一種基于殼寡糖修飾具有抗凍功能的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了屬于水產(chǎn)品副產(chǎn)物加工領(lǐng)域的一種基于殼寡糖修飾具有抗凍功能的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物，主要是將魚(yú)皮磨成漿，離心去掉脂肪；接著用超聲波處理、復(fù)合酶酶解，再對(duì)酶解產(chǎn)物離心，取上清液；采用二步超濾上清液，得分子量5000～8000道爾頓的魚(yú)皮蛋白多肽，再與殼寡糖反應(yīng)，得魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物。本發(fā)明還公開(kāi)了其制備方法和用途。本發(fā)明魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物抗凍功能好，可將冷凍干燥微生物的活率提高60%；其次，具有較好的風(fēng)味，可以改善冰淇淋的組織結(jié)構(gòu)。本發(fā)明制備方法利用超聲波處理，魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物的得率高；本發(fā)明以水產(chǎn)品加工的副產(chǎn)物魚(yú)皮為原料，不僅原料成本低，而且減少了魚(yú)皮作為廢物處理的能源消耗和勞動(dòng)力。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種基于殼寡糖修飾具有抗凍功能的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)品副產(chǎn)物加工領(lǐng)域，具體涉及一種基于殼寡糖修飾具有抗凍功能的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物，以及該魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗凍蛋白具有低溫保護(hù)功能，抗凍蛋白可作為冷凍保護(hù)劑在醫(yī)學(xué)、化妝品、生物、食品、農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。如抗凍蛋白可用于提高特定微生物的抗凍能力，以及減小食品凍減時(shí)大冰晶形成和重結(jié)晶對(duì)食品結(jié)構(gòu)的破壞，改善食品品質(zhì)。
[0003]1957年，Scholander等首次報(bào)道一些海洋魚(yú)類(lèi)存在具有抗凍活性的蛋白。1969年,Devries和Wohlschlag在南極海洋魚(yú)類(lèi)的血液中首次提取并證明了具有抗凍活性的物質(zhì)是蛋白。此后，人們相繼對(duì)極區(qū)魚(yú)類(lèi)、植物、昆蟲(chóng)、真菌和細(xì)菌中的抗凍蛋白進(jìn)行了研究。從現(xiàn)有的報(bào)道來(lái)看，魚(yú)類(lèi)抗凍蛋白的研究主要集中在分離純化、功能結(jié)構(gòu)特性等方面。由于動(dòng)植物自身存在的抗凍蛋白數(shù)量非常有限，采用傳統(tǒng)的分離提純方法從動(dòng)植物得到的抗凍蛋白數(shù)量十分有限，很難實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，難以在農(nóng)業(yè)，生物及醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
[0004]抗凍蛋白的抗凍活性片段主要存在于局部的特異多肽鏈結(jié)構(gòu)域，并不是整體蛋白質(zhì)在起作用(Evans, R.P.等.Biochimicaet Biophysica Acta(BBA)-Proteinsand Proteomics, 2004.1700 (2), 209-217.Fletcher, G.L.等.Annual Reviewof Physiology,2001.63,359-390.Low, ff.K.等.Journal of Biological Chemistry, 2001.276(15), 11582-11589.Wang, S.Y.等.Applied Mechanics andMaterials, 2012.140，411-`415)。國(guó)內(nèi)已有從小麥、沙冬青、牛皮、豬皮、昆蟲(chóng)中提取制備抗凍蛋白的相關(guān)專(zhuān)利申請(qǐng)(如 CN200610166427.4，CN201010277569.4，CN200810072986.8，CN201110091198.5，CN201010292036.3)，其中專(zhuān)利申請(qǐng)《一種魚(yú)源抗凍多肽及其制備方法》(申請(qǐng)?zhí)枮?CN201310441149.9)公開(kāi)了以魚(yú)皮膠原蛋白為原料，通過(guò)木瓜蛋白酶酶解，再經(jīng)過(guò)分離純化得到純化的特異性抗凍多肽。國(guó)外方面，歐洲專(zhuān)利EP9301969W公開(kāi)了一種獲得抗凍蛋白基因的方法，并利用其在酵母中的表達(dá)生產(chǎn)抗凍蛋白多肽，而含有抗凍多肽的酵母可以用在冷凍面團(tuán)等的生產(chǎn)中。日本專(zhuān)利JP2003142850公開(kāi)了一些魚(yú)類(lèi)血中的抗凍蛋白以及它們的氨基酸序列和堿基序列。從上述可以看出，盡管目前有一系列的抗凍蛋白分離提取的方法，但是難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化的生產(chǎn)。
