一種生物柴油油脂的生產(chǎn)方法
【專利摘要】一種生物柴油油脂的生產(chǎn)方法，按如下步驟：（1）將微生物提油后剩余物質用細胞溶解酶酶解，得到微生物提油后剩余物質酶解液（2）將水與上述酶解液按5~3:1的質量比，并加入硫酸鎂、氯化鐵和磷酸二氫鈉，配制異養(yǎng)微生物發(fā)酵培養(yǎng)基；（3）將產(chǎn)油異養(yǎng)微生物接種于步驟（2）的發(fā)酵培養(yǎng)基中三階段發(fā)酵；將產(chǎn)油自養(yǎng)微生物經(jīng)無菌操作接種于滅菌f/2培養(yǎng)基中三階段培養(yǎng)；（4）收集步驟（3）中產(chǎn)油微生物生物質，先預處理，再按正己烷、乙醇和預處理后的微生物生物質體積比1：1：1~3，提取油脂，有機相經(jīng)30~50℃，20~80轉/分鐘旋轉蒸發(fā)，去溶劑，去雜，干燥，得到微生物油脂。本發(fā)明提高了產(chǎn)油效率，降低了生產(chǎn)成本，環(huán)境友好，節(jié)約用地，保護環(huán)境。
【專利說明】一種生物柴油油脂的生產(chǎn)方法
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及化工【技術領域】。
【背景技術】
[0002]產(chǎn)自微生物的可再生生物能源可作為化石能源的有益補充和替代品之一，但目前還沒有充分發(fā)揮其潛力。微生物油脂，又稱單細胞油脂，是制備生物柴油的良好原料。微生物油脂作為能源原料具有以下優(yōu)勢:保障能源安全和減少對儲備石化能源的依賴。與陸生植物相比，利用微生物生產(chǎn)生物能源具有以下優(yōu)勢:首先，微生物生長繁殖快、培養(yǎng)所需占地面積少，同時微生物培養(yǎng)可以利用灘涂地、荒廢地等非耕地，因此利用微生物生產(chǎn)生物能源不會導致世界糧食供應問題。再者，微生物生長過程能利用廢水中的N、P等物質，可以實現(xiàn)廢水的凈化，微生物生物能源還是可再生能源。利用微生物培養(yǎng)生產(chǎn)生物能源不受季節(jié)和地點的限制。微生物還能將一些廢棄物轉化成制備生物能源的原料。微生物油脂制備的生物柴油與其他油料作物制備的生物柴油及石油基柴油在性能方面差異不大。利用微生物油脂這一新的油脂資源，可實現(xiàn)能源和環(huán)境的和諧而可持續(xù)發(fā)展。
[0003]微生物提油后剩余物質含有大量的碳水化合物，蛋白質等物質，因此在微生物制備高品質生物柴油生產(chǎn)系統(tǒng)中，若對以上提油后剩余物質不加以利用將造成微生物提油后剩余物質高價值多元組成的浪費和環(huán)境污染。實際上，微生物提油后剩余物質是重要的生物質資源。通過合適的化學、生物等方法可以將微生物提油后剩余物質轉化成CO、沼氣、乙醇、生物柴油、生物油等能源產(chǎn)品以及蛋白飼料、色素、多糖等資源產(chǎn)品。
[0004]微生物生物質能源的研究始于20世紀50年代。Golueke等人于1957年發(fā)表了第一篇關于微藻厭氧發(fā)酵制備沼氣方面研究工作的論文。在隨后的I960年里，他們成功開發(fā)出利用開放式大池培養(yǎng)微藻處理廢水與微藻厭氧發(fā)酵制備沼氣的集成系統(tǒng)。20世紀70年代中東戰(zhàn)爭等因素導致國際原油供應緊張。美國、日本、澳大利亞等西方國家為了減少對進口原油的依賴，大力資助微`生物(微藻)生物能源項目。20世紀70年代至90年代之間，美國能源部可再生能源實驗室啟動了一項名為“水生生物種計劃”(Aquatic SpeciesProgram, ASP),旨在開發(fā)微藻生物能源。經(jīng)過多年的努力，該計劃取得了一系列研究成果，收集了 3000株藻種,從中篩選出300株有培養(yǎng)潛力的藻種,它們大都屬于綠藻和娃藻。雖然利用微藻生產(chǎn)生物能源工藝在當時是可行的，但生產(chǎn)生物能源的成本比當時石油價格高出好幾十個百分點。1995年，美國能源部終止了對該計劃的資助，微藻生物能源的研究不再繼續(xù)。21世紀初，世界經(jīng)濟的快速發(fā)展，石油枯竭和價格上漲，因化石能源大量消耗導致的全球氣候變暖等環(huán)境問題加劇，全球再次掀起可再生的微生物生物能源研究熱潮。