一種抗氧化多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抗氧化多肽及其制備方法,該方法以小球藻蛋白為原料,通過對酸性蛋白酶的酶解,分離純化得到特異性抗氧化多肽,其氨基酸全序列為:aetiglap。本發(fā)明消除了天然抗氧化劑所具有的缺陷并且消除了公眾對人工合成抗氧化劑的憂慮,為開發(fā)基于食品源的抗氧化多肽以及探索其在食品、醫(yī)學上的廣泛應用奠定基礎。
【專利說明】一種抗氧化多肽
【技術領域】
[0001]本發(fā)明提供了一種抗氧化多肽及其制備方法,屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]生物分子的氧化是一個自由基介導的過程,它會對食品和生物系統(tǒng)造成許多不利的影響。在好氧器官內,與動脈硬化、癌癥等多中疾病相關的游離自由基會不可避免地隨著氧代謝的過程而產生。在食品中,食品營養(yǎng)成分的氧化會產生過氧化物,其不僅會影響食品的營養(yǎng)價值,引起食品品質下降,嚴重的甚至還會導致攝入者的身體發(fā)生疾病。因此,尋找安全的抗氧化劑以抑制過氧化物產生一直是生化營養(yǎng)學的研究熱點。由于BHT、TBHQ等化學合成抗氧化劑比天然抗氧化劑具有更好的效果和更便宜的價格,因此其已經被廣泛應用于食品行業(yè)中。但是,目前有研究發(fā)現合成抗氧化劑對人體肝、脾、肺等器官具有蓄積性致癌作用,從而引起了人們對其安全性的擔憂,并且開始逐漸限制其在食品中的使用。于是人們把目光轉向天然抗氧化劑。α -生育酚是一種被最普遍使用的天然抗氧化劑,它能有效保持食品中油脂的穩(wěn)定性,但是卻不利于食品保存。因此,我們有必要尋找一種其它來源的安全的天然抗氧化劑。
[0003]多肽是分子結構介于氨基酸和蛋白質之間的一類化合物,使蛋白質具有一定的生理功能。在人類的生命活動中,肽在體內的消化吸收優(yōu)于游離的氨基酸,且有著區(qū)別于氨基酸的體內輸送體系。某些短肽在提供人體生長、發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質的同時,還能夠防病治病,調節(jié)人體機能,這些具有生物活性的多肽被稱為生物活性肽。研究發(fā)現,很多不同來源的多肽都具有抗氧化能力,如水解酪蛋白、大豆蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、油料種子蛋白、小麥醇溶蛋白和玉米蛋白等得到的多肽都具有一定的抗氧化性。
[0004]我國擁有豐富的微藻資源,但是由于資源利用率低,加工過程產生的下腳料浪費等原因造成資源浪費,甚至是環(huán)境污染。微藻中含有大量蛋白質,且其組成均衡,利用現代生物技術對蛋白質資源進行深加工,合理的選用酶類等,通過工藝優(yōu)化生物活性肽的產品得率將使得生物活性肽的研究具有`更廣闊的前景。
【發(fā)明內容】
[0005]本發(fā)明提供了一種抗氧化多肽及其制備方法,使抗氧化活性得以高效實現。
[0006]本發(fā)明采用如下技術方案:
一種抗氧化多肽,所述抗氧化多肽的氨基酸序列為:aetiglap。
[0007]—種抗氧化多肽的制備方法,以小球藻為原料提取蛋白,然后采用酸性蛋白酶對其進行酶解,分離純化、冷凍干燥得到抗氧化多肽。
[0008]所述酶解條件為:pH為3.0、溫度50°C、酶解時間為5h、酶-底物配比為3000U/g ;所述酶為酸性蛋白酶。
[0009]所述分離純化的手段包括超濾、SP-Sephadex C-25離子交換色譜、Sephadex G-50分子篩和RP-HPLC反相高效液相色譜。[0010]所述分離純化的具體步驟為:
(1)酶解產物首先利用分子量截留范圍為8000Da和3500Da的超濾膜對酶解產物進行超濾分尚,將其分為3個分子量范圍不同的組分,分別為分子量大于8000Da的組分、分子量介于3500Da和8000Da的組分、分子量小于3500Da的組分;
(2)收集具有最佳抗氧化活性的組分,再用SP-S^hadexC-25陽離子交換色譜進行分離,上樣后洗去未吸附組分,再以含O~0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH4.0乙酸-乙酸鈉緩沖液進行線性梯度洗脫,流速為0.5ml/min,在225nm下進行測量,測定各吸收峰對應的洗脫組分的抗氧化活性;