[0005]經(jīng)檢索，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)以魚(yú)皮為原料，通過(guò)對(duì)魚(yú)皮的超聲波預(yù)處理，利用復(fù)合蛋白酶酶解，再經(jīng)過(guò)與殼寡糖作用制備具有特定抗凍功能的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的在于提供一種基于殼寡糖修飾具有抗凍功能的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物。該魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物具有較好的微生物低溫保護(hù)作用。
[0007]本發(fā)明另一目的在于提供上述魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物的制備方法。[0008]本發(fā)明第三目的在于提供上述魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物的用途。
[0009]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0010]一種基于殼寡糖修飾具有抗凍功能的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物，按照如下方法制備:
[0011](I)、將冷凍魚(yú)皮在10~12°C下進(jìn)行解凍，然后用水將魚(yú)皮清洗干凈，再將魚(yú)皮打成漿，得魚(yú)皮漿；接著向魚(yú)皮漿中加入2.0~5.0倍魚(yú)皮漿重量的水，然后利用膠體磨將魚(yú)皮漿磨成魚(yú)皮漿液，再在3000~5000g下離心5~8分鐘，去掉上層脂肪，得去脂魚(yú)皮漿液；
[0012](2)、將去脂魚(yú)皮漿液用超聲波處理5~10分鐘；然后按照0.7~1.0%魚(yú)皮重量的重量百分比比例向經(jīng)過(guò)超聲波處理的魚(yú)皮漿液體中加入復(fù)合蛋白酶，在45~55°C、pH7.0~8.0條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)0.25~1.0小時(shí)，然后在85~90°C下保溫3~5分鐘，冷卻至室溫；再在3000~5000g條件下離心3~6分鐘，收集上清液；
[0013](3)、將步驟(2)所得的上清液通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，先用孔徑為8000道爾頓的陶瓷膜超濾，取濾過(guò)液，留取分子量小于8000道爾頓的多肽；再用孔徑為5000道爾頓的膜超濾，將分子量大于5000道爾頓的多肽截留，獲得分子量為5000~8000道爾頓的魚(yú)皮蛋白多肽；冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽粉；
[0014](4)、按照魚(yú)皮蛋白多肽粉和殼寡糖之間質(zhì)量比為5~7:1的比例將魚(yú)皮蛋白多肽粉和殼寡糖混合，然后溶解于水中，輕輕攪拌5~10分鐘，溶液最終濃度為12~15% (w/w);冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽-殼寡糖凍干粉；
[0015](5)、將魚(yú)皮蛋白多肽-殼寡糖凍干粉在65~75°C、相對(duì)濕度為76~79%條件下反應(yīng)12~15小時(shí)，得魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物。
[0016]上述魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物步驟(1)中所述的魚(yú)皮來(lái)自于河豚魚(yú)或鱈魚(yú)等。
[0017]上述魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物步驟(1)中所述的魚(yú)皮解凍的時(shí)間為5~10小時(shí)。
[0018]上述魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物步驟(2)中所述的超聲波的頻率為25~30kH。
[0019]上述魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物步驟(2)中所述的復(fù)合蛋白酶由風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶組成；其中風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶之間的質(zhì)量比為1:1~2。
[0020]上述魚(yú)皮蛋白多肽步驟(2)中所述的pH用lmol/L的NaOH或HCl來(lái)調(diào)節(jié)。
[0021]上述基于殼寡糖修飾具有抗凍功能的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟:
