一種dna分子克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種DNA分子克隆方法，制備在上、下游均具有5’單鏈末端的載體和目的基因；載體和目的基因的單鏈末端能互補(bǔ)配對(duì)，無(wú)需連接酶，即將載體和目的基因連接重組成閉合環(huán)狀DNA，然后直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增重組DNA。依賴連接酶的克隆方法簡(jiǎn)單高效，是克隆單個(gè)基因的常用方法，但該技術(shù)也存在明顯的不足，而本發(fā)明提供的方法不受序列限制、簡(jiǎn)便高速，而且重組準(zhǔn)確。
【專利說(shuō)明】—種DNA分子克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種DNA分子克隆方法，屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA的限制性內(nèi)切酶酶切和酶促連接反應(yīng)，作為基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)，是20世紀(jì)分子生物學(xué)方法的重要成就之一。在此基礎(chǔ)上，研究者利用PCR和定點(diǎn)突變等技術(shù)極大地拓展了重組DNA技術(shù)的應(yīng)用。
[0003]目前，分子克隆的方法多采用依賴連接酶(例如:T4 DNA連接酶、Τ7 DNA連接酶、Τ3DNA連接酶，等等)的克隆方法，此法是一種經(jīng)典的克隆方法，主要分為以下兩種類型:(1)粘性末端連接:即載體質(zhì)粒和待插入的外源片段都通過(guò)合適的限制性內(nèi)切酶切割，產(chǎn)生相互匹配的粘性末端，然后在連接酶作用下重新形成磷酸二酯鍵，從而得到環(huán)化的重組質(zhì)粒；
(2)平末端連接:平末端連接中，載體和片段均為平端，都沒(méi)有粘性末端突出。其優(yōu)點(diǎn)是步驟簡(jiǎn)單，不需要多次酶切，但是克隆效率較低，而且不能實(shí)現(xiàn)定向克隆。
[0004]總的來(lái)說(shuō)，依賴連接酶的克隆方法簡(jiǎn)單高效，是克隆單個(gè)基因的常用方法。但該技術(shù)也存在明顯的不足:一方面，插入片段要經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶處理，這樣在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)就要考慮目的基因的DNA序列，不能實(shí)現(xiàn)多基因的平行操作，不適合高通量；另一方面，該過(guò)程使用連接酶，不但延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)的周期，而且也會(huì)帶來(lái)載體自連的背景，增加了篩選工作量。而且，在很多情況下， 重組DNA技術(shù)的應(yīng)用都會(huì)受到基因序列中原有的酶切位點(diǎn)的限制，尤其是多基因片段的重組往往更容易受到限制酶酶切位點(diǎn)序列的限制，研究者不得不使用一些非常稀有的酶切位點(diǎn)，這就大大增加了 DNA重組的工作量和難度。因此，開(kāi)發(fā)一種不受序列限制、簡(jiǎn)便高速、而且重組準(zhǔn)確的新方法，就顯得尤其必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種DNA分子克隆方法，目前依賴連接酶的克隆方法簡(jiǎn)單高效，是克隆單個(gè)基因的常用方法，但該技術(shù)也存在明顯的不足，重組DNA技術(shù)的應(yīng)用會(huì)受到基因序列中原有的酶切位點(diǎn)的限制，尤其是多基因片段的重組往往更容易受到限制酶酶切位點(diǎn)序列的限制，因此本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種不受序列限制、簡(jiǎn)便高速、而且重組準(zhǔn)確的新方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種用于DNA分子克隆方法的目的基因及載體，所述目的基因上游的單鏈區(qū)如SEQ IDN0.1所示，與其互補(bǔ)配對(duì)的載體的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.2所示，或者目的基因上游的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.2所示，與其互補(bǔ)配對(duì)的載體的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.1所示；目的基因下游單鏈區(qū)如SEQ ID N0.3所示，與其互補(bǔ)配對(duì)的載體的單鏈區(qū)為如SEQ ID N0.4所示，或者目的基因下游單鏈區(qū)如SEQ ID N0.4所示，與其互補(bǔ)配對(duì)的載體的單鏈區(qū)為如SEQ ID N0.3所
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[0007]—種DNA分子克隆方法，制備在上、下游均具有5’單鏈末端的載體和目的基因；載體和目的基因的單鏈末端能夠互補(bǔ)配對(duì)，無(wú)需連接酶，在體外將載體和目的基因混合，二者的末端互補(bǔ)配對(duì)，連接重組成閉合環(huán)狀DNA，然后直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增重組DNA。