2009年美國科學家在藻類生物能源路線圖中明確提出了藻類(大藻和微藻)生產(chǎn)生物質能源的工藝路線，為往后微生物生物能源的發(fā)展指明了方向。我國微生物生物能源起步較晚，尤其是微生物生物柴油項目。目前微生物生產(chǎn)生物柴油尚未實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，主要是成本偏高。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種利用微生物提油后剩余物質生產(chǎn)微生物油脂的方法，該方法酶解效率高、副產(chǎn)物少、高效產(chǎn)油、微生物油脂生產(chǎn)成本大大降低、反應條件溫和、生產(chǎn)過程綠色環(huán)保、操作過程簡單。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的。
[0007]—種生物柴油油脂的生產(chǎn)方法，其特征在于按以下步驟。
[0008](I)將微生物提油后剩余物質(干物質)與細胞溶解酶以10-100: 1的質量比混勻，置于反應器中，磁力攪拌下反應，溫度3(T50°C，初始pH 5.0-7.0，攪拌轉速50~300轉/分鐘，時間3~6小時，反應結束后105°C處理10-30分鐘，得到微生物提油后剩余物質酶解液。
[0009](2)將水與微生物提油后剩余物質酶解液按5~3:1的質量比，并加入25~1OOmg/L的硫酸鎂，5(Tl50mg/L的氯化鐵和(T75mg/L的磷酸二氫鈉，經(jīng)115~121°C，15~30分鐘滅菌，作為異養(yǎng)微生物發(fā)酵培養(yǎng)基，用于發(fā)酵。
[0010](3)將產(chǎn)油異養(yǎng)微生物接種于步驟(2)的異養(yǎng)微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵罐中生長，發(fā)酵過程中溫度30~40°C、采用基于pH調(diào)控策略的三階段培養(yǎng)法:第一階段pH為5.0-6.0，第二階段pH為6.0-7.0，第三階段pH為7.0-8.0，三階段時間相同、通氣量
0.1~1.0vvm、總發(fā)酵時間48~120小時；將產(chǎn)油自養(yǎng)微生物經(jīng)無菌操作接種于滅菌f/2培養(yǎng)基，置于密閉光生物反應器中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C~30°C、采用基于pH調(diào)控策略的三階段培養(yǎng)法:第一階段pH為6.0-7.0，第二階段pH為7.0-8.0，第三階段pH為8.(T9.0，三階段時間相同、自然光或人工光光照強度500-50001χ、光暗周期12/12、總培養(yǎng)時間7~15天。發(fā)酵罐的進出氣口與光生物反應器的進出氣口通過PVC塑料管相連。
[0011](4)收集步驟(3)中的自養(yǎng)和異養(yǎng)產(chǎn)油微生物生物質，用水沖洗。經(jīng)細胞溶解酶預處理:產(chǎn)油微生物生物質(干物質)與細胞溶解酶以10-100: I的質量比混勻，30~50°C，初始pH 5.0~7.0，攪拌轉速50~300轉/分鐘，3~6小時。按正己烷、乙醇和預處理后的微生物生物質體積比為1:1:1~3，用正己烷和乙醇提取油脂，有機相經(jīng)溫度3(T50°C，轉速20-80轉/分鐘旋轉蒸發(fā)，去除有機溶劑后，去雜，干燥，即得到微生物油脂。
[0012]本發(fā)明步驟(1)和(4)所述的細胞溶解酶預處理的最優(yōu)方案是45°C，初始pH6.0，攪拌轉速150轉/分鐘，時間4小時。
[0013]本發(fā)明細胞溶解酶的主要作用于微生物細胞壁葡聚糖等的多聚β-1，3_糖苷鍵，細胞溶解酶對細胞壁碎片等微生物提油后主要剩余物質定向酶解成主要含糖和蛋白質的酶解液，且酶解條件溫和，不產(chǎn)生或較少產(chǎn)生抑制劑；酶解效率高，酶解過程除酶外無其他物質加入，而酶本身是蛋白質，滅活后可被微生物利用，因此酶解液無需其他預處理，可直接用于微生物培養(yǎng)產(chǎn)油，免除了酶解液預處理成本。
[0014]本發(fā)明利用高效液相色譜儀檢測微生物提油后剩余物質酶解液中糖含量，用凱氏定氮儀測定微生物提油后剩余物質酶解液中蛋白質含量，用正己烷和乙醇提取油脂，烘干后用電子天平測油脂重量。