(3)收集具有最佳抗氧化活性的峰,再用S^hadexG_50凝膠色譜進行分離,洗脫液為去離子水,流速為0.5ml/min,在225nm下進行測量,測定各吸收峰對應的洗脫組分的抗氧化活性;
(4)收集具有最佳抗氧化活性的峰,再利RP-HPLC反相高效液相色譜進行進一步的分離,所用色譜柱為Gemini 5 μ C18,上樣量為100 μ L,流速為lml/min,檢測波長為215nm ;洗脫液自含體積比為10%乙腈和90%水的混合液開始,至體積比為90%乙腈和10%水的混合液結束,進行梯度洗脫,收集體積比為43 %乙腈和57 %水處的洗脫峰,得到本發(fā)明的高純度的抗氧化多肽;利用蛋白質固相序列分析儀鑒定多肽的氨基酸序列。
[0011]本發(fā)明立足于尋找一種天然高效的抗氧化劑,以來自于小球藻蛋白為出發(fā)點,通過酸性蛋白酶的切割條件控制,切割為具有特定的肽鏈長度和結構域組成的活性多肽,而使抗氧化活性得以高效地實現。
[0012]本發(fā)明改變了現有抗氧化劑的提取與運用的思路和方法,消除了人工合成抗氧化劑所可能引起的副作用,是一種天然抗氧化劑,可以取代傳統(tǒng)的合成抗氧化劑。并且本發(fā)明還改善了我國對微藻蛋白利用率偏低的情況,既可解決大量微藻資源的高效利用問題,又能解除消費者對抗氧化劑在食品安全方面的顧慮,對科技、經濟和食品業(yè)的發(fā)展將具有深遠的意義。`
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為抗氧化多肽的RP-HPLC圖譜;
圖2為純化的抗氧化多肽清除DPPH自由基的“量-效”關系曲線。
[0014]圖3為純化的抗氧化多肽清除ABTS自由基的“量-效”關系曲線。
[0015]圖4為純化的抗氧化多肽抑制Fe2+誘導卵黃脂蛋白多不飽和脂肪酸過氧化反應的“量-效”關系曲線。
【具體實施方式】
[0016]制備方法如下:
(I)小球藻蛋白的提取
本發(fā)明所采用的小球藻蛋白為異樣發(fā)酵獲得。
[0017]小球藻蛋白質提取工藝條件為:將小球藻清洗3-5次,超聲波(加入吐溫,濃度0.1%,)破碎,浸提。浸提pH為8.0,料液比為20:1 (重量比)。浸提時間6h,離心1000Og20分鐘,收集上清液,經過濾、濃縮和冷凍干燥后得到小球藻蛋白。(2)小球藻蛋白的酶解
酶購自上海生物試劑公司(中國.上海)。
[0018]采用酸性蛋白酶酶解小球藻蛋白,蛋白濃度為3011^/1111,酶解條件???!1為3.0、溫度50°C、酶解時間為5h、酶與底物比為(3000U/g),用2M HCl調節(jié)pH穩(wěn)定,水解5h后,沸水浴中滅酶15min,然后迅速冷卻至室溫,置于離心機中,以4000r/min離心15min,取上清液備用。
[0019](3)酶解產物的分離、純化
將得到的酶解產物利用分子量截留范圍為8000Da和3500Da的超濾膜對酶解產物進行超濾分尚,將其分為3個分子量范圍不同的組分,分別為分子量大于8000Da的組分、分子量介于3500Da和8000Da的組分、分子量小于3500Da的組分;收集具有最佳抗氧化活性的組分,再經過SP-Sephadex C-25陽離子交換色譜(長20cm,直徑1.6cm)進行分離,以含O~0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH4.0乙酸-乙酸鈉緩沖液進行線性梯度洗脫,流速為0.5ml/min ;收集具有最佳抗氧化活性的峰,再用Sephadex G-50 (長IOOcm,直徑2.6cm)凝膠色譜進行分離,洗脫液為去離子水,流速為0.5ml/min,洗脫峰在225nm下進行測量;收集具有最佳抗氧化活性的峰,利用RP-HPLC反相高效液相色譜進行再進一步的分離,所用色譜柱為Gemini 5 μ C18,上樣量為100 μ L,流速為lml/min,檢測波長為225nm。洗脫液自含10%乙腈和90%水(v/v)的混合液開始,至90%乙腈和10%水(v/v)的混合液結束,進行梯度洗脫,收集43 %乙腈和57 %水&八)處的洗脫峰,得到本發(fā)明的高純度的抗氧化多肽。