[0022](1)、將冷凍魚(yú)皮在10~12°C下進(jìn)行解凍，然后用水將魚(yú)皮清洗干凈，再將魚(yú)皮打成漿，得魚(yú)皮漿；接著向魚(yú)皮漿中加入2.0~5.0倍魚(yú)皮漿重量的水，然后利用膠體磨將魚(yú)皮漿磨成魚(yú)皮漿液，再在3000~5000g下離心5~8分鐘，去掉上層脂肪，得去脂魚(yú)皮漿液；
[0023](2)、將去脂魚(yú)皮漿液用超聲波處理5~10分鐘；然后按照0.7~1.0%魚(yú)皮重量的重量百分比比例向經(jīng)過(guò)超聲波處理的魚(yú)皮漿液體中加入復(fù)合蛋白酶，在45~55°C、pH7.0~8.0條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)0.25~1.0小時(shí)，然后在85~90°C下保溫3~5分鐘，冷卻至室溫；再在3000~5000g條件下離心3~6分鐘，收集上清液；
[0024](3)、將步驟(2)所得的上清液通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，先用孔徑為8000道爾頓的陶瓷膜超濾，取濾過(guò)液，留取分子量小于8000道爾頓的多肽；再用孔徑為5000道爾頓的膜超濾，將分子量大于5000道爾頓的多肽截留，獲得分子量為5000~8000道爾頓的魚(yú)皮蛋白多肽；冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽粉；
[0025](4)、按照魚(yú)皮蛋白多肽粉和殼寡糖之間質(zhì)量比為5~7:1的比例將魚(yú)皮蛋白多肽粉和殼寡糖混合，然后溶解于水中，輕輕攪拌5~10分鐘，溶液最終濃度為12~15% (w/w);冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽-殼寡糖凍干粉；
[0026](5)、將魚(yú)皮蛋白多肽-殼寡糖凍干粉在65~75°C、相對(duì)濕度為76~79%條件下反應(yīng)12~15小時(shí)，得魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物。
[0027]上述制備方法步驟(1)中所述的魚(yú)皮來(lái)自于河豚魚(yú)或鱈魚(yú)等。
[0028]上述制備方法步驟(1)中所述的魚(yú)皮解凍的時(shí)間為5~10小時(shí)。
[0029]上述制備方法步驟(2)中所述的超聲波的頻率為25~30kH。
[0030]上述制備方法步驟(2)中所述的復(fù)合蛋白酶由風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶組成；其中風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶之間的質(zhì)量比為1:1~2。
[0031]上述制備方法步驟(2)中所述的pH用lmol/L的NaOH或HCl來(lái)調(diào)節(jié)。
[0032]上述基于殼寡糖修飾具有抗凍功能的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物在微生物抗凍保護(hù)上的應(yīng)用。
[0033]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果:(I)、本發(fā)明基于殼寡糖修飾的魚(yú)皮蛋白多肽抗凍功能好，可以將冷凍干燥微生物的活率提高60%。(2)、本發(fā)明采用復(fù)合蛋白酶酶解，獲得特定分子量的多肽與殼寡糖結(jié)合。(3)、本發(fā)明制備具有特定抗凍功能的魚(yú)皮蛋白多肽-殼寡糖，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。(4)、本發(fā)明利用頻率為25-30kH超聲波技術(shù)處理魚(yú)皮蛋白漿，魚(yú)皮蛋白多肽的得率高。(5)、本發(fā)明采用反應(yīng)溫度較低，反應(yīng)時(shí)間較短，安全性好。(6)、本發(fā)明魚(yú)皮蛋 白多肽復(fù)合物，具有較好的風(fēng)味，可以改善冰淇淋的組織結(jié)構(gòu)。
(7)、本發(fā)明以水產(chǎn)品加工的副產(chǎn)物魚(yú)皮為原料，不僅原料成本低，而且減少了魚(yú)皮作為廢物處理的能源消耗和勞動(dòng)力。
【具體實(shí)施方式】
[0034]實(shí)施例1基于殼寡糖修飾具有抗凍功能的河豚魚(yú)魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物的制備
[0035]按照如下方法進(jìn)行:
[0036](I)、將冷凍河豚魚(yú)魚(yú)皮100克在12°C下進(jìn)行解凍5小時(shí)，然后用水將魚(yú)皮清洗干凈，再用打漿機(jī)將魚(yú)皮打成漿，得魚(yú)皮漿；接著向魚(yú)皮漿中加入5.0倍魚(yú)皮漿重量的水500克，然后利用膠體磨將魚(yú)皮漿磨成魚(yú)皮漿液，再在5000g下離心5min，去掉上層脂肪，得去脂魚(yú)皮漿液552克。