[0015]本發(fā)明微生物油脂的生產(chǎn)是將微生物提油后剩余物質通過生物法轉化成油脂，串聯(lián)自養(yǎng)和異養(yǎng)產(chǎn)油微生物，提高產(chǎn)油效率，降低生產(chǎn)成本，環(huán)境友好，此外可以節(jié)約用地，保護環(huán)境，提供一種新的微生物產(chǎn)油模式，是一種滿足工業(yè)化需求的新方法。【具體實施方式】
[0016]本發(fā)明將通過以下實施例作進一步說明。
[0017]以下實施例所用到的富含油脂小球藻(CX7ore77a可從中國典型微生物保藏中心(武漢)獲得，其保藏編號為CCTCC M209256 ;所用到的產(chǎn)油自養(yǎng)微生物為富含油脂微擬球藻(Nannochloropsis ocula ia)和富含油脂原核小球藻(Chlorellapro to thecoides )，可從美國德州大學UTEX藻種庫獲得，其保藏編號分別為LB2164和256 ;所用到的產(chǎn)油異養(yǎng)微生物為富含油脂彎曲隱球酵母(OjpiococcM cur vatu s')和富含油脂粘紅酵母(?oi/oiorw7a 可從德國DSMZ菌種保藏中心獲得，其保藏編號分別為DSMZ 70022和10134 ;所用到的產(chǎn)油異養(yǎng)微生物為富含油脂高山被孢霉(iforiierdhaT/7i/?a)，可從中國工業(yè)微生物菌種保藏中心獲得，其保藏編號為CICC 2258。
[0018]以下實施例所用的細胞溶解酶為購自生化制劑公司Sigma的市售商品酶L2524-25KU 或 L2524-10KU 或 L4025-25KU 或 L4025-100KU。
[0019]實施例1。
[0020]將富含油脂小球藻藻種經(jīng)無菌操作接種于滅菌f/2培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，光照強度20001x，培養(yǎng)10天。將富含油脂彎曲隱球酵母菌種經(jīng)無菌操作接種于滅菌搖瓶培養(yǎng)液中(mg/L):酵母抽提物3000，麥芽抽提物3000，蛋白胨5000和葡萄糖20000，置于搖床中培養(yǎng)，轉速200轉/分鐘，培養(yǎng)溫度35°C，培養(yǎng)72小時。分別將在光照培養(yǎng)箱中生長的50g富含油脂小球藻和搖床中發(fā)酵的50g富含油脂彎曲隱球酵母，離心(8000轉/分鐘，10分鐘)收集獲得生物質，用蒸餾水沖洗5次。經(jīng)細胞溶解酶L2524-25KU預處理:產(chǎn)油微生物生物質(干物質)與細胞溶解酶L2524-25KU以100:1的質量比混勻，450C，初始pH 6.0，攪拌轉速150轉/分鐘，4小時。用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預處理后的微生物生物質漿體積比為1:1:1，水相經(jīng)離心(15000轉/分鐘，10分鐘)后，用蒸餾水沖洗5次，冷凍干燥1 2小時后得到微生物提油后剩余物質。
[0021]將微生物提油后剩余物質與細胞溶解酶L2524-25KU以100: I的質量比混勻，置于反應器中，磁力攪拌下反應，溫度45°C，初始pH 6.0，攪拌轉速150轉/分鐘，時間4小時，反應結束后105°C處理15分鐘，得到微生物提油后剩余物質酶解液，檢測其中糖和蛋白質含量。
[0022]將微生物提油后剩余物質酶解液作為富含油脂彎曲隱球酵母的發(fā)酵液:蒸餾水與酶解液之比為4:1，并加入50mg/L的硫酸鎂，100mg/L的氯化鐵和50mg/L的磷酸二氫鈉，置于5L發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程中溫度35°C、發(fā)酵時間72小時，通氣量0.2vvm。將富含油脂小球藻藻種經(jīng)無菌操作接種于滅菌f/2培養(yǎng)基，置于密閉圓柱狀反應器生長，培養(yǎng)溫度30°C，人工光光照強度30001x，光暗周期12/12，培養(yǎng)周期為9天。發(fā)酵罐的進出氣口與光生物反應器的進出氣口通過PVC塑料管相連。