一種利用酶協(xié)同水解微藻蛋白制備金屬螯合肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種金屬（Ca、Fe、Zn）螯合肽，具體涉及一種利用酶協(xié)同水解微藻蛋白制備金屬螯合肽的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，以微藻蛋白為原料，采用復(fù)合蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶復(fù)配對(duì)其進(jìn)行酶解，分離純化、冷凍干燥得到金屬螯合肽，得到的肽的氨基酸序列為：eeplp。氨基酸和小肽具有促進(jìn)鋅吸收的作用，而且氨基酸或肽的金屬復(fù)合體如Fe、Zn的生物學(xué)利用率比無機(jī)鹽高且無毒副作用。因此，研究開發(fā)這種生物態(tài)鋅-蛋白酶解物螯合鋅，具有十分重要的意義。
【專利說明】一種利用酶協(xié)同水解微藻蛋白制備金屬螯合肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種金屬(Ca、Fe、Zn)螯合肽，具體涉及一種利用酶協(xié)同水解微藻蛋白制備金屬螯合肽的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]微藻蛋白源生物活性肽具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、食用安全性及生理保健功能，在促進(jìn)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育和疾病防治等方面都起著重要的作用，可作為功能性食品或食品添加劑乃至藥品應(yīng)用到人們?nèi)粘Ｉ钪小?br> [0003]鈣質(zhì)缺乏是全球性的營(yíng)養(yǎng)問題，我國(guó)人民由于以植物性膳食為主，缺鈣的現(xiàn)象更加嚴(yán)重，因此補(bǔ)鈣成為我國(guó)膳食營(yíng)養(yǎng)研究中的重要課題。傳統(tǒng)的無機(jī)鈣鹽，如碳酸鈣、磷酸鈣、氯化鈣等，對(duì)維生素有一定破壞作用，生物學(xué)效價(jià)較低；有機(jī)鈣鹽，如檸檬酸鈣、乳酸鈣、葡萄糖鈣等，雖然鈣吸收率有所提高，但其溶解度大易溶失，且價(jià)格高。研究表明，多肽螯合鈣由于其獨(dú)特的螯合體制和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，易被吸收、安全無毒、價(jià)格低、可同時(shí)補(bǔ)充氨基酸和鈣，而成為補(bǔ)鈣首選。
[0004]鐵對(duì)人類健康特別是對(duì)嬰幼兒和兒童的生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用。雖然大分子蛋白質(zhì)也可以與鐵離子結(jié)合，但這些大分子蛋白質(zhì)本身也存在相對(duì)分子質(zhì)量較大而很難通過腸黏膜的問題。而研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸、多肽螯合鐵可以大大提高鐵離子的吸收率。
[0005]盡管自然界中鋅源十分豐富，但鋅在人體內(nèi)的吸收代謝受種種因素的限制，鋅缺乏已成為我國(guó)及許多發(fā)展中國(guó)家的公共衛(wèi)生問題。研究發(fā)現(xiàn)氨基酸和小肽具有促進(jìn)鋅吸收的作用，而且氨基酸或肽的金屬復(fù)合體如Fe、Zn的生物學(xué)利用率比無機(jī)鹽高且無毒副作用。因此，研究開發(fā)這種生物態(tài)鋅-蛋白酶解物螯合鋅，具有十分重要的意義。
[0006]因此，如何獲得具有金屬螯合活性的肽，就成為制備新型金屬元素補(bǔ)充劑迫切的研究方向。`

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種利用酶協(xié)同水解微藻蛋白制備金屬螯合肽的方法，使金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性得以高效地實(shí)現(xiàn)。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種金屬螯合肽，是由5個(gè)氨基酸所構(gòu)成的肽，所述肽的氨基酸序列為:eeplp。
[0009]所述的金屬為Ca、Fe或Zn。
[0010]一種金屬螯合肽的制備方法，以微藻蛋白為原料，采用復(fù)合蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶復(fù)配對(duì)其進(jìn)行酶解，分離純化、冷凍干燥得到金屬螯合肽。
[0011]所述酶解的條件為:底物濃度5%，酶解pH為7.0、溫度49°C、酶解時(shí)間為7小時(shí)、酶-底物重量配比為1:25 ;所述酶為復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，兩種酶的重量復(fù)配比為復(fù)合蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶=2:1。
[0012]所述分離純化的具體步驟為:酶解產(chǎn)物首先利用T0Y0PEARL DEAE-650M陰離子交換色譜進(jìn)行分離，洗脫液為濃度梯度為含有0-0.5 M NaCl的0.02 M、pH 9.0的磷酸緩沖液，流速為0.5 mL/min，洗脫峰在214 nm下進(jìn)行測(cè)量；收集具有最高金屬螯合活性的峰，再用S印hadex G-25凝膠過濾色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.3 mL/min，洗脫峰在214 nm下進(jìn)行測(cè)定；收集具有最高金屬螯合活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10-90%乙腈溶液作為梯度洗脫液，流速為lmL/min，洗脫液自含體積比為10%乙腈和90%水的混合液開始，至體積比為90%乙腈和10%水的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，收集體積比為28%乙腈和62%水處的洗脫峰，得到金屬螯合肽。