[0008]其包括T4 DNA polymerase 反應(yīng)液體系:回收產(chǎn)物 0.2pmol, IOX T4 DNApolymerase buffer 5 μ I, IOOmM dTTP 1.5μ 1,0.1% BSA 5 μ 1，(1(1!120補(bǔ)足至5(^ I ；70°C保溫5min,降溫到37?,加入Τ4 DNA polymerase I μ I,用移液器吸頭攪動(dòng)混合,不可劇烈振動(dòng)；37°C保溫IOmin，使用漩渦震蕩器震蕩，使酶滅活。
[0009]其無(wú)連接酶的連接反應(yīng)體系為載體3μ1，插入片段6μ1，步驟為混勻載體和插入片段，22°C保溫5min，再加入25mM EDTA 3 μ 1，22°C保溫5min，攪動(dòng)混勻，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于帶有氨芐青霉素抗性的LB平板上。
[0010]優(yōu)選地，當(dāng)所述目的基因上游的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.1所示，與其互補(bǔ)配對(duì)的載體的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.2所示時(shí)，目的基因與載體的密碼子框架對(duì)齊，如果載體是蛋白表達(dá)載體，則不影響蛋白表達(dá)；如SEQ ID N0.1所示的單鏈區(qū)用到了 GGC、CGC、GAA、CAG這4種密碼子，在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉等常見(jiàn)宿主菌中，它們均不是稀有密碼子；前文所述4段單鏈區(qū)的長(zhǎng)度適中，結(jié)合能力強(qiáng)。
[0011]上述4種密碼子在常見(jiàn)宿主菌中的出現(xiàn)頻率(每千個(gè)密碼子中出現(xiàn)頻數(shù)):
e.coli kl2 (大腸桿菌):
GGC 33.4
CGC 26.0
GAA 43.7
CAG 27.7
Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168 (枯草芽抱桿菌):
GGC 11.7
GGC 11.7
GAA 46.9
CAG 15.6
Aspergillus niger (黑曲霉):
GGC 22.5
CGC 15.9
GAA 24.8
CAG 24.2
上述統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)自于:Codon Usage Database。
[0012]SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 的結(jié)合區(qū) GC:AT=11:15，大于 73% ；SEQ ID N0.3 和SEQ ID N0.4 的結(jié)合區(qū) GC:AT=10:14，大于 71%。
[0013]使用RNAstructure軟件,分別分析前文所述4個(gè)單鏈區(qū)的DNA分子的最穩(wěn)定分子內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu):SEQ ID N0.1，僅有2個(gè)連續(xù)堿基形成分子內(nèi)配對(duì)，結(jié)合能為-0.8，結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖5;SEQ ID N0.2，僅有3個(gè)堿基形成分子內(nèi)配對(duì)，其中連續(xù)堿基2個(gè)，結(jié)合能為-4.1，結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖6;SEQ ID N0.3，單鏈區(qū)為直線型，無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)，沒(méi)有堿基形成分子內(nèi)配對(duì)，結(jié)合能為O;SEQ ID N0.4，僅有I個(gè)堿基形成分子內(nèi)配對(duì)，結(jié)合能為-1，結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖7。[0014]所有單鏈區(qū)的堿基序列，都經(jīng)過(guò)優(yōu)化優(yōu)選設(shè)計(jì)，在保證單鏈區(qū)高GC:AT比例的情況下，又盡可能避免分子內(nèi)堿基配對(duì)，避免形成單鏈區(qū)分子內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0015]單鏈區(qū)最穩(wěn)定的分子內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)，沒(méi)有出現(xiàn)大于或等于3個(gè)的連續(xù)GC配對(duì)。可以保證在連接反應(yīng)時(shí)，單鏈區(qū)以線性形式存在。繼而確保載體和目的基因分子間的高效連接。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