[0037](2)、將去脂魚(yú)皮漿液于超聲波發(fā)生器中，用頻率為25kH的超聲波處理IOminji變魚(yú)皮蛋白的組織結(jié)構(gòu)；然后按照1.0%魚(yú)皮重量的重量百分比比例向經(jīng)過(guò)超聲波處理的魚(yú)皮衆(zhòng)液中加入復(fù)合蛋白酶(復(fù)合蛋白酶由風(fēng)味蛋白酶(購(gòu)自Novozymes,以下同)和中性蛋白酶(購(gòu)自北京東華強(qiáng)盛生物技術(shù)有限公司，以下同)組成，它們之間的質(zhì)量比為1:1)1.0克，在55°C、pH7.5 (用lmol/L的NaOH或HCl來(lái)調(diào)節(jié))條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0小時(shí)，在90°C下保溫3分鐘，冷卻至室溫，再在3000g條件下離心6分鐘，收集上清液470克。
[0038](3)、將步驟(2)所得的上清液通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，先用孔徑為8000道爾頓的陶瓷膜超濾，留取分子量小于8000的多肽，再用孔徑為5000道爾頓的膜將分子量大于5000道爾頓的蛋白截留，獲得分子量為5000-8000道爾頓的魚(yú)皮蛋白多肽；冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽粉6.8克。
[0039](4)、將魚(yú)皮蛋白多肽粉6.8克和殼寡糖(青島海德貝公司)1.2克混合均勻，然后溶解于水中，輕輕攪拌10分鐘，溶液最終濃度為15%(w/w);冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽-殼寡糖凍干粉8.9克。
[0040](5)、將所得的魚(yú)皮蛋白多肽-殼寡糖凍干粉在溫度為75°C、空氣相對(duì)濕度為79%條件下反應(yīng)12h，得基于殼寡糖修飾的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物8.8克。
[0041]實(shí)施例2基于殼寡糖修飾具有抗凍功能的鱈魚(yú)魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物的制備
[0042]按照如下方法進(jìn)行:
[0043](I)、將冷凍鱈魚(yú)魚(yú)皮200克在12°C進(jìn)行解凍7小時(shí)，然后用水將魚(yú)皮清洗干凈，再用打漿機(jī)將魚(yú)皮打成漿，得魚(yú)皮漿。接著向魚(yú)皮漿中加入4.0倍魚(yú)皮漿重量的水800克，然后利用膠體磨將魚(yú)皮漿磨成魚(yú)皮漿液，再在4000g下離心7分鐘，去掉上層脂肪，得去脂魚(yú)皮漿液962克。
[0044](2)、將步驟(1)所得的去脂魚(yú)皮漿液于超聲波發(fā)生器中，經(jīng)頻率為30kH超聲波處理6分鐘，改變魚(yú)皮蛋白的組織結(jié)構(gòu)。按照0.7%魚(yú)皮重量的重量百分比比例向經(jīng)過(guò)超聲波處理的魚(yú)皮漿液中加入復(fù)合蛋白酶(風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為I:2) 1.4克，在501:、？!18.0(用lmol/L的NaOH或HCl來(lái)調(diào)節(jié))條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)0.5小時(shí)，然后在90°C下保溫3分鐘，冷卻至室溫；在4000g條件下離心5分鐘，收集上清液850克。
[0045](3)、將步驟(2)所得的上清液通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，先用孔徑為8000道爾頓的陶瓷膜超濾，取濾過(guò)液，留取分子量小于8000道爾頓的多肽，再用孔徑為5000道爾頓的膜將分子量大于5000道爾頓的多肽截留，獲得分子量為5000~8000道爾頓的魚(yú)皮蛋白多肽；冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽粉13.8g。
[0046](4)、將魚(yú)皮蛋白多肽粉13.8g和殼寡糖2.0g混合均勻，得魚(yú)皮蛋白多肽粉和殼寡糖的混合物；然后溶解于水中，輕輕攪拌lOmin，溶液最終濃度為13%(w/w);冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽-殼寡糖凍干粉15.7g。
[0047](5)、將所得的魚(yú)皮蛋白多肽-殼寡糖凍干粉在70°C、空氣相對(duì)濕度為79%條件下反應(yīng)13小時(shí)，得魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物15.5克。
[0048]實(shí)施例3基于殼寡糖修飾具有抗凍功能的河豚魚(yú)魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物的制備
[0049]按照如下方法進(jìn)行:
[0050](I)、將冷凍河豚魚(yú)魚(yú)皮300克在12 °C進(jìn)行解凍9小時(shí)，然后用水將魚(yú)皮清洗干凈，再用打漿機(jī)將魚(yú)皮打成漿，得魚(yú)皮漿；接著向魚(yú)皮漿中加入3.0倍魚(yú)皮漿重量的水900克，然后利用膠體磨將魚(yú)皮漿磨成魚(yú)皮漿液，再在4000g下離心8分鐘，去掉上層脂肪，得去脂魚(yú)皮漿液1122克。