富含油脂彎曲隱球酵母發(fā)酵結束后接入下一批繼續(xù)發(fā)酵，富含油脂小球藻培養(yǎng)結束后進行下一批培養(yǎng)；采用基于微生物油脂合成規(guī)律的三階段培養(yǎng)法，富含油脂彎曲隱球酵母和小球藻前、中、后三階段(三階段具有相同的培養(yǎng)或發(fā)酵時間)，pH值分別為:6.0，6.5和8.0 ;6.5，7.0和9.0，培養(yǎng)結束后，離心(8000轉/分鐘，10分鐘)收集獲得微生物生物質,用水沖洗3次。經(jīng)細胞溶解酶預處理:產(chǎn)油微生物(干物質)與細胞溶解酶L2524-25KU以100:1的質量比混勻，45°C，初始pH 6.0，攪拌轉速150轉/分鐘，4小時。用正己烷和乙 醇提取油脂，正己烷、乙醇和預處理后的微生物生物質漿體積比為1:1:1，其中有機相經(jīng)溫度35°C，轉速20轉/分鐘旋轉蒸發(fā)去除有機溶劑后，去雜，干燥，即得到微生物油脂。結果見表1。
[0023]實施例2。
[0024]將富含油脂原核小球藻藻種經(jīng)無菌操作接種于滅菌f/2培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，光照強度50001x，培養(yǎng)10天。將富含油脂粘紅酵母菌種經(jīng)無菌操作接種于滅菌搖瓶培養(yǎng)液中:土豆浸出液1000mL(200g 土豆去皮，切小塊后加水煮沸I小時，5層紗布過濾，定容至1000mL)和葡萄糖20000 mg/L，置于搖床中培養(yǎng)，轉速150轉/分鐘，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)72小時。分別將在光照培養(yǎng)箱中生長的50g富含油脂原核小球藻和在搖床中發(fā)酵的50g富含油脂粘紅酵母，離心(8000轉/分鐘，10分鐘)收集獲得生物質，用蒸餾水沖洗5次。經(jīng)細胞溶解酶L2524-10KU預處理:產(chǎn)油微生物生物質(干物質)與細胞溶解酶L2524-10KU以500:1的質量比混勻，45°C，初始pH 6.0，攪拌轉速150轉/分鐘，4小時。用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預處理后的微生物生物質漿體積比為1:1:2，水相經(jīng)離心(15000轉/分鐘，10分鐘)后,用蒸懼水沖洗5次,冷凍干燥12小時后得到微生物提油后剩余物質。
[0025]將微生物提油后剩余物質與細胞溶解酶L2524-10KU以500: I的質量比混勻，置于反應器中，磁力攪拌下反應，溫度45°C，初始pH 6.0，攪拌轉速150轉/分鐘，時間4小時，反應結束后105°C處理15分鐘，得到微生物提油后剩余物質酶解液，檢測其中糖和蛋白
質含量。
[0026]將微生物提油后剩余物質酶解液作為富含油脂粘紅酵母的發(fā)酵液:自來水與酶解液之比為4:1，并加入60mg/L的硫酸鎂和80mg/L的氯化鐵置于5L發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程中溫度37°C、發(fā)酵時間72小時，通氣量0.2vvm。將富含油脂原核小球藻藻種經(jīng)無菌操作接種于滅菌f/2培養(yǎng)基，置于密閉圓柱狀反應器生長，培養(yǎng)溫度30°C，人工光光照強度30001x，光暗周期12/12，培養(yǎng)周期為9天。發(fā)酵罐的進出氣口與光生物反應器的進出氣口通過PVC塑料管相連。富含油脂粘紅酵母發(fā)酵結束后接入下一批繼續(xù)發(fā)酵，富含油脂原核小球藻培養(yǎng)結束后進行下一批培養(yǎng)；采用基于微生物油脂合成規(guī)律的三階段培養(yǎng)法，富含油脂粘紅酵母和原核小球藻前、中、后三階段(三階段具有相同的培養(yǎng)或發(fā)酵時間)，PH值分別為:5.5，
6.0和7.5 ；6.5,7.0和8.5，培養(yǎng)結束后;離心(8000轉/分鐘，10分鐘)收集獲得微生物生物質，用水沖洗3次。經(jīng)細胞溶解酶L2524-10KU預處理:產(chǎn)油微生物生物質(干物質)與細胞溶解酶L2524-10KU以500: I的質量比混勻，45°C，初始pH 6.0，攪拌轉速150轉/分鐘，4小時。用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預處理后的微生物生物質漿體積比為