[0013]本發(fā)明立足于多肽具備與金屬離子螯合的作用位點(diǎn)，能夠與其形成穩(wěn)定的化合物，且多肽-金屬螯合物具有獨(dú)特的螯合體制和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，易被吸收、可同時(shí)補(bǔ)充氨基酸和金屬的理論基礎(chǔ)，以來自于魚皮、魚鱗蛋白為原材料，通過復(fù)合蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶的切割條件控制，切割制備具有高金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性的肽，而使金屬螯合活性得以高效地實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明為海洋源蛋白的應(yīng)用提供了一條新思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1純化海洋源蛋白金屬螯合肽的CLC - HPLC-C18色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1
制備方法如下:
I海洋源蛋白酶解條件的優(yōu)化
本技術(shù)所采用的微藻蛋白來自于實(shí)驗(yàn)室自制，酶購自諾維信生物技術(shù)有限公司(中國(guó)?天津)。采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)四個(gè)酶解因素進(jìn)行考察，分別為底物濃度(1%，3%，5%和7%)、酶解溫度(40，50，55和60 °C )`、酶的復(fù)配比(復(fù)合蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶=1: 1，1: 2，1:3和 2:1 w/w)，酶-底物配比(1:100，1:50，1:25 和 1:20 w/w)以及酶解時(shí)間(1，3，5，7，9小時(shí))。稱取5.0克海洋源蛋白溶解于100mL蒸餾水中，然后用2mol/L NaOH將其pH調(diào)節(jié)至7.0。先將該溶液水浴加熱到49°C，接著再按照酶-底物配比為1:25的比例加入相應(yīng)量的酶，按照預(yù)定的反應(yīng)時(shí)間開始反應(yīng)。接著再在沸水浴中滅酶10分鐘，冷卻后再1000Orpm離心10分鐘。上清液收集后，分別對(duì)金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性進(jìn)行測(cè)定，以確定最佳酶解條件。得到具有最大金屬螯合活性的酶解液的酶解條件是:底物濃度5%，酶解pH為7.0、溫度49°C、酶解時(shí)間為7小時(shí)、酶-底物配比為1:25 (w/w);所述酶為復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，兩種酶的復(fù)配比為復(fù)合蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶=2:1 (w/w)。
[0016](I)酶解產(chǎn)物的分離、純化
先在最佳酶解條件下進(jìn)行酶解，得到的酶解產(chǎn)物先經(jīng)過TOYOPEARL DEAE-650M陰離子交換色譜(長(zhǎng)50 cm，外徑1.6cm)進(jìn)行分離，洗脫液為濃度梯度為0-0.5 M的NaCl的0.02mo I/L pH 9.0的磷酸緩沖液，流速為0.5 mL/min，洗脫峰在214nm下進(jìn)行測(cè)量；收集具有最高金屬螯合活性的峰。
[0017]對(duì)TOYOPEARL DEAE-650M陰離子交換色譜分離的具有最高金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性的洗脫峰再進(jìn)行下一步的分離，用S印adex G-25凝膠過濾色譜(長(zhǎng)100 cm，外徑2.0cm)收集具有最高金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性的峰，再利用制備型RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步分離，反相HPLC的分離條件是用10-90% (v/v)乙腈溶液作為梯度洗脫液，流速為I mL/min,收集各峰進(jìn)行金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活力測(cè)定,洗脫液自含10%乙腈和90%水(v/v)的混合液開始，至90%乙腈和10%水(v/v)的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，收集28%乙腈和62%水(v/v)處的洗脫峰，即洗脫時(shí)間為22.016分鐘處的洗脫峰，得到高純度的金屬螯合肽。
[0018]冷凍干燥得到本發(fā)明的金屬(Ca、Fe、Zn)螯合肽。
[0019]采用鄰-甲酚酞比色法，測(cè)定金屬螯合肽對(duì)鈣離子的螯合作用。將I mL 5 mmol/L的CaCl2和2 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)加入具塞試管中，再加入I mL清蛋白肽溶液，置于恒溫加熱水浴搖床中37°C溫育2h，取出后10000 r/min常溫離心10 min。取I mL上清液，加入鄰-甲酚酞顯色液5 mL，搖勻。放置10 min后于分光光度計(jì)570 nm處測(cè)定吸光值，將數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出可溶性鈣結(jié)合量。
[0020]標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:分別取標(biāo)準(zhǔn)Ca工作液(10 ug/ mL) O,0.2,0.4,0.6,0.8, 1.0mL于10 mL試管中，分別加去離子水1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，O mL，加入鄰-甲酚酞顯色液5 mL，搖勻，放置10 min后于分光光度計(jì)570 nm處測(cè)定吸光值。以可溶性鈣含量(ug/ mL)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)做圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為:y = 0.0974x - 0.0402, R2 = 0.9996。