[0051 ] (2 )、將將步驟(1)所得的去脂魚(yú)皮漿液于超聲波發(fā)生器中，經(jīng)頻率為25kH超聲波處理8分鐘，改變魚(yú)皮蛋白的組織結(jié)構(gòu)；然后按照0.80%魚(yú)皮重量的重量百分比比例向經(jīng)過(guò)超聲波處理的魚(yú)皮漿液體中加入復(fù)合蛋白酶(風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為1:2)2.4克，在45°C、pH7.5(用lmol/L的NaOH或HCl來(lái)調(diào)節(jié))條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)0.25小時(shí)，然后在85°C下保溫5分鐘，冷卻至室溫；在3000g條件下離心6min，收集上清液920克；[0052](3)、將步驟(2)所得的上清液通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，先用孔徑為8000道爾頓的陶瓷膜超濾，取濾過(guò)液，留取分子量小于8000道爾頓的多肽，再用孔徑為5000道爾頓的膜將分子量大于5000道爾頓的多肽截留，獲得分子量為5000~8000道爾頓的魚(yú)皮蛋白多肽；冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽粉20.5克。
[0053](4)、將魚(yú)皮蛋白多肽粉20.5克和殼寡糖3.5克混合均勻，得魚(yú)皮蛋白多肽粉和殼寡糖的混合物；然后溶解于水中，輕輕攪拌8分鐘，溶液最終濃度為13% (w/w);冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽-殼寡糖凍干粉23.9克；
[0054](5)、將所得的魚(yú)皮蛋白多肽-殼寡糖凍干粉在65°C、相對(duì)濕度為78%條件下反應(yīng)15小時(shí)，得魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物23.7克。
[0055]實(shí)施例4本發(fā)明魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物對(duì)微生物抗凍保護(hù)對(duì)比試驗(yàn)
[0056]按照如下方法進(jìn)行:
[0057]試驗(yàn)處理:A.空白對(duì)照；B.殼寡糖；C.未進(jìn)行糖基化修飾的魚(yú)皮蛋白多肽；D.實(shí)施例I制備的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物；E.實(shí)施例2制備的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物；F.實(shí)施例3制備的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物。
[0058]將離心濃縮后的保加利亞乳桿菌(來(lái)源中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，編號(hào):S_5)分別添加不同凍干保護(hù)劑后(見(jiàn)處理B-F)(菌體與凍干保護(hù)劑的比例為4:1 (v/v)，置于-40°C的凍干機(jī)中，待菌液凍結(jié)后，于0.01mbar的真空度下冷凍干燥48小時(shí)，然后在適當(dāng)條件下復(fù)水，測(cè)定菌
體存活率。
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種基于殼寡糖修飾具有抗凍功能的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物，其特征在于按照如下方法制備: (1)、將冷凍魚(yú)皮在10~12°C下進(jìn)行解凍，然后用水將魚(yú)皮清洗干凈，再將魚(yú)皮打成漿，得魚(yú)皮漿；接著向魚(yú)皮漿中加入2.0~5.0倍魚(yú)皮漿重量的水，然后利用膠體磨將魚(yú)皮漿磨成魚(yú)皮漿液，再在3000~5000g下離心5~8分鐘，去掉上層脂肪，得去脂魚(yú)皮漿液； (2)、將去脂魚(yú)皮漿液用超聲波處理5~10分鐘；然后按照0.7~1.0%魚(yú)皮重量的重量百分比比例向經(jīng)過(guò)超聲波處理的魚(yú)皮漿液體中加入復(fù)合蛋白酶，在45~55°C、pH7.0~`8.0條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)0.25~1.0小時(shí)，然后在85~90°C下保溫3~5分鐘，冷卻至室溫；再在3000~5000g條件下離心3~6分鐘，收集上清液； (3)、將步驟(2)所得的上清液通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，先用孔徑為8000道爾頓的陶瓷膜超濾，取濾過(guò)液，留取分子量小于8000道爾頓的多肽；再用孔徑為5000道爾頓的膜超濾，將分子量大于5000道爾頓的多肽截留，獲得分子量為5000~8000道爾頓的魚(yú)皮蛋白多肽；冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽粉； (4)、按照魚(yú)皮蛋白多肽粉和殼寡糖之間質(zhì)量比為5~7:1的比例將魚(yú)皮蛋白多肽粉和殼寡糖混合，然后溶解于水中，輕輕攪拌5~10分鐘,溶液最終濃度為12~15% (w/w);冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽-殼寡糖凍干粉； (5)、將魚(yú)皮蛋白多肽-殼寡糖凍干粉在65~75°C、相對(duì)濕度為76~79%條件下反應(yīng)`12~15小時(shí)，得魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物。