I:1:2，其中有機相經(jīng)溫度35°C，轉速20轉/分鐘旋轉蒸發(fā)去除有機溶劑后，去雜，干燥，SP得到微生物油脂。結果見表1。
[0027]實施例3。
[0028]將富含油脂微擬球藻藻種經(jīng)無菌操作接種于滅菌f/2培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，光照強度20001x，培養(yǎng)10天。將富含油脂高山被孢霉菌種經(jīng)無菌操作接種于滅菌搖瓶培養(yǎng)液中(mg/L):酵母抽提物10000，蛋白胨10000和葡萄糖30000，置于搖床中培養(yǎng) ，轉速180轉/分鐘，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)72小時。分別將在光照培養(yǎng)箱中生長的50g富含油脂微擬球藻和搖床中發(fā)酵的50g富含油脂高山被孢霉，離心(8000轉/分鐘，10分鐘)收集獲得生物質，用蒸餾水沖洗5次。經(jīng)細胞溶解酶L4025-100KU預處理:產(chǎn)油微生物生物質(干物質)與細胞溶解酶L4025-100KU以50:1的質量比混勻，45°C，初始pH 6.0，攪拌轉速150轉/分鐘，4小時。用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預處理后的微生物生物質漿體積比為1:1:1，水相經(jīng)離心(15000轉/分鐘，10分鐘)后，用蒸餾水沖洗5次，冷凍干燥12小時后得到微生物提油后剩余物質。
[0029]將微生物提油后剩余物質與細胞溶解酶L4025-100KU以50: I的質量比混勻，置于反應器中，磁力攪拌下反應，溫度45°C，初始pH 6.0，攪拌轉速150轉/分鐘，時間4小時，反應結束后105°C處理15分鐘，得到微生物提油后剩余物質酶解液，檢測其中糖和蛋白
質含量。
[0030]將酶解液作為富含油脂粘紅酵母的發(fā)酵液:蒸餾水與酶解液之比為3:1，并加入75mg/L的硫酸鎂和100mg/L的氯化鐵置于5L發(fā)酵罐中。發(fā)酵溫度37°C、發(fā)酵時間72小時，通氣量0.2vvm。將富含油脂微擬球藻藻種經(jīng)無菌操作接種于滅菌f/2培養(yǎng)基，置于密閉圓柱狀反應器生長，培養(yǎng)溫度25°C，人工光光照強度20001x，光暗周期12/12，培養(yǎng)周期為9天。發(fā)酵罐的進出氣口與光生物反應器的進出氣口通過PVC塑料管相連。富含油脂粘紅酵母發(fā)酵結束后接入下一批繼續(xù)發(fā)酵，富含油脂原核小球藻培養(yǎng)結束后進行下一批培養(yǎng)；采用基于微生物油脂合成規(guī)律的三階段培養(yǎng)法，富含油脂粘紅酵母和微擬球藻前、中、后三階段(三階段具有相同的培養(yǎng)或發(fā)酵時間)，PH值分別為:5.0，6.0和8.0 ;6.0，7.0和9.0，培養(yǎng)結束后，離心(8000轉/分鐘，10分鐘)收集獲得微生物生物質，用水沖洗3次。經(jīng)細胞溶解酶L4025-100KU預處理:產(chǎn)油微生物(干物質)與細胞溶解酶L4025-100KU以50:1的質量比混勻，45°C，初始pH 6.0，攪拌轉速150轉/分鐘，4小時。用正己烷和乙醇提取油脂，正己烷、乙醇和預處理后的微生物生物質漿體積比為1:1:1，其中有機相經(jīng)溫度35°C，轉速20轉/分鐘旋轉蒸發(fā)去除有機溶劑后，去雜，干燥，即得到微生物油脂。結果見表1。
[0031]對比例I。
[0032]將富含油脂小球藻藻種`經(jīng)無菌操作接種于滅菌f/2培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，初始pH 7.0，培養(yǎng)溫度251:，光照強度200011，培養(yǎng)10天。分析油脂產(chǎn)率，結果見表1。
[0033]對比例2。
[0034]將富含油脂微擬球藻藻種經(jīng)無菌操作接種于滅菌f/2培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，初始PH 7.0,培養(yǎng)溫度25°C，光照強度20001x，通氣量0.5vvm, CO2濃度為2%，培養(yǎng)10天。分析油脂產(chǎn)率，結果見表1。