[0020](4)抗氧化多肽的氨 基酸序列測定
利用蛋白質固相序列分析儀(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer C0.MA, U.S.A)測定本發(fā)明的抗氧化多肽的氨基酸全序列為aetiglap。
[0021](5)抗氧化活性的測試
I) DPPH自由基清除能力的測定
利用DPPH (I, l-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl)自由基清除率測定法研究抗氧化多肽。配制濃度為I X 10_5mOl/L的DPPH乙醇溶液,避光保存。將2mL,0.1mM的DPPH無水乙醇溶液加入到含有2mL不同酶解樣品的潔凈試管中,混勻。室溫下放置30min后,于517nm處測定吸光度,吸光值越小,表明自由基清除能力越強。
[0022]清除率(%)=〔1-(A1- Aj)/A0) X 100%
式中,Atl為2 mL,0.1mM的DPPH無水乙醇溶液+2mL的樣品溶劑,空白對照.Α為2mL,0.1mM的DPPH無水乙醇溶液+2mL的樣品;A」為2mL的無水乙醇+2 mL的樣品。
[0023]2) ABTS自由基清除活性的測定
以去離子水將ABTS溶解,使ABTS濃度達到7mmol/L,加入過硫酸鉀,使過硫酸鉀的濃度為2.45 mmol/L。之后將該溶液在室溫下置于暗處過夜12~16h。將生成的ABTS自由基溶液用磷酸緩沖液(PBS,0.2 mol/L, pH 7.4)稀釋,使其在734nm下的吸光值為0.70。取
0.1ml酶解液與2.9ml ABTS自由基液混合,搖勻30s,暗處反應10 min,然后在734nm下測定反應液的吸光值。以蒸餾水代替水解液作空白。
[0024]清除率(%)=(A0- Aj)/A0X 100%
式中,Atl為2.9 mL ABTS試劑與0.1 mL蒸餾水混合液的吸光值;A」為2.9 mL ABTS試劑與0.1 mL酶解液混合液的吸光值。[0025]3)抗脂質體過氧化活性的測定
用等體積新鮮的雞蛋卵黃和磷酸緩沖液(pH7.4,0.lmol/L)混合,使用前稀釋25倍并用磁力攪拌機攪拌均勻。在試管中分別加入2.4ml卵黃稀釋液、2.4ml 25mmol/LFeSO4.H20,200 μ L水解液樣品,混勻后在37°C下水浴4h,加入0.8ml 50%三氯乙酸和2mlTBA,混勻后在95°C恒溫30min。冷卻至室溫后,8000r/min離心20min,取上清液于532nm下測定吸光值。以蒸餾水代替水解液作為空白。
[0026]抑制率(%)=( (A0- Aj)/A0) X 100%
式中,Atl為空自對照組的吸光度;Α]為樣品組的吸光度。
[0027]為了進一步了解本
【發(fā)明內容】
、特點及功效,茲例舉以下實施例:
實施例1
稱取7.5克小球藻蛋白用去離子水溶解并定容至250ml,然后用2mol/L HCl將其pH調節(jié)至3.0。先將該溶液水浴加熱到50°C,接著再按照酶-底物配比為3000U/g的比例加入相應量的酶,酶解時間為5小時。接著在沸水浴中滅酶15分鐘,冷卻后再4000rpm離心15分鐘。收集上清液備用。
[0028]將上清液用分子量截留范圍為8000Da和3500Da的超濾膜進行超濾分離,將其分為3個分子量范圍不同的組分,分別為分子量大于8000Da的組分、分子量介于3500Da和8000Da的組分、分子量小于3500Da的組分,并測定其抗氧化活性。分子量小于3500Da的組分具有最好的抗氧化活性。
[0029]收集分子量小于3500Da的組分,用SP-S^hadex C-25陽離子交換色譜(長20cm,直徑1.6cm)進行再進一步的分離,以含O~0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH4.0乙酸-乙酸鈉緩沖液進行線性梯度洗脫,流速為0.5`ml/min,洗脫峰在225nm下進行測量,收集各峰并測定抗氧化活性。
