcus Iac Hs )、干酪乳桿菌(.LactobaciIlus casei)、馬克思克魯維酵母菌菌UUuyveromyces marxianus) WWMJ-1CGMCC N0.8432和紅曲霉菌(ifoftascws rwAer)菌種在無菌環(huán)境下接種,分別將乳酸乳球菌(.Lactococcus Jacii1S)和干釀乳桿菌{Lactobacillus casei)接種于 MRS 培養(yǎng)基置于 37°C培養(yǎng) 24h，將馬克思克魯維酵母菌marxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432 接種于YPD培養(yǎng)基置于28°C培養(yǎng)48h，將紅曲霉菌rMer)接種于麥芽汁培養(yǎng)基置于30°C培養(yǎng)48h活化,備用。
[0080]母發(fā)酵液:將步驟(1)預(yù)處理好的選用母發(fā)酵液用量的馬乳按體積比分為3:3:10:14分裝于發(fā)酵容器中，在無菌條件下，將上述已活化好的乳酸乳球菌ilactococcuslactis.、、干酪乳桿菌{Lactobacillus casei )、馬克思克魯維酵母菌 iKluyveromycesmarxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432和紅曲霉菌(ifoaasciAs rwAer )種子發(fā)酵液用量按照體積比計5%接種量接入發(fā)酵容器中，分別置于37°C培養(yǎng)24h、28°C培養(yǎng)48h和30°C培養(yǎng)48h，備用。
[0081](3)發(fā)酵液的制備:發(fā)酵液由發(fā)酵液I和發(fā)酵液2組成。
[0082]發(fā)酵液I的制備:將步驟(2)制備的乳酸乳球菌、干酪乳桿菌、馬克思克魯維酵母菌發(fā)酵液按照體積比計1.5:1.5:5接種于步驟(1)預(yù)處理好選用發(fā)酵液I用量的馬乳中，在糖添加量為4g/100mL，發(fā)酵溫度33°C、發(fā)酵時間為53h條件下發(fā)酵得到發(fā)酵液I。[0083]發(fā)酵液2的制備:將步驟(2)制備的紅曲霉母發(fā)酵液按照體積比計7%接種于步驟(I)預(yù)處理好選用發(fā)酵液2用量的馬乳中，在糖添加量為5 g/100ml，發(fā)酵溫度29°C、發(fā)酵時間7d條件下發(fā)酵得到發(fā)酵液2。
[0084](4)混合發(fā)酵液:將步驟(3)制備的發(fā)酵液I和發(fā)酵液2按照體積比計1:1的比例混合，進(jìn)行巴氏殺菌后進(jìn)行無菌灌裝，在4°C下保存。
[0085]實(shí)施例五:降血脂酸馬乳發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計
1.乳酸菌、酵母菌混合發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計:單因素試驗(yàn)設(shè)計
通過初步篩選，試用不同的乳酸菌，確定選用的兩種乳酸菌，即干酪乳桿菌{LactobaciIlus casei)、乳酸乳球菌 iLactococcus Iactis)和紅曲霉菌 iMonascusruber)和自篩選的馬克思克魯維酵母菌WWMJ-1作為制備酸馬乳的菌種。
[0086]通過接種量為乳酸球菌％:乳酸桿菌％:酵母菌％=1:1:6、1.5:1.5:5,2:2:4,
2.5:2.5:3、3:3:2，發(fā)酵溫度為26、28、30、32和34°C，發(fā)酵時間為1、2、3、4和5d及糖添加量2、4、6、8和10g/100mL，接種比例、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和糖的添加量四個單因素對發(fā)酵馬乳品質(zhì)的影響，選擇較為顯著的影響因素，篩選響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計可取的因素。
[0087](I)不同接種比例對發(fā)酵液的影響:表1不同接種比例對發(fā)酵液的影響
【權(quán)利要求】
1.一種適用于酸馬乳發(fā)酵的馬克思克魯維酵母菌UU uyveromyces marxi anus )WWMJ-1,其特征在于,馬克思克魯維酵母菌(Jluyveromyces marxianus)WWMJ-1的菌種保藏編號為 CGMCC N0.8432。
2.一種復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備酸馬乳的方法，其特征在于，具體制備方法步驟如下: (O馬乳預(yù)處理:將新鮮馬乳通過過濾除去馬乳中的雜質(zhì)和異物，再將馬乳預(yù)熱到60-65°C，在20MPa條件下均質(zhì)10_15min，均質(zhì)后將馬乳巴氏殺菌，待發(fā)酵用；母發(fā)酵液、發(fā)酵液I和發(fā)酵液2需要預(yù)處理好的馬乳用量按體積比為3:20:20 ； (2)種子發(fā)酵液及母發(fā)酵液的制備: 種子發(fā)酵液:將4°C下保存的馬克思克魯維酵母菌marxianus)WM^~ICGMCC N0.8432、乳酸乳球菌7acii5.)