[0035]對比例3。
[0036]將富含油脂粘紅酵母菌種經(jīng)無菌操作接種于搖瓶中:土豆浸出液1000mL(200g土豆去皮，切小塊后加水煮沸I小時，5層紗布過濾,定容至1000mL)和葡萄糖15000 mg/L,置于搖床中培養(yǎng)，初始pH 6.0，轉速150轉/分鐘，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)72小時。分析油脂產(chǎn)率，結果見表1。
[0037]對比例4。
[0038]將富含油脂高山被孢霉菌種經(jīng)無菌操作接種于搖瓶中(mg/L):酵母抽提物10000，蛋白胨10000和葡萄糖15000，置于搖床中培養(yǎng)，初始pH 6.0，轉速180轉/分鐘，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)72小時。分析油脂產(chǎn)率，結果見表1。
[0039]
表1實施例及對比結果
【權利要求】
1.一種生物柴油油脂的生產(chǎn)方法，其特征是按如下步驟: (1)將微生物提油后剩余物質與細胞溶解酶以10-100: I的質量比混勻，置于反應器中，磁力攪拌下反應，溫度3(T50°C，初始pH 5.0-7.0，攪拌轉速50~300轉/分鐘，時間3飛小時，反應結束后105°C處理10-30分鐘，得到微生物提油后剩余物質酶解液； (2)將水與微生物提油后剩余物質酶解液按5~3:1的質量比，并加入25~100mg/L的硫酸鎂，5(Tl50mg/L的氯化鐵和(T75mg/L的磷酸二氫鈉，經(jīng)115~121°C，15~30分鐘滅菌，作為異養(yǎng)微生物發(fā)酵培養(yǎng)基，用于發(fā)酵； (3)將產(chǎn)油異養(yǎng)微生物接種于步驟(2)的異養(yǎng)微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵罐中生長，發(fā)酵過程中溫度3(T40°C、采用基于pH調(diào)控策略的三階段培養(yǎng)法:第一階段pH為5.0-6.0，第二階段pH為6.0-7.0，第三階段pH為7.0-8.0，三階段時間相同、通氣量0.1~1.0vvm、總發(fā)酵時間48~120小時；將產(chǎn)油自養(yǎng)微生物經(jīng)無菌操作接種于滅菌f/2培養(yǎng)基，置于密閉光生物反應器中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 °C~30°C、采用基于pH調(diào)控策略的三階段培養(yǎng)法:第一階段pH為6.0-7.0，第二階段pH為7.0-8.0，第三階段pH為8.(T9.0，三階段時間相同、自然光或人工光光照強度500-50001χ、光暗周期12/12、總培養(yǎng)時間7~15天；發(fā)酵罐的進出氣口與光生物反應器的進出氣口相連； (4)收集步驟(3)中的自養(yǎng)和異養(yǎng)產(chǎn)油微生物生物質，用水沖洗；經(jīng)細胞溶解酶預處理:產(chǎn)油微生物生物質與細胞溶解酶以10-100: I的質量比混勻，3(T50°C，初始pH5.0-7.0，攪拌轉速50-300轉/分鐘，3飛小時；按正己烷、乙醇和預處理后的微生物生物質體積比為1:1:廣3，用正己烷和乙醇提取油脂，有機相經(jīng)溫度3(T50°C，轉速20-80轉/分鐘旋轉蒸發(fā)，去除有機溶劑后，去雜，干燥，即得到微生物油脂。
2.根據(jù)權利要求書I所述的生產(chǎn)生物柴油油脂的方法，其特征是步驟(1)和(4)所述的酶解預處理條件為:45°C，初始pH 6.0，攪拌轉速150轉/分鐘，時間4小時。
【文檔編號】C12R1/645GK103849657SQ201410077129
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月5日 優(yōu)先權日:2014年3月5日
【發(fā)明者】鄭洪立, 馬小琛, 阮榕生, 劉玉環(huán), 高振, 彭紅, 黃和, 劉君英, 張錦勝 申請人:南昌大學