2.按照權(quán)利要求1所述的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物，其特征在于其步驟(1)中所述的魚(yú)皮來(lái)自于河豚魚(yú)或鱈魚(yú)。
3.按照權(quán)利要求1所述的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物，其特征在于其步驟(1)中所述的魚(yú)皮解凍的時(shí)間為5~10小時(shí)。
4.按照權(quán)利要求1所述的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物，其特征在于其步驟(2)中所述的超聲波的頻率為25~30kH。
5.按照權(quán)利要求1所述的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物，其特征在于其步驟(2)中所述的復(fù)合蛋白酶由風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶組成；其中風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶之間的質(zhì)量比為1:1 ~2。
6.權(quán)利要求1所述的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)、將冷凍魚(yú)皮在10~12°C下進(jìn)行解凍，然后用水將魚(yú)皮清洗干凈，再將魚(yú)皮打成漿，得魚(yú)皮漿；接著向魚(yú)皮漿中加入2.0~5.0倍魚(yú)皮漿重量的水，然后利用膠體磨將魚(yú)皮漿磨成魚(yú)皮漿液，再在3000~5000g下離心5~8分鐘，去掉上層脂肪，得去脂魚(yú)皮漿液； (2)、將去脂魚(yú)皮漿液用超聲波處理5~10分鐘；然后按照0.7~1.0%魚(yú)皮重量的重量百分比比例向經(jīng)過(guò)超聲波處理的魚(yú)皮漿液體中加入復(fù)合蛋白酶，在45~55°C、pH7.0~`8.0條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)0.25~1.0小時(shí)，然后在85~90°C下保溫3~5分鐘，冷卻至室溫；再在3000~5000g條件下離心3~6分鐘，收集上清液； (3)、將步驟(2)所得的上清液通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，先用孔徑為8000道爾頓的陶瓷膜超濾，取濾過(guò)液，留取分子量小于8000道爾頓的多肽；再用孔徑為5000道爾頓的膜超濾，將分子量大于5000道爾頓的多肽截留，獲得分子量為5000~8000道爾頓的魚(yú)皮蛋白多肽；冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽粉；(4)、按照魚(yú)皮蛋白多肽粉和殼寡糖之間質(zhì)量比為5~7:1的比例將魚(yú)皮蛋白多肽粉和殼寡糖混合，然后溶解于水中，輕輕攪拌5~10分鐘,溶液最終濃度為12~15% (w/w);冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽-殼寡糖凍干粉； (5)、將魚(yú)皮蛋白多肽-殼寡糖凍干粉在65~75°C、相對(duì)濕度為76~79%條件下反應(yīng)12~15h，得魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物。
7.按照權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于其步驟(1)中所述的魚(yú)皮來(lái)自于河豚魚(yú)或鱈魚(yú)。
8.按照權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于其步驟(1)中所述的魚(yú)皮解凍的時(shí)間為5~IOh ;所述的超聲波的頻率為25~30kH。
9.按照權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于其步驟(2)中所述的復(fù)合蛋白酶由風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶組成；其中風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶之間的質(zhì)量比為1:1~2。
10.權(quán)利要 求1~5任一所述的的魚(yú)皮蛋白多肽復(fù)合物在微生物抗凍保護(hù)上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/04GK103820516SQ201410078719
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月5日
【發(fā)明者】余訓(xùn)培 申請(qǐng)人:臺(tái)州天和水產(chǎn)食品有限公司