GC:AT值越高，意味著載體和目的基因單鏈區(qū)配對(duì)重組后的結(jié)合力越強(qiáng)。本專利設(shè)計(jì)的單鏈區(qū)具有70%以上的GC:AT值，高于任何已有的技術(shù)或者文獻(xiàn)報(bào)道。但是這個(gè)比值越高，意味著單鏈區(qū)分子內(nèi)部自身配對(duì)的概率和結(jié)合力也越大，若自身發(fā)生配對(duì)，將不會(huì)與互補(bǔ)鏈配對(duì)，嚴(yán)重影響連接。本專利設(shè)計(jì)的上述序列將能夠互補(bǔ)配對(duì)的G和C堿基在單鏈區(qū)有序地間隔開(kāi)，盡可能避免單鏈區(qū)分子內(nèi)配對(duì)。同時(shí)，后續(xù)的連接反應(yīng)實(shí)驗(yàn)步驟，也能有利于分子間(載體和目的基因)的配對(duì)，而不是分子內(nèi)配對(duì)。
[0017]如果載體是蛋白表達(dá)載體，那么，目的基因上游單鏈區(qū)起到連接目的基因和載體表達(dá)框架的作用，單鏈區(qū)DNA序列也會(huì)最終翻譯成蛋白序列中的一段短肽。當(dāng)目的基因上游的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.1所示，與其互補(bǔ)配對(duì)的載體的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.2所示時(shí)，單鏈區(qū)與載體表達(dá)框架對(duì)齊，這段單鏈區(qū)用到了 GGC、CGC、GAA、CAG這4種密碼子，在常見(jiàn)的表達(dá)宿主中，都是常見(jiàn)密碼子，非稀有密碼子。所翻譯的短肽，不會(huì)影響目的蛋白的活性。
[0018]使用上述互補(bǔ)配對(duì)的單鏈末端，在無(wú)需連接酶存在的情況下，可以實(shí)現(xiàn)目的基因和載體的連接，能夠獲得不低于80%的陽(yáng)性重組克隆，市面上其它同類技術(shù)或產(chǎn)品無(wú)法達(dá)到此效果。如果載體是蛋白表達(dá)載體，則本發(fā)明能夠使插入基因?qū)?yīng)的目的蛋白順利表達(dá)。
[0019]與現(xiàn)有的連接技術(shù)相比，本發(fā)明提高了重組克隆中的陽(yáng)性概率，減少了分子克隆實(shí)驗(yàn)所需的時(shí)間，簡(jiǎn)化了流程，本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比有顯著進(jìn)步。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。其中，左側(cè)泳道是DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，右側(cè)是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0021]圖2菌落PCR驗(yàn)證電泳圖。其中左側(cè)marker泳道是DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1#和2#均為平板上隨機(jī)挑取的重組子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0022]圖3菌落PCR驗(yàn)證電泳圖。最左側(cè)泳道是DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，其余各泳道均為隨機(jī)挑取的各個(gè)單克隆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖4 SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)；其中I為實(shí)驗(yàn)組，2為對(duì)照組，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組在蛋白marker的116KDa和97.2KDa這個(gè)區(qū)間，有一條很濃的蛋白條帶，而對(duì)照組沒(méi)有，可以判定目的蛋白成功表達(dá)。
[0023]圖5 SEQ ID N0.1 二級(jí)結(jié)構(gòu)圖。
[0024]圖6 SEQ ID N0.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)圖。
[0025]圖7 SEQ ID N0.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)施例1
以pTwinl載體(本實(shí)驗(yàn)室保存，原 始來(lái)源是neb公司)為例，根據(jù)其DNA序列，設(shè)計(jì)以下2條PCR引物:
載體上游引物:5 ’ CCGAGCTCCGGGCTTCTCCTCATTGTGGCAGCTTCAATGACTGCAG 3，，
載體下游引物:5’ CCGAGCTCTGCTGTTCGCGGCCATTGTGTACAATGATGTCATTCGC 3’。
[0027]引物的5’端設(shè)計(jì)有Sac I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，如下劃線所示，并帶有保護(hù)堿基。Sac I酶切位點(diǎn)是優(yōu)選設(shè)計(jì)的，載體內(nèi)部沒(méi)有這個(gè)酶切位點(diǎn)，同時(shí)，酶切后，載體能形成3’單鏈末端,能夠讓后續(xù)的T4 DNA polymerase攻擊切除多余序列。最終形成所需的5’單鏈末端序列。
[0028]使用Toyobo公司的KOD plus neo酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0029]PCR 反應(yīng)液:10X PCR buffer for KOD-plus-neo:5 μ I, 2mM dNTPs 5 μ I, 25mMMgSO4 3 μ I,引物:上下游各 1.5 μ I,模板:50ng, KOD-plus-neo (IU/ μ I):1 μ I, ddH20:upto 50 μ I。