[0030]將分離出來的抗氧化活性最明顯的組分峰用S印adex G_50凝膠過濾色譜(長20cm,直徑1.6cm)再進行分離,洗脫液為去離子水,流速為0.5ml/min,洗脫峰在225nm下進行測量。收集各峰并測定抗氧化活性。
[0031]將分離出來的最好的抗氧化活性組分利用RP-HPLC反相高效液相色譜進行再進一步的分離,所用色譜柱為Gemini 5μ C18,上樣量為100 μ L,流速為lml/min,檢測波長為215nm。洗脫液自含10%乙腈和90%水(v/v)的混合液開始,至90%乙腈和10%水(v/v)的混合液結束,進行梯度洗脫,收集43 %乙腈和57 %水&八)處的洗脫峰,得到本發(fā)明的高純度的特異性抗氧化多肽,如圖1所示。B峰為該抗氧化多肽的色譜峰。得到高純度的抗氧化肽。
[0032]純化后的抗氧化多肽具有很強的抗氧化能力,由圖2、圖3和圖4可以看出,它具有較強的清除DPPH自由基、ABTS自由基以及抑制脂質過氧化反應的能力。
[0033]利用蛋白質固相測序儀(AppliedBiosystems Model 476A, Perkin Elmer C0.MA, U.S.A)測定純化后的抗氧化多肽的氨基酸序列。得到其氨基酸全序列為:aetiglap。
[0034]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例,凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾,皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權利要求】
1.一種抗氧化多肽,其特征在于:所述抗氧化多肽的氨基酸序列為:aetiglap。
2.一種如權利要求1所述的抗氧化多肽的制備方法,其特征在于:以小球藻為原料提取蛋白,然后采用酸性蛋白酶對其進行酶解,分離純化、冷凍干燥得到抗氧化多肽。
3.根據權利要求2所述的一種抗氧化多肽的制備方法,其特征在于:所述酶解條件為:pH為3.0、溫度50°C、酶解時間為5h、酶-底物配比為3000U/g ;所述酶為酸性蛋白酶。
4.根據權利要求2所述的一種抗氧化多肽的制備方法,其特征在于:所述分離純化的手段包括超濾、SP-Sephadex C-25離子交換色譜、Sephadex G-50分子篩和RP-HPLC反相高效液相色譜。
5.根據權利要求2所述的一種抗氧化多肽的制備方法,其特征在于:所述分離純化的具體步驟為: (1)酶解產物首先利用分子量截留范圍為8000Da和3500Da的超濾膜對酶解產物進行超濾分尚,將其分為3個分子量范圍不同的組分,分別為分子量大于8000Da的組分、分子量介于3500Da和8000Da的組分、分子量小于3500Da的組分; (2)收集具有最佳抗氧化活性的組分,再用SP-S^hadexC-25陽離子交換色譜進行分離,上樣后洗去未吸附組分,再以含O~0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH4.0乙酸-乙酸鈉緩沖液進行線性梯度洗脫,流速為0.5ml/min,在225nm下進行測量,測定各吸收峰對應的洗脫組分的抗氧化活性; (3)收集具有最佳抗氧化活性的峰,再用S^hadexG_50凝膠色譜進行分離,洗脫液為去離子水,流速為0.5ml/min,在225nm下進行測量,測定各吸收峰對應的洗脫組分的抗氧化活性; (4)收集具有最佳抗氧化活性的峰,再 利RP-HPLC反相高效液相色譜進行進一步的分離,所用色譜柱為Gemini 5 μ C18,上樣量為100 μ L,流速為lml/min,檢測波長為215nm ;洗脫液自含體積比為10%乙腈和90%水的混合液開始,至體積比為90%乙腈和10%水的混合液結束,進行梯度洗脫,收集體積比為43%乙腈和57%水處的洗脫峰,得到本發(fā)明的高純度的抗氧化多肽;利用蛋白質固相序列分析儀鑒定多肽的氨基酸序列。
【文檔編號】C12P21/06GK103880933SQ201410079022
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月6日 優(yōu)先權日:2014年3月6日
【發(fā)明者】汪少蕓, 吳金鴻, 蔡茜茜, 方衛(wèi)東, 趙立娜, 洪晶, 廖蘭 申請人:福州大學