、干釀乳桿菌casei )和紅曲霉菌iMonascus ruber)菌種在無菌環(huán)境下接種，分別將乳酸乳球菌(Xactococcuslactis )和干釀乳桿菌{Lactobacillus casei )接種于MRS培養(yǎng)基置于37°C培養(yǎng)18_24h ；將馬克思克魯維酵母菌rnarxianus)mm-\ CGMCC N0.8432接種于YPD培養(yǎng)基置于28°C培養(yǎng)24-48h ;將紅曲霉菌ruber)接種于麥芽汁培養(yǎng)基置于30°C培養(yǎng)48-72h活化，備用； 母發(fā)酵液:將步驟(1)預(yù)處理好的母發(fā)酵液選用馬乳用量按體積比分為3:3:10:14分裝于發(fā)酵容器中，在無菌條件下，將上述已活化好的馬克思克魯維酵母菌(Jluyveromycesmarxi anus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432、乳酸乳球菌 iLactococcus lac Hs) ^ 干釀乳桿菌{Lactobacillus casei )和紅曲霉菌{Monascus ruber )種子發(fā)酵液按照體積比計5%接種量分別接入相應(yīng)的四個 發(fā)酵容器中，分別置于37 °C培養(yǎng)18-24h、28 V培養(yǎng)24_48h和30 V培養(yǎng)48-72h，備用； (3)發(fā)酵液的制備:發(fā)酵液由發(fā)酵液I和發(fā)酵液2組成； 發(fā)酵液I的制備:將步驟(2)制備的乳酸乳球菌、干酪乳桿菌、馬克思克魯維酵母菌發(fā)酵液用量按照體積比計(1.4-1.5):(1.4-1.5):(5-5.2)接種于步驟(1)預(yù)處理好選用發(fā)酵液I用量的馬乳中，在糖添加量為4-4.5g/100mL，發(fā)酵溫度32-33°C、發(fā)酵時間為50_55h條件下發(fā)酵得到發(fā)酵液I ; 發(fā)酵液2的制備:將步驟(2)制備的紅曲霉母發(fā)酵液按照體積比計7-7.5%接種于步驟(I)預(yù)處理好選用發(fā)酵液2用量的馬乳中，在糖添加量為5g/100ml，發(fā)酵溫度28_29°C、發(fā)酵時間7-8d條件下發(fā)酵得到發(fā)酵液2 ； (4)混合發(fā)酵液:將步驟(3)制備的發(fā)酵液I和發(fā)酵液2按照體積比計1:1的比例混合，進(jìn)行巴氏殺菌后進(jìn)行無菌灌裝，在4°C下保存。
3.如權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備酸馬乳的方法，其特征在于，所述的馬乳預(yù)處理中，將馬乳預(yù)熱到65°C,在20MPa條件下均質(zhì)IOmin,均質(zhì)后將馬乳巴氏殺菌。
4.如權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備酸馬乳的方法，其特征在于，所述的分別將乳酸乳球菌iLactococcus Jacii1S)和干釀乳桿菌{Lactobacillus casei )接種于MRS培養(yǎng)基置于37°C培養(yǎng)24h,將馬克思克魯維酵母菌iKluyveromyces marxi anus) WWMJ-1CGMCC N0.8432接種于YI3D培養(yǎng)基置于28°C培養(yǎng)48h，將紅曲霉菌(ifoftascws ^7/知^)接種于麥芽汁培養(yǎng)基置于30°C培養(yǎng)48h活化。
5.如權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備酸馬乳的方法，其特征在于，所述的將上述已活化好的乳酸乳球菌iLactococcus Jaciis)、干釀乳桿菌{Lactobacillus casei)、馬克思克魯維酵母菌UUuyveromyces marxi anus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432和紅曲霉菌(.Monascus ruber)種子發(fā)酵液分別置于37°C培養(yǎng)24h、28°C培養(yǎng)48h和30°C培養(yǎng)48h。
6.如權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備酸馬乳的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵液I的糖添加量為4g/100ml，發(fā)酵溫度33°C、發(fā)酵時間為53h條件下發(fā)酵。
7.如權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備酸馬乳的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵液I的糖添加量為5g/100ml，發(fā)酵溫度29°C、發(fā)酵時間7d條件下發(fā)酵。
8.如權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備酸馬乳的方法，其特征在于，所述的乳酸乳球菌(Xactococcus Jaciis)、干釀乳桿菌{Lactobacillus casei)、馬克思克魯維酵母菌 iKluyveromyces marxi a/? ?5 ^ffWM J-1 CGMCC N0.8432 發(fā)酵液按照體積比計 1.5:1.5:5 接種制備發(fā)酵液I。
9.如權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌種混合發(fā)酵制備酸馬乳的方法，其特征在于，所述的紅曲霉菌{Monascus ruber)發(fā)酵液按照體積比計7%接種制備發(fā)酵液2。
10.上述任一權(quán)利要求所述復(fù)合菌種混合發(fā)酵方法制備獲得酸馬乳。
【文檔編號】A23C9/127GK103834583SQ201410071070
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】武運(yùn), 王璐, 劉武軍, 楊海燕, 王小標(biāo), 苗森, 高蕾, 周建中, 古麗娜孜, 黃文書, 夏俊芳 申請人:武運(yùn), 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)