[0021]采用鄰菲羅啉比色法，測(cè)定金屬螯合肽對(duì)鐵離子的螯合作用。將0.05 g樣品置于100 mL燒杯中，加入2 mL濃鹽酸，待樣品完全溶解后，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中。準(zhǔn)確吸取5 mL樣品液于50 mL容量瓶中，加入I mol/L的HCl溶液I mL，10%的鹽酸羥胺I mL，0.12%鄰菲羅啉I mL，然后加入10%醋酸鈉5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。以不加鐵的試劑空白溶液作參比液， 在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，將數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出鐵結(jié)合量。
[0022]標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:吸取10 ug/mL鐵的標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL,分別置于50 mL容量瓶中，加入I mol/L的HCl溶液I mL，10%的鹽酸羥胺I mL，0.12%鄰菲羅啉I mL，然后加入10%醋酸鈉5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。以不加鐵的試劑空白溶液作參比液，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為:y =
0.1717x+0.003，R2 = 0.9994。
[0023]采用EDTA滴定法，測(cè)定金屬螯合肽對(duì)鋅離子的螯合作用。稱量螯合物100 mg于100 mL小燒杯中，加水50 mL，加入6 mol/L鹽酸數(shù)滴。搖勻后于水浴上加熱使之完全溶解，冷卻后定容至100 mL,從中吸取10 mL于三角瓶，平3份，加入NH3-NH4CI緩沖液(pH 10) 10mL,鉻黑T指示劑適量，然后用0.01 mol/L Na2EDTA液滴至藍(lán)色；紀(jì)錄消耗EDTA的毫升數(shù)，計(jì)算螯合物含鋅量。
[0024]應(yīng)用T0Y0PEARL DEAE-650M 陰離子交換色譜、Sephadex G-25 分子篩、RP-HPLC 反相高效液相色譜等分離純化手段，實(shí)現(xiàn)顯著活性的金屬螯合蛋白肽的高效分離純化。
[0025]利用蛋白質(zhì)測(cè)序儀(AppliedBiosystems Model 476A, Perkin Elmer C0.MA,U.S.A)測(cè)定金屬螯合肽的氨基酸全序列。
[0026]純化得到的特異性金屬螯合肽具有很高的金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性，由表1可以看出，與酶解液相比，螯合肽的金屬螯合力有了很大提高。
[0027]表1純化的特異性金屬螯合肽的金屬螯合力
【權(quán)利要求】
1.一種金屬螯合肽，其特征在于:所述肽的氨基酸序列為:eeplp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金屬螯合肽，其特征在于:所述的金屬為Ca、Fe或Zn。
3.—種如權(quán)利要求1所述的一種金屬螯合肽的制備方法，其特征在于:以微藻蛋白為原料，采用復(fù)合蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶復(fù)配對(duì)其進(jìn)行酶解，分離純化、冷凍干燥得到金屬螯合肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種金屬螯合肽的制備方法，其特征在于:所述酶解的條件為:底物濃度5%，酶解pH為7.0、溫度49°C、酶解時(shí)間為7小時(shí)、酶-底物重量配比為1:25 ；所述酶為復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，兩種酶的重量復(fù)配比為復(fù)合蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶=2:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種金屬螯合肽的制備方法，其特征在于:所述分離純化的具體步驟為:酶解產(chǎn)物首先利用TOYOPEARL DEAE-650M陰離子交換色譜進(jìn)行分離，洗脫液為濃度梯度為含有0-0.5 M NaCl的0.02 M、pH 9.0的磷酸緩沖液，流速為0.5 mL/min,洗脫峰在214 nm下進(jìn)行測(cè)量；收集具有最高金屬螯合活性的峰，再用Sephadex G-25凝膠過濾色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.3 mL/min，洗脫峰在214 nm下進(jìn)行測(cè)定；收集具有最高金屬螯合活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步的分離，反相HPLC的分離條件是用10-90%乙腈溶液作為梯度洗脫液，流速為lmL/min，洗脫液自含體積比為10%乙腈和90%水的混合液開始，至體積比為90%乙腈和10%水的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，收集體積 比為28%乙腈和62%水處的洗脫峰，得到金屬螯合肽。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK103880921SQ201410078643
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】汪少蕓, 邵彪, 林彬彬, 方衛(wèi)東, 趙立娜, 廖蘭, 洪晶 申請(qǐng)人:福州大學(xué)