[0030]PCR 循環(huán)條件:94°C，2min ;(98°C、10s，57°C、30s，68t:、4min)X 30 cycles ；68°C7min ；4°C End。
[0031 ] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)圖1。
[0032]對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)目的條帶割膠，采用上海生工SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行DNA回收(按照試劑盒說(shuō)明書操作)。
[0033]回收產(chǎn)物使用Thermo Scientific FastDigest SacI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理。
[0034]酶切反應(yīng)液:10XFastDigest Buffer 2μ I, DNA 回收產(chǎn)物 2 μ g, FastDigestSacI I μ I, ddH20 up to 30 μ I。
[0035]酶切步驟:混勻酶切反應(yīng)液，于37°C反應(yīng)I小時(shí)，之后置于65°C熱擊5分鐘，使酶失活。
[0036]酶切產(chǎn)物使用上海生工SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，回收產(chǎn)物(按照試劑盒說(shuō)明書操作)。
[0037]酶切回收產(chǎn)物使用NEB公司快速連接試劑盒進(jìn)行DNA連接，連接產(chǎn)物直接42°C熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-blue化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于帶有氨芐抗生素的LB瓊脂平板。
[0038]上述平板在37°C過(guò)夜培養(yǎng)后，在平板上挑取大腸桿菌單菌落，使用菌落PCR驗(yàn)證重組質(zhì)粒是否正確(所使用引物為T7通用上游引物和下游引物)。正確的重組子將能擴(kuò)增出約900bp的DNA片段。電泳圖見(jiàn)圖2。
[0039]將上圖2中1#樣品，使用T7通用上游引物，Sanger法(ABI測(cè)序儀)進(jìn)行DNA測(cè)序，序列如下:
【權(quán)利要求】
1.一種用于DNA分子克隆方法的目的基因及載體，其特征在于:所述目的基因上游的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.1所示，與其互補(bǔ)配對(duì)的載體的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.2所示，或者目的基因上游的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.2所示，與其互補(bǔ)配對(duì)的載體的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.1所示；目的基因下游單鏈區(qū)如SEQ ID N0.3所示，與其互補(bǔ)配對(duì)的載體的單鏈區(qū)為如SEQ IDN0.4所示，或者目的基因下游單鏈區(qū)如SEQ ID N0.4所示，與其互補(bǔ)配對(duì)的載體的單鏈區(qū)為如 SEQ ID N0.3 所示。
2.—種DNA分子克隆方法，其特征在于:制備在上、下游均具有5’單鏈末端的載體和目的基因；載體和目的基因的單鏈末端能夠互補(bǔ)配對(duì)，無(wú)需連接酶，在體外將載體和目的基因混合，二者的末端互補(bǔ)配對(duì)，連接重組成閉合環(huán)狀DNA，然后直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增重組DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種DNA分子克隆方法，其特征在于:其包括T4DNApolymerase 反應(yīng)液體系:回收產(chǎn)物 0.2pmol,10X T4 DNA polymerase buffer 5 μ I, IOOmMdTTP 1.5μ 1,0.1% BSA 5 μ 1，ddH20 補(bǔ)足至 50 μ I ;70°C 保溫 5min,降溫到 37°C，加入 T4DNA polymerase I μ I,用移液器吸頭攪動(dòng)混合,不可劇烈振動(dòng)；37°C保溫IOmin ,使用鏇潤(rùn)震蕩器震蕩，使酶滅活。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種DNA分子克隆方法，其特征在于:其無(wú)連接酶的連接反應(yīng)體系為載體3μ1，插入片段6 4 1，步驟為混勻載體和插入片段，221:保溫51^11，再加入25mM EDTA 3 μ 1，22°C保溫5min，攪動(dòng)混勻，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于帶有氨芐青霉素抗性的LB平板上。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103805600SQ201410080024
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】林峻 申請(qǐng)人:福州大學(xué)